Isolare e Immunostaining linfociti e le cellule dendritiche da placche di Peyer murino di

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare e immunocolorare i linfociti e le cellule dendritiche da patch di pagatori di neuroni, utilizzando due approcci sperimentali paralleli. In primo luogo, asportare i cerotti freschi dal topo, intestino tenue. Quindi dissociare fisicamente i cerotti del pagatore, raccogliere il tessuto e farlo passare attraverso un filtro a rete per generare una sospensione a singola cellula per l'analisi della citometria a flusso.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e distribuire le aliquote in una piastra di fondo rotonda a 96 pozzetti. Quindi, etichettare le cellule con anticorpi contro i marcatori di superficie specifici del tipo di cellula. Procedere immediatamente all'analisi citofluorimetrica per enumerare i tipi di cellule specifici in parallelo, isolare i cerotti del pagatore e congelare i campioni di tessuto.

Nei blocchi OCT, sezione criogenica, i campioni si marcano con anticorpi contro i marcatori di superficie specifici del tipo di cellula e quindi vengono visualizzati mediante microscopia laser a scansione confocale presi insieme. Questi metodi quantificheranno le cellule B, le cellule T e le cellule dendritiche in compartimenti specifici all'interno dei tessuti del cerotto del pagatore. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché i tessuti del cerotto PI sono estremamente fragili e possono essere facilmente danneggiati.

Durante la manipolazione. Stendere l'intestino tenue appena isolato su un letto di carta assorbente umida o salviette Kim. Quindi bagnare delicatamente l'intestino tenue con soluzione fisiologica per prevenire la disidratazione dei tessuti.

Ora, identifica visivamente i singoli cerotti pagatori situati sul lato anti-mesenterico dell'intestino. In genere, un singolo topo ha da cinque a 10 patch di pagatori visibili che sono distribuite uniformemente dal duodeno all'ileo. L'uso di forbici chirurgiche curve generalmente asporta i cerotti del singolo pagatore.

Metterli nella soluzione di smistamento dell'equilibrio della matassa fredda, mantenendo il tessuto a quattro gradi Celsius per preservare la vitalità cellulare. Quindi, trasferire i cerotti del pagatore in cinque millilitri di mezzo di dissociazione della milza e agitare a 250 giri/min per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, per generare una sospensione a singola cellula, posizionare il campione su un colino sterile a rete di nylon da 70 micron e macinare con forza il tessuto nella rete utilizzando la base di uno stantuffo da una siringa da un cc per rimuovere gli aggregati cellulari rimanenti.

Decantare la sospensione cellulare attraverso una seconda cella da 70 micron, filtrare e raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 o 50 millilitri. Erogare 10 celle per pozzetto in una cella di pellet con piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti mediante centrifugazione per cinque minuti a 1000 volte. G.Quindi decantare il surnatante capovolgendo delicatamente la piastra.

Ora risospendere le cellule nel tampone di blocco FC e incubare su ghiaccio per 15 minuti. Successivamente, aggiungere gli anticorpi coniugati Fluor direttamente alle sospensioni cellulari alla diluizione desiderata e incubare su celle di lavaggio con ghiaccio con 100 microlitri di tampone di flusso. Quindi risospendere le cellule in 400 microlitri di tampone di fissazione per analizzare le cellule mediante citometria a flusso per isolare i cerotti per la criosezione.

Tagliare segmenti trasversali di 0,5 centimetri di intestino tenue contenenti un singolo cerotto del pagatore. Trasferire il fazzoletto in una piastra di Petri contenente PBS. Quindi posizionare verticalmente i segmenti di tessuto intestinale all'interno di stampi di base contenenti OCT.

Immergere gli stampi nell'azoto liquido e lasciare che il tessuto si congeli completamente. Rimuovere gli stampini di base congelati dall'azoto liquido usando una pinza. Lasciare che lo stampo si riscaldi a temperatura ambiente il tempo necessario affinché i bordi del blocco OCT si ammorbidiscano.

Quindi rimuovere il blocco congelato di OCT dallo stampo. Capovolgere lo stampo e premere delicatamente sul retro per espellere il blocco su un pezzo di carta stagnola pulito di quattro centimetri per quattro. Avvolgere immediatamente il fazzoletto nella pellicola e collocare in un sacchetto per campioni etichettato conservato in azoto liquido o su criosezione di ghiaccio secco il tessuto utilizzando un microtomo criogenico LI a CM 3 0 5 0 s o equivalente.

