Name: In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri l'imaging a due fotoni in vivo per tracciare i cambiamenti molecolari dipendenti dall'esperienza nei neuroni corticali. Questo metodo utilizza reporter geneticamente codificati per studiare l'espressione di ARC.

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Gli autori desiderano ringraziare L. Belluscio per le apparecchiature per la chirurgia riprese, D. Kwon per le riprese di assistenza, K. Liu per il video editing di assistenza, e K. MacLeod per tutta la musica di sottofondo. KW riconosce il generoso sostegno della Divisione NIMH dei programmi di ricerca intramurale e le Geni, Cognizione e Programma psicosi. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale NIMH (VC, YY, SMKW) e la Divisione di NIAAA Intramural programma di ricerca clinica e biologica (VC, RMC, DML).

Le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal National Institute of Mental Cura la salute degli animali e del Comitato uso ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura ed uso di animali da laboratorio. 1. Preparazione pre-operatoria <ol><li> Pulire tutti gli strumenti in autoclave a caldo tallone prima dell&#39;intervento chirurgico asettico, pulire il sito chirurgico con il 70% di etanolo, e mettere giù teli puliti. Indossare guanti sterili. Anestetizzare l&#39;animale con una soluzione preparata 1,2% avertin, dato a 0,02 ml / g, intraperitonially. In alternativa, anestetizzare con gas isoflurano attraverso un cono, 5% per induzione, 1,5% per la manutenzione, con un circuito passivo scavenger. Controllare il livello di anestesia con pizzichi di coda o del piede per garantire la sedazione completa. </li><li> Coprire gli occhi dell&#39;animale con pomata oftalmica sterile, e iniettare desametasone preparata (0,2 mg / kg) e carprofen (5 mg / kg) subcutaneously per prevenire il gonfiore e l&#39;infiammazione cerebrale 11. Radersi i capelli sul cranio tra le orecchie, e sterilizzare la pelle con scrub betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70%. </li><li> Montare l&#39;animale in una fase chirurgica stereotassico con earbars, con un cuscinetto riscaldante circolazione dell&#39;acqua sotto il set animale a 37 ° C. Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell&#39;animale, e completare la dose di anestetico originale, se necessario. </li><li> Iniettare 200 ml di 0,5% Marcaine sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire la zona. Incidere la pelle e rimuovere il lembo cutaneo sul cranio. Rimuovere il periostio e asciugare la zona con tamponi di cotone pulito. </li></ol> 2. Cronica Chirurgia Finestra cranico <ol><li> Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un diametro fresa da 0,5 a delineare delicatamente un cerchio del diametro di 3-5 mm sopra la regione del cervello di interesse. Periodicamente bagnare il sito di perforazione con polvere sterile salina allo 0,9% delle ossa e chiaro via con tamponi di cotone pulito. Se le ossa sanguina, utilizzare gelfoam ammollo con soluzione salina sterile per cancellare al vivo e aspettare che si fermi. </li><li> Quando lo strato ultimo osso è raggiunto, sollevare e rimuovere l&#39;isola osso con punta fine pinze. Dura allegati al ripiano inferiore dell&#39;osso può essere rilevato se la finestra attraversa una sutura ossea. Questi dovrebbero essere delicatamente rimosso come il lembo osseo viene sollevato. </li><li> Rotolo inumidito schiuma gel delicatamente sopra dura esposta per pulire la superficie ed attendere per qualsiasi sanguinamento durale per fermare passaggio critico:. Non procedere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato durale. Sangue che resta intrappolato all&#39;interno della finestra del cranio di solito porta ad una finestra opaca. </li><li> Se la regione di interesse è in una posizione in cui la durata è particolarmente spesso, rimuovendo la dura sopra può essere necessario. Se questo è il caso, separare delicatamente la dura dalla pia sotto con pinze molto fini, una piccola incisione nella sollevato dura con un altro paio di pinze sottili, quindi afferrare i bordi di taglio e delicatamentedividere la dura madre. La dura madre è sottile ma resistente, quindi fate attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura. </li><li> Sciacquare la zona con ACSF sterile o soluzione fisiologica sterile. </li><li> Posare un vetrino sterile di vetro (3-5 mm) sulla durata o pia passaggio critico:. Se le curve cranio circostanti in modo significativo, utilizzare Kwiksil 12 adesivo per riempire spazi in cui la dura madre e pia non avrebbe stretto contatto con il coprioggetto in regioni che non sarà ripreso. </li><li> Utilizzare gel cianoacrilato a coprire l&#39;adesivo elastomero e bordi del vetrino coprioggetto. Coprire l&#39;intero teschio esposto con cianoacrilato gel, o una miscela di cemento e krazyglue dentale passaggio critico:. Non lasciare che il gel di cianoacrilato a toccare la superficie del cervello. </li><li> Incorporare una misura testa barra metallica di fissaggio dalla parte opposta del cranio. