Name: In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Scopri l'imaging a due fotoni in vivo per tracciare i cambiamenti molecolari dipendenti dall'esperienza nei neuroni corticali. Questo metodo utilizza reporter geneticamente codificati per studiare l'espressione di ARC.

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Gli autori desiderano ringraziare L. Belluscio per le apparecchiature per la chirurgia riprese, D. Kwon per le riprese di assistenza, K. Liu per il video editing di assistenza, e K. MacLeod per tutta la musica di sottofondo. KW riconosce il generoso sostegno della Divisione NIMH dei programmi di ricerca intramurale e le Geni, Cognizione e Programma psicosi. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale NIMH (VC, YY, SMKW) e la Divisione di NIAAA Intramural programma di ricerca clinica e biologica (VC, RMC, DML).

Le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal National Institute of Mental Cura la salute degli animali e del Comitato uso ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura ed uso di animali da laboratorio. 1. Preparazione pre-operatoria <ol><li> Pulire tutti gli strumenti in autoclave a caldo tallone prima dell&#39;intervento chirurgico asettico, pulire il sito chirurgico con il 70% di etanolo, e mettere giù teli puliti. Indossare guanti sterili. Anestetizzare l&#39;animale con una soluzione preparata 1,2% avertin, dato a 0,02 ml / g, intraperitonially. In alternativa, anestetizzare con gas isoflurano attraverso un cono, 5% per induzione, 1,5% per la manutenzione, con un circuito passivo scavenger. Controllare il livello di anestesia con pizzichi di coda o del piede per garantire la sedazione completa. </li><li> Coprire gli occhi dell&#39;animale con pomata oftalmica sterile, e iniettare desametasone preparata (0,2 mg / kg) e carprofen (5 mg / kg) subcutaneously per prevenire il gonfiore e l&#39;infiammazione cerebrale 11. Radersi i capelli sul cranio tra le orecchie, e sterilizzare la pelle con scrub betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70%. </li><li> Montare l&#39;animale in una fase chirurgica stereotassico con earbars, con un cuscinetto riscaldante circolazione dell&#39;acqua sotto il set animale a 37 ° C. Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell&#39;animale, e completare la dose di anestetico originale, se necessario. </li><li> Iniettare 200 ml di 0,5% Marcaine sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire la zona. Incidere la pelle e rimuovere il lembo cutaneo sul cranio. Rimuovere il periostio e asciugare la zona con tamponi di cotone pulito. </li></ol> 2. Cronica Chirurgia Finestra cranico <ol><li> Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un diametro fresa da 0,5 a delineare delicatamente un cerchio del diametro di 3-5 mm sopra la regione del cervello di interesse. Periodicamente bagnare il sito di perforazione con polvere sterile salina allo 0,9% delle ossa e chiaro via con tamponi di cotone pulito. Se le ossa sanguina, utilizzare gelfoam ammollo con soluzione salina sterile per cancellare al vivo e aspettare che si fermi. </li><li> Quando lo strato ultimo osso è raggiunto, sollevare e rimuovere l&#39;isola osso con punta fine pinze. Dura allegati al ripiano inferiore dell&#39;osso può essere rilevato se la finestra attraversa una sutura ossea. Questi dovrebbero essere delicatamente rimosso come il lembo osseo viene sollevato. </li><li> Rotolo inumidito schiuma gel delicatamente sopra dura esposta per pulire la superficie ed attendere per qualsiasi sanguinamento durale per fermare passaggio critico:. Non procedere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato durale. Sangue che resta intrappolato all&#39;interno della finestra del cranio di solito porta ad una finestra opaca. </li><li> Se la regione di interesse è in una posizione in cui la durata è particolarmente spesso, rimuovendo la dura sopra può essere necessario. Se questo è il caso, separare delicatamente la dura dalla pia sotto con pinze molto fini, una piccola incisione nella sollevato dura con un altro paio di pinze sottili, quindi afferrare i bordi di taglio e delicatamentedividere la dura madre. La dura madre è sottile ma resistente, quindi fate attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura. </li><li> Sciacquare la