In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

I cambiamenti molecolari dipendenti sperimentati nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Qui viene descritto un metodo di imaging a due fotoni in vivo che consente il tracciamento di tali cambiamenti molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso reporter geneticamente codificati. Uno dei geni dipendenti esperti ben consolidati è la proteina associata al citoscheletro regolata dall'attività o l'arco.

La trascrizione dell'ARC è rapidamente e altamente indotta dall'intensificazione dell'attività neuronale Per consentire l'esame dell'espressione dell'arco nei neuroni vivi mediante due fotomicroscopie, utilizziamo una linea di topo knockin in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno dell'arco. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per il monitoraggio dei modelli di espressione di GFP dell'arco dipendente sperimentati in insiemi neuronali nell'animale vivo. Innanzitutto, descriveremo la preparazione animale necessaria per questa tecnica.

Un animale GFP ad arco sarà sottoposto a un intervento chirurgico alla finestra cranica e si riprenderà dall'intervento chirurgico per circa due settimane. La qualità della finestra cranica viene quindi controllata e se i neuroni possono essere riprodotti attraverso di essa, l'animale viene posto in un ambiente qua fino all'inizio degli esperimenti comportamentali e di imaging a due fotoni. Questi animali vengono poi ripetutamente ripresi con due fotomicroscopie.

Dopo che i paradigmi comportamentali desiderati sono stati completati nel corso di diversi giorni, pulire tutti gli strumenti in uno sterilizzatore a microsfere caldo. Prima della chirurgia asettica, pulire il sito dell'intervento con etanolo al 70% e stendere panni puliti. Anestetizzare l'animale con una soluzione di Everton all'1,2% somministrata a 0,02 millilitri per grammo intraperitoneale.

Controllare il livello di anestesia utilizzando pizzichi sulla coda o sulle dita dei piedi per garantire una sedazione completa. Coprire gli occhi dell'animale con unguento oftalmico sterile e iniettare desametasone 0,2 milligrammi per chilogrammo e carprofene cinque milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea. Radere i peli sopra il cranio tra le orecchie e sterilizzare la pelle con scrub Betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70% montare l'animale in una fase di chirurgia stereotassica con barre auricolari con un termoforo per la circolazione dell'acqua sotto l'animale impostato a 37 gradi.

Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell'animale e integrare la dose originale di anestetico secondo necessità. Iniettare 200 microlitri di marcaina allo 0,5% sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire l'area, incidere la pelle e rimuovere il lembo di pelle sopra il cranio. Rimuovere il periostio e asciugare l'area con batuffoli di cotone puliti.

Usa un trapano dentale ad alta velocità con una fresa da 0,5 millimetri per delineare delicatamente un cerchio da tre a cinque millimetri di diametro sulla regione del cervello di interesse a seconda delle tue esigenze. Bagnare periodicamente il sito di perforazione con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% e rimuovere la polvere ossea con tamponi di cotone puliti. Se l'osso sanguina, utilizzare una schiuma di gel preimbevuta di soluzione fisiologica sterile per tamponare l'emorragia e attendere che si fermi.

Quando viene raggiunto l'ultimo strato osseo, sollevare e rimuovere l'isola ossea con una pinza a punta fine. Potresti incontrare attacchi durali al ripiano inferiore dell'osso. Se la tua finestra attraversa la sutura ossea, queste dovrebbero essere rimosse delicatamente.

Quando il lembo osseo viene sollevato, arrotolare delicatamente la schiuma umida e gel sulla dura esposta per pulirne la superficie e attendere che l'eventuale sanguinamento durale si fermi. Se la tua regione di interesse si trova sotto una posizione con una dura madre particolarmente spessa, potrebbe essere necessario rimuovere la dura madre sopra di essa. In questo caso, separare delicatamente la dura madre dal PIA sottostante con una pinza molto fine.

Fai una piccola incisione nella dura madre sollevata con un altro paio di pinze sottili. Quindi afferrare i bordi tagliati e dividere delicatamente la dura. La dura madre è sottile ma forte, quindi fai attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura dura.

Mentre lavori indietro e lontano dalla tua regione di interesse, risciacqua abbondantemente l'area con liquido cerebrospinale sterile A o soluzione salina sterile. Se il cranio circostante si curva in modo significativo attorno alla dura madre o al pia esposti, utilizzare l'adesivo rapido per celle per riempire gli spazi che non entrerebbero in stretto contatto con il vetrino nelle regioni che non verranno riprese. Quindi stendere delicatamente un vetrino di vetro sterile sulla dura madre o sulla pia.

Utilizzare il gel acrilico Sano per coprire l'adesivo elastomerico e i bordi del vetro. Vetrino coprioggetto. Copri l'intero cranio esposto con il gel cianoacrilato Sano o una miscela di colla e cemento dentale.

