Generazione di topi transgenici per uso topico In utero Elettroporazione e In vivo Screening bioluminescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di selezionare con successo i wrap-up elettroporati in utero per ulteriori analisi. Ciò si ottiene iniettando prima il DNA bersaglio e quindi eseguendo un'elettroporazione in utero per l'area selezionata all'interno del cervello. Gli embrioni elettroporati si sviluppano all'interno dell'utero materno e nascono normalmente vivi.

L'imaging 2D viene utilizzato per identificare con successo gli animali elettroporati in punti temporali postnatali definiti. Infine, l'area interessata è caratterizzata in modo più dettagliato dall'imaging 3D. In definitiva, questi ratti transgenici topici possono essere utilizzati nei test comportamentali per mostrare le conseguenze di un neurosviluppo disturbato sul comportamento adulto.

Sebbene l'elettroporazione sia una tecnica consolidata, non è stata ampiamente utilizzata per la generazione di animali adulti transgenici topici. Ciò è in parte dovuto alle competenze tecniche richieste, ma anche alla nostra attuale incapacità di selezionare solo per i cuccioli appena nati elettroporati di successo. Presentiamo una soluzione a questo problema utilizzando l'imaging a bioluminescenza in vivo dal vivo per consentire il successo dell'imaging dell'essenza del bios in vivo di un elettroratto neutro.

Il gene riportato dai raggi di Lucifero è coelettroporosa. Il rilevamento della luminescenza può essere attivato mediante iniezione luciferina per monitorare la posizione approssimativa delle celle nominali. Ciò consente quindi di selezionare con successo i pop rossi elettroporati.

Per cominciare, raccogli i materiali sterili necessari per l'elettroporazione in utero. Successivamente, preparare la soluzione di DNA che contiene il vettore D-N-A-G-F-P target, il vettore luciferasi e il colorante verde veloce. Sotto ISO anestesia al fluoro esporre l'utero per visualizzare l'embrione da iniettare.

Utilizzando un ago di vetro sottile, iniettare la soluzione di DNA in uno dei ventricoli laterali dell'embrione. Per colpire una popolazione cellulare di strati corticali superiori, posizionare un elettrodo di sette millimetri attorno alla testa dell'embrione e posizionare l'elettrodo positivo sopra il ventricolo con una leggera tendenza laterale dorsale. Eseguire l'elettroporazione con un'elettroporazione a impulsi a onda quadra premendo il pedale per colpire le cellule dell'ippocampo.

Posizionare l'elettrodo positivo sul lato opposto del ventricolo iniettato. Prima di essere elettroporato, diluire prima il sale sodico Lucifer in PBS a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e sterilizzarlo mediante filtrazione sterile. Dopo la pesatura, tieni un cucciolo con l'addome sollevato e leggermente allungato prima di iniettare il Lucifero per iniziare la procedura di imaging.

I cuccioli iniettati con Lucifer vengono anestetizzati e posti in posizione prona all'interno del dispositivo dello spettro Ivis. Le prime immagini di bioluminescenza 2D sono necessarie per determinare quali cuccioli sono stati elettroporati con successo lavorando nel pannello di controllo dell'acquisizione Ivis, selezionare la modalità di imaging bioluminescente per scattare foto dall'alto all'inizio della misurazione. Controllare l'impostazione della fotografia e impostare il binning su medio e l'F-stop su otto selezionare Usa altezza soggetto sotto l'impostazione di messa a fuoco.

Quindi, impostare il filtro di eccitazione in modo che blocchi l'apertura del filtro di emissione e il binning su fluido. L'F-stop deve essere impostato su uno e il livello del tavolino o il campo visivo è impostato su un'immagine 2D di acquisizione A. Con un tempo di esposizione alla luminescenza di 180 secondi, le aree elettroporate dei cuccioli positivi vengono quindi ulteriormente studiate scattando immagini 3D seguendo le impostazioni per la luciferasi delle lucciole.

Innanzitutto, verificare che l'opzione fotografia sia selezionata per acquisire una foto dall'alto all'inizio dell'imaging. Per scansionare la superficie dell'animale prima della misurazione della bioluminescenza, selezionare l'opzione di struttura per cuccioli fino a due settimane di età. I seguenti filtri di emissione e tempi di esposizione sono selezionati a causa della diminuzione della potenza del segnale negli animali più anziani, il tempo di esposizione è aumentato per i tre migliori filtri di emissione nei ratti di età superiore a P 20.

Quindi, impostare il livello del palco in modo che sia il benning su medio e lo stop F su uno e acquisire l'immagine 3D. Dopo l'imaging, contrassegnare i ratti con fori per le orecchie distinti per differenziarli l'uno dall'altro e per abbinarli alle immagini di imaging dal vivo di Ivis. Infine, rimuovere l'animale su una superficie riscaldata fino a quando non si sarà completamente ripreso.

Le immagini 3D vengono generate utilizzando il software di immagini viventi preinstallato sul sistema di spettro Ivis. Il primo passo è quello di ricostruire la topografia della superficie. Per fare ciò, ritaglia una regione di interesse e imposta la soglia tra il 20 e il 30%Avvia la ricostruzione 3D DLIT per il tessuto cerebrale con una soglia dell'immagine del 10% per ogni impostazione della lunghezza d'onda.

Per creare filmati 3D, selezionare il pulsante Anima Nella barra degli strumenti 3D, manipolare l'orientamento e lo zoom dell'immagine 3D come desiderato. Quindi, premere il pulsante di registrazione per tenere traccia del passaggio da una posizione o orientamento a un'altra. In questi esempi, i ratti P sette sottoposti a imaging dopo un'iniezione luciferina hanno mostrato nessun segnale di luminescenza, un segnale debole o un forte segnale di luminescenza a seconda del successo dell'elettroporazione.

Queste immagini mostrano una sequenza temporale di misurazioni consecutive della bioluminescenza nello stesso ratto, dimostrando una lunga finestra di rilevamento. Qui le immagini 2D mostrano l'elettroporazione riuscita nella corteccia o nell'ippocampo. Le aree mirate vengono ulteriormente visualizzate utilizzando l'imaging 3D in animali elettroporati sia corticalmente che ippocampali.

Questo video mostra l'area elettroporata con successo da più prospettive. In questo esempio, le posizioni target identificate dall'imaging 2D e 3D nell'animale vivo sono ulteriormente convalidate attraverso la bioluminescenza e il rilevamento dell'epifluorescenza GFP nel cervello sezionato. Questa immagine presa dallo stesso cervello di ratto elettroporato con successo mostra una vista dettagliata delle cellule che esprimono GFP a P 14 Se eseguita correttamente.

Questo metodo consente lo studio delle conseguenze comportamentali e neuropatologiche dei difetti dello sviluppo neurologico. La selezione di soli ratti con successo con classificazione elettrolitica riduce notevolmente i costi e lo sforzo. Il successo con questa tecnica richiede pratica e ha tassi di motilità ed efficacia variabili.

L'immunoistologia dell'elettro GFP centrale è importante per documentare l'esatta area di trasfezione a risoluzioni anatomiche per la correzione post-hoc dei risultati comportamentali.