zona con ACSF sterile o soluzione fisiologica sterile. </li><li> Posare un vetrino sterile di vetro (3-5 mm) sulla durata o pia passaggio critico:. Se le curve cranio circostanti in modo significativo, utilizzare Kwiksil 12 adesivo per riempire spazi in cui la dura madre e pia non avrebbe stretto contatto con il coprioggetto in regioni che non sarà ripreso. </li><li> Utilizzare gel cianoacrilato a coprire l&#39;adesivo elastomero e bordi del vetrino coprioggetto. Coprire l&#39;intero teschio esposto con cianoacrilato gel, o una miscela di cemento e krazyglue dentale passaggio critico:. Non lasciare che il gel di cianoacrilato a toccare la superficie del cervello. </li><li> Incorporare una misura testa barra metallica di fissaggio dalla parte opposta del cranio. </li><li> Rispedire l&#39;animale verso una camera di recupero calda, dopo un&#39;iniezione intraperitonial di ketoprofene, 5 mg / kg, for gestione del dolore. Continua l&#39;analgesico per altri due giorni dopo l&#39;intervento. </li><li> Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l&#39;animale con isoflurano (5% per l&#39;induzione, 1,5% per la manutenzione), montarlo in una misura palco microscopio con una testa di fissaggio telaio, e controllare la finestra del cranio per chiarezza ottica con l&#39;illuminazione con luce blu. Superficie dei vasi sanguigni del cervello chiarezza è altamente indicativo di qualità finestra cranica. Se i bordi dei vasi sanguigni sono nettamente definita, la finestra può essere utilizzabile. Le due settimane di post-operatorio i tempi di recupero si consiglia di disporre del tempo sufficiente per consentire all&#39;animale di riprendersi da un intervento chirurgico. Finestre craniche tipicamente chiaro e migliorare in questo periodo, e restano otticamente trasparente per settimane supplementari per mesi fino a quando la ricrescita del cranio o ispessimento della dura degrada la qualità finestra. </li></ol> 3. Protocollo di comportamento e di scansione laser a due fotoni Microscopia <ol><li> Gli animali con chiara cfinestre ranial saranno esposti ad uno stimolo ambientale o sottoposto ad una sessione di formazione comportamentale, e poi successivamente ripreso al momento del massimo Arc-GFP espressione. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l&#39;animale deve essere conservato in un ambiente coerente gabbia di casa per ridurre al minimo giorno per giorno variazione della linea di base Arc-GFP livelli di espressione. </li><li> Iniziare la formazione comportamentale o paradigmi stimolazione ambientale, a seconda della regione del cervello di interesse. Per esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per più giorni consecutivi, e ripreso ogni giorno dopo la stimolazione visiva per identificare stimoli-risposte specifiche nella corteccia visiva 10. </li><li> Arc-GFP fluorescenza nei neuroni in genere raggiunge il suo livello massimo due ore dopo la stimolazione. La timeline sperimentale può essere ottimizzato per facilitare l&#39;individuazione di Arc-GFP espressione nei neuroni al loro livello di picco di fluorescenza. </li><li> Dopo una sessione di formazione comportamentale o environmentastimolazione l è completata, anestetizzare l&#39;animale con isoflurano (5% per l&#39;induzione, 1,5% per la manutenzione) e montare l&#39;animale nella misura palco microscopio con testa di fissaggio telaio sotto il microscopio a due fotoni. </li><li> Posizione della testa dell&#39;animale è fissato alla testa di fissazione cornice che si collega direttamente alla fase, utilizzando la barra di metallo impiantato sul cranio. Isoflurano e ossigeno vengono continuamente fornita al mouse tramite un cono. La temperatura corporea è mantenuta utilizzando una piastra elettrica. </li><li> Assicurarsi che i rivelatori microscopio sono protetti dalla luce ambientale, conducendo a due fotoni di scansione laser in una stanza buia. Utilizzare un 20x o 25x (1,05 apertura numerica) obiettivo a immersione in acqua per l&#39;imaging. Primo, sotto epi-fluorescenza illuminazione, acquisire un&#39;immagine di modelli di superficie del vaso sanguigno oltre la regione del cervello di interesse con una camera CCD per allineamento dell&#39;immagine futuro. </li><li> Inizia a due fotoni di scansione laser per acquisire un 3-D serie di immagini. Una