Impostare la temperatura della camera sul criostato a meno 21 gradi Celsius. Taglia idealmente sezioni di spessore da 12 a 14 micron. Raccogli le sezioni su vetrini da microscopio Supercross plus.

Ispezionare visivamente i campioni utilizzando un microscopio ottico standard a bassa potenza. Immergere i vetrini in acetone per due minuti. Tenere presente che l'incubazione prolungata può causare il distacco dei tessuti dal vetrino.

Lavare i campioni tre volte con PBST. Quindi circonda le sezioni con una penna idrofobica per immagini. Ora incubare i campioni in un tampone a blocchi, sovrapporre le sezioni di tessuto con una soluzione di anticorpi primari.

Asciugare l'area intorno alle sezioni utilizzando salviette Kim o altro tessuto assorbente senza toccare le sezioni di tessuto effettive. Utilizzando una pipetta o un contagocce, posizionare delicatamente una goccia di terreno di montaggio in oro prolungato direttamente sulla sezione. Applicare un vetrino coprivetro, evitando bolle d'aria e tamponando il montaggio in eccesso.

L'analisi fax media di sospensioni monodisperse di celle patch total payers rivela una chiara distinzione tra preparazioni cellulari buone e cattive in preparazioni cellulari buone. Con una vitalità superiore all'80%, la stragrande maggioranza delle cellule dimostra un'elevata dispersione in avanti, che indica un elevato volume cellulare e una bassa dispersione laterale coerente con una bassa granularità cellulare. In questo esperimento, è stata deliberatamente preparata una scarsa preparazione cellulare per dimostrare che in una popolazione cattiva, la maggior parte delle cellule mostra un basso FSC, un alto SSC e sono al di fuori dell'andatura indicata R uno.

Queste cellule sono probabilmente in fase di apoptosi e/o necrosi. Ecco un cocktail di un massimo di quattro diversi Fluor. Quattro anticorpi monoclonali coniugati per discriminare tra una varietà di tipi di cellule.

Nei pagatori sono state utilizzate sospensioni a singola cellula per l'etichettatura con un cluster di marcatori di differenziazione. Il CD 19 e il B 20 rivelano che le cellule B costituiscono circa il 60% dei pagatori gated. I sottogruppi di cellule T specifiche della popolazione di cellule patch possono essere facilmente enumerati mediante doppia marcatura con anticorpi contro CD tre e CD quattro, o CD tre e CD otto, le cellule T CD quattro positive e CD otto positive costituiscono rispettivamente circa il 23% e il 9% del totale delle cellule patch del pagatore.

I sottoinsiemi di DC, che sarebbero CD 11 C positivi e CD 1 0 3 positivi possono anche essere enumerati con questo metodo. I CD 11 C positivi contribuiscono a circa l'8% della popolazione totale recintata, che equivale all'incirca a 10.000 dcs per patch di pagatori. Tra la popolazione di cellule C positive per CD 11, circa il 4,7% era doppio positivo per B 20 positivo.

Risultati simili si ottengono quando le cellule patchate dai pagatori vengono raccolte da topi C 57 neri a sei. Una scarsa preparazione cellulare può portare a risultati altamente fuorvianti, in gran parte perché le cellule morte o morenti tendono a legare gli anticorpi in modo non specifico. Tipicamente, questi portano a una sovrarappresentazione di B 2 2 0 cellule positive e CD tre cellule doppie positive positive, nonché B due cellule B 20 positive e CD quattro cellule T positive cellule doppie positive.

Le sezioni criogeniche del patch per topi sono suscettibili di analisi istopatologica e di marcatura immunologica. Mentre la potenza delle sezioni fornisce una maggiore risoluzione a livello cellulare quando colorate da h ed e, le zone chiare e scure dei centri germinali del patch di pagatori sono più facilmente delimitate nelle sezioni di sezione criogenica. In questa tipica sezione criogenica del cerotto del pagatore, anti CD tre anticorpi, etichettare le cellule T anti anticorpi CD 11 C.

Evidenzia le cellule dendritiche e gli anticorpi anti B due 20. Evidenzia le cellule B Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori del settore per capire come tipi di cellule specifiche, come le cellule dendritiche all'interno dei tessuti linfoidi associati all'intestino, rispondono agli antigeni intestinali e ai patogeni microbici.

Queste informazioni hanno influenzato la progettazione e lo sviluppo di vaccini per mucosa