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso una camera di recupero calda, dopo un&#39;iniezione intraperitonial di ketoprofene, 5 mg / kg, for gestione del dolore. Continua l&#39;analgesico per altri due giorni dopo l&#39;intervento. </li><li> Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l&#39;animale con isoflurano (5% per l&#39;induzione, 1,5% per la manutenzione), montarlo in una misura palco microscopio con una testa di fissaggio telaio, e controllare la finestra del cranio per chiarezza ottica con l&#39;illuminazione con luce blu. Superficie dei vasi sanguigni del cervello chiarezza è altamente indicativo di qualità finestra cranica. Se i bordi dei vasi sanguigni sono nettamente definita, la finestra può essere utilizzabile. Le due settimane di post-operatorio i tempi di recupero si consiglia di disporre del tempo sufficiente per consentire all&#39;animale di riprendersi da un intervento chirurgico. Finestre craniche tipicamente chiaro e migliorare in questo periodo, e restano otticamente trasparente per settimane supplementari per mesi fino a quando la ricrescita del cranio o ispessimento della dura degrada la qualità finestra. </li></ol> 3. Protocollo di comportamento e di scansione laser a due fotoni Microscopia <ol><li> Gli animali con chiara cfinestre ranial saranno esposti ad uno stimolo ambientale o sottoposto ad una sessione di formazione comportamentale, e poi successivamente ripreso al momento del massimo Arc-GFP espressione. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l&#39;animale deve essere conservato in un ambiente coerente gabbia di casa per ridurre al minimo giorno per giorno variazione della linea di base Arc-GFP livelli di espressione. </li><li> Iniziare la formazione comportamentale o paradigmi stimolazione ambientale, a seconda della regione del cervello di interesse. Per esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per più giorni consecutivi, e ripreso ogni giorno dopo la stimolazione visiva per identificare stimoli-risposte specifiche nella corteccia visiva 10. </li><li> Arc-GFP fluorescenza nei neuroni in genere raggiunge il suo livello massimo due ore dopo la stimolazione. La timeline sperimentale può essere ottimizzato per facilitare l&#39;individuazione di Arc-GFP espressione nei neuroni al loro livello di picco di fluorescenza. </li><li> Dopo una sessione di formazione comportamentale o environmentastimolazione l è completata, anestetizzare l&#39;animale con isoflurano (5% per l&#39;induzione, 1,5% per la manutenzione) e montare l&#39;animale nella misura palco microscopio con testa di fissaggio telaio sotto il microscopio a due fotoni. </li><li> Posizione della testa dell&#39;animale è fissato alla testa di fissazione cornice che si collega direttamente alla fase, utilizzando la barra di metallo impiantato sul cranio. Isoflurano e ossigeno vengono continuamente fornita al mouse tramite un cono. La temperatura corporea è mantenuta utilizzando una piastra elettrica. </li><li> Assicurarsi che i rivelatori microscopio sono protetti dalla luce ambientale, conducendo a due fotoni di scansione laser in una stanza buia. Utilizzare un 20x o 25x (1,05 apertura numerica) obiettivo a immersione in acqua per l&#39;imaging. Primo, sotto epi-fluorescenza illuminazione, acquisire un&#39;immagine di modelli di superficie del vaso sanguigno oltre la regione del cervello di interesse con una camera CCD per allineamento dell&#39;immagine futuro. </li><li> Inizia a due fotoni di scansione laser per acquisire un 3-D serie di immagini. Una Olympus FV1000MPE multi-fotone microscopio è usato nel nostro setup. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione dei due fotoni laser è fissata a 920 nm, e la potenza del laser emesso dall&#39;obiettivo è fissato a circa 50 mW. Fluorescenza emessa viene rilevata contemporaneamente nei canali verde e rosso (specchio dicroico a 570 nm, filtro barriera a 495-540 nm e 570-625 nm), utilizzando un esterno a due canali sistema di rilevazione photomutiplier posizionato vicino al campione. Arc-GFP fluorescenza appare solo nel canale verde, mentre i tessuti auto-fluorescenza appare in entrambi i canali 13, 14. </li><li> Stack di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320x320x100 micron (larghezza x lunghezza x profondità), una risoluzione orizzontale di 0,5 micron / pixel e una risoluzione verticale di 3 micron / pixel. </li><li> Dopo aver acquisito la pila di immagini, rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia casa. Non disturbare l&#39;animale fino alla prossima sessione di imaging e comportamentali. Ripetere la procedura di comportamento e di imaging in giorni come auspicabileed. Utilizzare il precedentemente acquisito superficie del cervello immagine dei vasi sanguigni per orientare nuovamente nella posizione di imaging stessa. </li></ol>