Olympus FV1000MPE multi-fotone microscopio è usato nel nostro setup. La lunghezza d&#39;onda di eccitazione dei due fotoni laser è fissata a 920 nm, e la potenza del laser emesso dall&#39;obiettivo è fissato a circa 50 mW. Fluorescenza emessa viene rilevata contemporaneamente nei canali verde e rosso (specchio dicroico a 570 nm, filtro barriera a 495-540 nm e 570-625 nm), utilizzando un esterno a due canali sistema di rilevazione photomutiplier posizionato vicino al campione. Arc-GFP fluorescenza appare solo nel canale verde, mentre i tessuti auto-fluorescenza appare in entrambi i canali 13, 14. </li><li> Stack di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320x320x100 micron (larghezza x lunghezza x profondità), una risoluzione orizzontale di 0,5 micron / pixel e una risoluzione verticale di 3 micron / pixel. </li><li> Dopo aver acquisito la pila di immagini, rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia casa. Non disturbare l&#39;animale fino alla prossima sessione di imaging e comportamentali. Ripetere la procedura di comportamento e di imaging in giorni come auspicabileed. Utilizzare il precedentemente acquisito superficie del cervello immagine dei vasi sanguigni per orientare nuovamente nella posizione di imaging stessa. </li></ol>

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<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo in vivo immagini qui descritto consente l&#39;esame ripetuto di cambiamenti genetici Arc espressione negli stessi gruppi di neuroni più di più giorni in animale vivo. Si tratta di un metodo efficace e versatile per ottenere informazioni sulla dinamica molecolare plasticità neurali legate a singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali. Standard metodi istochimici come ibridazione in situ e colorazione può realizzare singola cella di risoluzione 3, ma manca la capac...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-fotone microscopio a scansione laser </td><td> Olimpo </td><td> FV1000MPE </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Stereotaxis fase chirurgica per i topi </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> 20X o 25X obiettivo immersione in acqua </td><td> Olimpo </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Fase Microscopio con testa di fissaggio telaio </td><td> Una soluzione su misura </td><td> N / A </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Una pinza sottile </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11251-20 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Dental trapano fresa </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 19007-05 </td><td> Chirurgia </td></tr><tr><td> Telecamera CCD </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12 bit </td><td> Imaging </td></tr></tbody></table>

in vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

La capacità del cervello di cambiare in risposta alle esperienze è essenziale per la funzione cerebrale sano, e anomalie in questo processo contribuiscono a una varietà di disturbi cerebrali 1,2. Per meglio comprendere i meccanismi con cui i circuiti cerebrali reagiscono all&#39;esperienza di un animale richiede la capacità di monitorare i cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in un dato insieme di neuroni, per un periodo di tempo prolungato, nell&#39;animale vivo. Mentre l&#39;esperienza e le relative attività neurale è noto per innescare cambiamenti di espressione genica nei neuroni 1,2, la maggior parte dei metodi per rilevare i cambiamenti e non consentono l&#39;osservazione ripetuta dei neuroni stessi più di più giorni o non hanno una risoluzione sufficiente per osservare i singoli neuroni 3 , 4. Qui, descriviamo un metodo che combina in due fotoni microscopia in vivo con un giornalista geneticamente codificato fluorescente per monitorare l&#39;esperienza-dipendenti cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni corticali sul<html> corso del giorno per giorno l&#39;esperienza. Uno dei consolidata esperienza-dipendenti geni è regolata attività proteine ​​del citoscheletro associato (Arc) 5,6. La trascrizione d&#39;Arco è rapidamente e altamente indotta da attività neuronale intensificata 3, e il suo prodotto proteico regola l&#39;endocitosi dei recettori del glutammato e lungo termine plasticità sinaptica 