Incorpora una barra di fissaggio della testa in metallo su misura all'estremità opposta del cranio. Riportare l'animale in una camera di recupero calda dopo un'iniezione intraperitoneale di ketoprofene cinque milligrammi per chilogrammo per la gestione del dolore. Continuare l'analgesico per due giorni dopo l'intervento.

Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l'animale con fluoro ISO. 5% per induzione, 1,5% per mantenimento. Montatelo in un tavolino da microscopio su misura con un telaio di fissaggio della testa e controllate la chiarezza ottica della finestra cranica.

In condizioni di illuminazione con luce blu, la chiarezza dei vasi sanguigni della superficie cerebrale è altamente indicativa della qualità della finestra cranica. Se i bordi sono ben definiti, è probabile che la finestra sia utilizzabile. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l'animale deve essere tenuto in un ambiente domestico coerente per ridurre al minimo le variazioni quotidiane.

Nell'arco basale, i livelli di espressione della GFP iniziano l'allenamento comportamentale o i paradigmi di stimolazione ambientale a seconda della regione cerebrale di interesse. Ad esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per giorni consecutivi per visualizzare popolazioni distintive di neuroni nell'arco della corteccia visiva, la fluorescenza GFP nei neuroni raggiunge tipicamente il suo livello di picco due ore dopo la stimolazione. La sequenza temporale sperimentale può essere ottimizzata per facilitare il rilevamento dell'espressione di ARC GFP nei neuroni ai loro livelli di fluorescenza di picco.

Dopo aver completato una sessione di addestramento comportamentale o una stimolazione ambientale, anestetizzare l'animale con fluoro ISO 5% per l'induzione, 1,5% per il mantenimento. Monta l'animale nel tavolino del microscopio su misura con telaio di fissaggio della testa. Sotto il microscopio a due fotoni, la posizione della testa dell'animale è fissata al telaio di fissazione della testa che si collega direttamente al tavolino utilizzando la barra metallica impiantata sul cranio.

Il fluoro ISO e l'ossigeno vengono continuamente forniti al mouse attraverso un cono nasale. La temperatura corporea viene mantenuta utilizzando un termoforo. Assicurarsi che i rilevatori del microscopio siano protetti dalla luce ambientale.

Eseguendo la scansione laser a due fotoni in una camera buia, utilizzare una lente a immersione in acqua con apertura numerica 20 x o 25 x 1,05 per l'imaging. In primo luogo, sotto l'illuminazione a epifluorescenza, acquisire un'immagine dei modelli dei vasi sanguigni superficiali sopra la regione del cervello di interesse con una telecamera CCD. Per un futuro allineamento dell'immagine, avviare la scansione laser a due fotoni per acquisire una pila di immagini 3D.

La lunghezza d'onda di eccitazione del laser a due fotoni è impostata a 920 nanometri e la potenza è impostata a circa 50. La fluorescenza emessa in milliwatt viene rilevata simultaneamente sia in un arco di canale verde che in uno rosso. La fluorescenza GFP appare solo nel canale verde, mentre l'autofluorescenza tissutale appare in entrambi i canali.

Le pile di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320 x 300, 20 x 100 micrometri, una risoluzione orizzontale di 0,5 micrometri per pixel e una risoluzione verticale di tre micrometri per pixel. Dopo aver acquisito la pila di immagini, riporta l'animale nella sua gabbia di casa. Non disturbare l'animale fino alla prossima sessione comportamentale e di imaging.

Ripetere il comportamento e la procedura di imaging per tutti i giorni come desiderato. Utilizzare l'immagine dei vasi sanguigni della superficie cerebrale acquisita in precedenza per orientarsi di nuovo nella stessa posizione di imaging. Il punto di forza di questa tecnica è che consente l'esame dei cambiamenti dell'espressione genica nell'arco nello stesso insieme di neuroni per più giorni.

Nell'animale vivo. I metodi istochimici standard possono raggiungere la risoluzione di una singola cellula, ma non possono tracciare i cambiamenti di espressione genica negli stessi neuroni per più giorni. Altre tecniche di imaging, come la risonanza magnetica o i metodi di imaging nucleare, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i singoli neuroni.

Pertanto, nessun altro metodo esistente per misurare i cambiamenti dell'espressione genica può eguagliare sia la risoluzione spaziale che la copertura temporale del metodo di imaging qui descritto. Un passaggio critico in questa procedura è la chirurgia della finestra cranica. Dovrebbe essere eseguito con particolare attenzione per evitare traumi al cervello o lasciare sangue sotto il vetrino.

La dura madre può essere rimossa se necessario. Tieni presente che la profondità massima di imaging nel cervello utilizzando questa procedura dipenderà dalla chiarezza della finestra cranica, dalla configurazione del microscopio e dalla luminosità dei reporter fluorescenti. Questo protocollo di imaging in vivo è un metodo efficiente e versatile per ottenere informazioni sulle dinamiche molecolari correlate alla neuroplasticità nei singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali, ed è probabile che sia generalmente applicabile ai topi transgenici portatori di reporter fluorescenti per altri geni regolati esperti.