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<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo in vivo immagini qui descritto consente l&#39;esame ripetuto di cambiamenti genetici Arc espressione negli stessi gruppi di neuroni più di più giorni in animale vivo. Si tratta di un metodo efficace e versatile per ottenere informazioni sulla dinamica molecolare plasticità neurali legate a singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali. Standard metodi istochimici come ibridazione in situ e colorazione può realizzare singola cella di risoluzione 3, ma manca la capac...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotone microscopio a scansione laser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Stereotaxis fase chirurgica per i topi </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> 20X o 25X obiettivo immersione in acqua </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Fase Microscopio con testa di fissaggio telaio </td><td> Una soluzione su misura </td><td> N / A </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Una pinza sottile </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11251-20 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Dental trapano fresa </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 19007-05 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 bit </td><td> Imaging </td></tr></tbody></table>

in vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

La capacità del cervello di cambiare in risposta alle esperienze è essenziale per la funzione cerebrale sano, e anomalie in questo processo contribuiscono a una varietà di disturbi cerebrali 1,2. Per meglio comprendere i meccanismi con cui i circuiti cerebrali reagiscono all&#39;esperienza di un animale richiede la capacità di monitorare i cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in un dato insieme di neuroni, per un periodo di tempo prolungato, nell&#39;animale vivo. Mentre l&#39;esperienza e le relative attività neurale è noto per innescare cambiamenti di espressione genica nei neuroni 1,2, la maggior parte dei metodi per rilevare i cambiamenti e non consentono l&#39;osservazione ripetuta dei neuroni stessi più di più giorni o non hanno una risoluzione sufficiente per osservare i singoli neuroni 3 , 4. Qui, descriviamo un metodo che combina in due fotoni microscopia in vivo con un giornalista geneticamente codificato fluorescente per monitorare l&#39;esperienza-dipendenti cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni corticali sul<html> corso del giorno per giorno l&#39;esperienza. Uno dei consolidata esperienza-dipendenti geni è regolata attività proteine ​​del citoscheletro associato (Arc) 5,6. La trascrizione d&#39;Arco è rapidamente e altamente indotta da attività neuronale intensificata 3, e il suo prodotto proteico regola l&#39;endocitosi dei recettori del glutammato e lungo termine plasticità sinaptica 7. L&#39;espressione di Arc è stato ampiamente utilizzato come marcatore molecolare per mappare circuiti neuronali coinvolti in comportamenti specifici 3. Nella maggior parte di questi studi, espressione Arc stata rilevata mediante ibridazione in situ o immunoistochimica in sezioni di cervello fisse. Benché questi metodi ha rivelato che l&#39;espressione di Arc è stato localizzato a un sottoinsieme di neuroni eccitatori, dopo l&#39;esperienza del comportamento, come i modelli cellulari di espressione Arc potrebbe cambiare con episodi multipli di esperienze ripetute o distintivo più giorni non è stato studiato. S copi &quot;&gt; In vivo a due fotoni microscopia offre un modo efficace per esaminare i cambiamenti cellulari esperienza-dipendenti nel cervello vivente 8,9. Per consentire l&#39;esame di espressione Arc nei neuroni vivi da microscopia a due fotoni, abbiamo precedentemente generato un knock- in linea di topi in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno Arc 10. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per tracciamento esperienza-dipendenti Arc-GFP espressione modelli in formazioni neuronali nel animale vivo. In questo metodo , croniche finestre del cranio sono stati impiantati in Arc-GFP topi sulle regioni corticali di interesse. Tali animali sono stati quindi più volte ripreso da microscopia a due fotoni dopo desiderati paradigmi comportamentali nel corso di diversi giorni. Questo metodo può essere generalmente applicabili agli animali che trasportano altri reporter fluorescenti di cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti 4.