7. L&#39;espressione di Arc è stato ampiamente utilizzato come marcatore molecolare per mappare circuiti neuronali coinvolti in comportamenti specifici 3. Nella maggior parte di questi studi, espressione Arc stata rilevata mediante ibridazione in situ o immunoistochimica in sezioni di cervello fisse. Benché questi metodi ha rivelato che l&#39;espressione di Arc è stato localizzato a un sottoinsieme di neuroni eccitatori, dopo l&#39;esperienza del comportamento, come i modelli cellulari di espressione Arc potrebbe cambiare con episodi multipli di esperienze ripetute o distintivo più giorni non è stato studiato. S copi &quot;&gt; In vivo a due fotoni microscopia offre un modo efficace per esaminare i cambiamenti cellulari esperienza-dipendenti nel cervello vivente 8,9. Per consentire l&#39;esame di espressione Arc nei neuroni vivi da microscopia a due fotoni, abbiamo precedentemente generato un knock- in linea di topi in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno Arc 10. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per tracciamento esperienza-dipendenti Arc-GFP espressione modelli in formazioni neuronali nel animale vivo. In questo metodo , croniche finestre del cranio sono stati impiantati in Arc-GFP topi sulle regioni corticali di interesse. Tali animali sono stati quindi più volte ripreso da microscopia a due fotoni dopo desiderati paradigmi comportamentali nel corso di diversi giorni. Questo metodo può essere generalmente applicabili agli animali che trasportano altri reporter fluorescenti di cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti 4.

<html> Questo protocollo descrive un metodo per tenere traccia delle modifiche molecolari esperienza-dipendenti nei singoli neuroni corticali di animali vivi. Una finestra cronica craniale viene creato su una regione corticale di interesse in un topo che porta un reporter fluorescente dell&#39;espressione genica. Due-fotone microscopia può essere accoppiato con diversi paradigmi comportamentali da osservare comportamentale indotti cambiamenti molecolari in singoli neuroni e tenere traccia delle modifiche negli stessi gru...

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un<em&gt; In vivo</em&gt; A due fotoni metodo di imaging è descritto qui che permette il tracciamento di tali alterazioni molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso giornalisti geneticamente codificati.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

I cambiamenti molecolari dipendenti sperimentati nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Qui viene descritto un metodo di imaging a due fotoni in vivo che consente il tracciamento di tali cambiamenti molecolari nei singoli neuroni corticali attraverso reporter geneticamente codificati. Uno dei geni dipendenti esperti ben consolidati è la proteina associata al citoscheletro regolata dall'attività o l'arco.La trascrizione dell'ARC è rapidamente e altamente indotta dall'intensificazione dell'attività neuronale Per consentire l'esame dell'espressione dell'arco nei neuroni vivi mediante due fotomicroscopie, utilizziamo una linea di topo knockin in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno dell'arco. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per il monitoraggio dei modelli di espressione di GFP dell'arco dipendente sperimentati in insiemi neuronali nell'animale vivo. Innanzitutto, descriveremo la preparazione animale necessaria per questa tecnica.Un animale GFP ad arco sarà sottoposto a un intervento chirurgico alla finestra cranica e si riprenderà dall'intervento chirurgico per circa due settimane. La qualità della finestra cranica viene quindi controllata e se i neuroni possono essere riprodotti attraverso di essa, l'animale viene posto in un ambiente qua fino all'inizio degli esperimenti comportamentali e di imaging a due fotoni. Questi animali vengono poi ripetutamente ripresi con due fotomicroscopie.Dopo che i paradigmi comportamentali desiderati sono stati completati nel corso di diversi giorni, pulire tutti gli strumenti in uno sterilizzatore a microsfere caldo. Prima della chirurgia asettica, pulire il sito dell'intervento con etanolo al 70% e stendere panni puliti. Anestetizzare l'animale con una soluzione di Everton all'1,2% somministrata a 0,02 millilitri per grammo intraperitoneale.Controllare il livello di anestesia utilizzando pizzichi sulla coda o sulle dita dei piedi per garantire una sedazione completa. Coprire gli occhi dell'animale con unguento oftalmico sterile e iniettare desametasone 0,2 milligrammi per chilogrammo e carprofene cinque milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea. Radere i peli sopra il cranio tra le orecchie e sterilizzare la pelle con scrub Betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70% montare l'animale in una fase di chirurgia stereotassica con barre auricolari con un termoforo per la circolazione dell'acqua sotto l'animale impostato a 37 gradi.Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell'animale e integrare la dose originale di anestetico secondo necessità. Iniettare 200 microlitri di marcaina allo 0,5% sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire l'area, incidere la pelle e rimuovere il lembo di pelle sopra il cranio. Rimuovere il periostio e asciugare l'area con batuffoli di cotone puliti.Usa un trapano dentale ad alta velocità con una fresa da 0,5 millimetri per delineare delicatamente un cerchio da tre a cinque millimetri di diametro sulla regione del cervello di interesse a seconda delle tue esigenze. Bagnare periodicamente il sito di perforazione con soluzione fisiologica sterile allo 0,9% e rimuovere la polvere ossea con tamponi di cotone puliti. Se l'osso sanguina, utilizzare una schiuma di gel preimbevuta di soluzione fisiologica sterile per tamponare l'emorragia e attendere che si fermi.Quando viene raggiunto l'ultimo strato osseo, sollevare e rimuovere l'isola ossea con una pinza a punta fine. Potresti incontrare attacchi durali al ripiano inferiore dell'osso. Se la tua finestra attraversa la sutura ossea, queste dovrebbero essere rimosse delicatamente.Quando il lembo osseo viene sollevato, arrotolare delicatamente la schiuma umida e gel sulla dura esposta per pulirne la superficie e attendere che l'eventuale sanguinamento durale si fermi. Se la tua regione di interesse si trova sotto una posizione con una dura madre particolarmente spessa, potrebbe essere necessario rimuovere la dura madre sopra di essa. In questo caso, separare delicatamente la dura madre dal PIA sottostante con una pinza molto fine.Fai una piccola incisione nella dura madre sollevata con un altro paio di pinze sottili. Quindi afferrare i bordi tagliati e dividere delicatamente la dura. La dura madre è sottile ma forte, quindi fai attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura dura.Mentre lavori indietro e lontano dalla tua regione di interesse, risciacqua abbondantemente l'area con liquido cerebrospinale sterile A o soluzione salina sterile. Se il cranio circostante si curva in modo significativo attorno alla dura madre o al pia esposti, utilizzare l'adesivo rapido per celle per riempire gli spazi che non entrerebbero in stretto contatto con il vetrino nelle regioni che non verranno riprese. Quindi stendere delicatamente un vetrino di vetro sterile sulla dura madre o sulla pia.Utilizzare il gel acrilico Sano per coprire l'adesivo elastomerico e i bordi del vetro. Vetrino coprioggetto. Copri l'intero cranio esposto con il gel cianoacrilato Sano o una miscela di colla e cemento dentale.Incorpora una barra di fissaggio della testa in metallo su misura all'estremità opposta del cranio. Riportare l'animale in una camera di recupero calda dopo un'iniezione intraperitoneale di ketoprofene cinque milligrammi per chilogrammo per la gestione del dolore. Continuare l'analgesico per due giorni dopo l'intervento.Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l'animale con fluoro ISO. 5% per induzione, 1,5% per mantenimento. Montatelo in un tavolino da microscopio su misura con un telaio di fissaggio della testa e controllate la chiarezza ottica della finestra cranica.In condizioni di illuminazione con luce blu, la chiarezza dei vasi sanguigni della superficie cerebrale è altamente indicativa della qualità della finestra cranica. Se i bordi sono ben definiti, è probabile che la finestra sia utilizzabile. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l'animale deve essere tenuto in un ambiente domestico coerente per ridurre al minimo le variazioni quotidiane.Nell'arco basale, i livelli di espressione della GFP iniziano l'allenamento comportamentale o i paradigmi di stimolazione ambientale a seconda della regione cerebrale di interesse. Ad esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per giorni consecutivi per visualizzare popolazioni distintive di neuroni nell'arco della corteccia visiva, la fluorescenza GFP nei neuroni raggiunge tipicamente il suo livello di picco due ore dopo la stimolazione. La sequenza temporale sperimentale può essere ottimizzata per facilitare il rilevamento dell'espressione di ARC GFP nei neuroni ai loro livelli di fluorescenza di picco.Dopo aver completato una sessione di addestramento comportamentale o una stimolazione ambientale, anestetizzare l'animale con fluoro ISO 5% per l'induzione, 1,5% per il mantenimento. Monta l'animale nel tavolino del microscopio su misura con telaio di fissaggio della testa. Sotto il microscopio a due fotoni, la posizione della testa dell'animale è fissata al telaio di fissazione della testa che si collega direttamente al tavolino utilizzando la barra metallica impiantata sul cranio.Il fluoro ISO e l'ossigeno vengono continuamente forniti al mouse attraverso un cono nasale. La temperatura corporea viene mantenuta utilizzando un termoforo. Assicurarsi che i rilevatori del microscopio siano protetti dalla luce ambientale.Eseguendo la scansione laser a due fotoni in una camera buia, utilizzare una lente a immersione in acqua con apertura numerica 20 x o 25 x 1,05 per l'imaging. In primo luogo, sotto l'illuminazione a epifluorescenza, acquisire un'immagine dei modelli dei vasi sanguigni superficiali sopra la regione del cervello di interesse con una telecamera CCD. Per un futuro allineamento dell'immagine, avviare la scansione laser a due fotoni per acquisire una pila di immagini 3D.La lunghezza d'onda di eccitazione del laser a due fotoni è impostata a 920 nanometri e la potenza è impostata a circa 50. La fluorescenza emessa in milliwatt viene rilevata simultaneamente sia in un arco di canale verde che in uno rosso. La fluorescenza GFP appare solo nel canale verde, mentre l'autofluorescenza tissutale appare in entrambi i canali.Le pile di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320 x 300, 20 x 100 micrometri, una risoluzione orizzontale di 0,5 micrometri per pixel e una risoluzione verticale di tre micrometri per pixel. Dopo aver acquisito la pila di immagini, riporta l'animale nella sua gabbia di casa. Non disturbare l'animale fino alla prossima sessione comportamentale e di imaging.Ripetere il comportamento e la procedura di imaging per tutti i giorni come desiderato. Utilizzare l'immagine dei vasi sanguigni della superficie cerebrale acquisita in precedenza per orientarsi di nuovo nella stessa posizione di imaging. Il punto di forza di questa tecnica è che consente l'esame dei cambiamenti dell'espressione genica nell'arco nello stesso insieme di neuroni per più giorni.Nell'animale vivo. I metodi istochimici standard possono raggiungere la risoluzione di una singola cellula, ma non possono tracciare i cambiamenti di espressione genica negli stessi neuroni per più giorni. Altre tecniche di imaging, come la risonanza magnetica o i metodi di imaging nucleare, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i singoli neuroni.Pertanto, nessun altro metodo esistente per misurare i cambiamenti dell'espressione genica può eguagliare sia la risoluzione spaziale che la copertura temporale del metodo di imaging qui descritto. Un passaggio critico in questa procedura è la chirurgia della finestra cranica. Dovrebbe essere eseguito con particolare attenzione per evitare traumi al cervello o lasciare sangue sotto il vetrino.La dura madre può essere rimossa se necessario. Tieni presente che la profondità massima di imaging nel cervello utilizzando questa procedura dipenderà dalla chiarezza della finestra cranica, dalla configurazione del microscopio e dalla luminosità dei reporter fluorescenti. Questo protocollo di imaging in vivo è un metodo efficiente e versatile per ottenere informazioni sulle dinamiche molecolari correlate alla neuroplasticità nei singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali, ed è probabile che sia generalmente applicabile ai topi transgenici portatori di reporter fluorescenti per altri geni regolati esperti.

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