<html> Questo protocollo descrive un metodo per tenere traccia delle modifiche molecolari esperienza-dipendenti nei singoli neuroni corticali di animali vivi. Una finestra cronica craniale viene creato su una regione corticale di interesse in un topo che porta un reporter fluorescente dell&#39;espressione genica. Due-fotone microscopia può essere accoppiato con diversi paradigmi comportamentali da osservare comportamentale indotti cambiamenti molecolari in singoli neuroni e tenere traccia delle modifiche negli stessi gru...

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un<em&gt; In vivo</em&gt; A due fotoni metodo di imaging è descritto qui che permette il tracciamento di tali alterazioni molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso giornalisti geneticamente codificati.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

I cambiamenti molecolari dipendenti sperimentati nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Qui viene descritto un metodo di imaging a due fotoni in vivo che consente il tracciamento di tali cambiamenti molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso reporter geneticamente codificati. Uno dei geni dipendenti esperti ben consolidati è la proteina associata al citoscheletro regolata dall'attività o l'arco.La trascrizione dell'ARC è rapidamente e altamente indotta dall'intensificazione dell'attività neuronale Per consentire l'esame dell'espressione dell'arco nei neuroni vivi mediante due fotomicroscopie, utilizziamo una linea di topo knockin in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno dell'arco. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per il monitoraggio dei modelli di espressione di GFP dell'arco dipendente sperimentati in insiemi neuronali nell'animale vivo. Innanzitutto, descriveremo la preparazione animale necessaria per questa tecnica.Un animale GFP ad arco sarà sottoposto a un intervento chirurgico alla finestra cranica e si riprenderà dall

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Neuroscienze

Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire...

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Imaging a due fotoni dei neuroni corticali nei topi neonatali. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra la microscopia a due fotoni utilizzata per visualizzare i neuroni nel cervello di un cucciolo di topo transgenico anestetizzato. Il laser a due fotoni consente immagini più approfondite con un'elevata risoluzione spaziale e una dispersione della luce minima, consentendo l'acquisizione dettagliata della morfologia neuronale, comprese le proiezioni dendritiche.

Microscopia a due fotoni per l'imaging della morfologia neuronale in un cucciolo di topo

Fonte: Kamei, R., et. al., Imaging cronico a due fotoni in vivo della microglia nell'ippocampo del topo. J. Vis. Exp. (2022)Il video mostra il processo di configurazione e imaging per la microscopia a due fotoni in vivo della dinamica microgliale nel CA1 dell'ippocampo (Cornu ammonis 1) e nel giro dentato, garantendo un allineamento ottico ottimale e una valutazione dell'integrità strutturale.

Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

L'imaging time-lapse nell'animale vivente fornisce informazioni preziose sulla riorganizzazione strutturale nel cervello intatto. Qui, introduciamo una preparazione di cranio assottigliato che consente l'imaging transcranico di strutture sinaptiche marcate in fluorescenza nella corteccia di topo vivente mediante microscopia a due fotoni.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

Scopri l'imaging a due fotoni in vivo per tracciare i cambiamenti molecolari dipendenti dall'esperienza nei neuroni corticali. Questo metodo utilizza reporter geneticamente codificati per studiare l'espressione di ARC.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

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