Name: Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in Aplysia californica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Scopri l'identificazione extracellulare di neuroni motori per il controllo motorio in Aplysia californica. Questa tecnica elettrofisiologica consente di monitorare l'attività neuronale durante i pattern motori di alimentazione.

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<ol><li>McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+relationships+of+the+cerebral+giant+cells+with+motoneurones+in+the+feeding+system+of+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).</li>
<li>Benjamin, P. R., Rose, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+generation+of+bursting+in+the+feeding+system+of+the+snail%2C+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis.</a> J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).</li>
<li>Peters, M., Altrup, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+organization+in+pharynx+of+Helix+pomatia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Motor organization in pharynx of Helix pomatia.</a> J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).</li>
<li>Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+motoneurons+in+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%3A+immunocytochemical%2C+morphological%2C+and+physiological+characterizations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations.</a> J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).</li>
<li>Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+extracellular+stimulation+of+individual+neurons+in+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Eng%22%5BJournal%5D)">Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia.</a> J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+diverse+neuropeptide+cotransmitters+by+identified+motor+neurons+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).</li>
<li>Church, P. J., Lloyd, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+multiple+identified+motor+neurons+recorded+intracellularly+during+evoked+feedinglike+motor+programs+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia.</a> J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).</li>
<li>McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Preparation+for+Eliciting+and+Recording+Feeding+Motor+Programs+with+Physiological+Movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica.</a> J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).</li>
<li>Cullins, M. J., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode+fabrication+and+implantation+in+Aplysia+californica+for+multi-channel+neural+and+muscular+recordings+in+intact%2C+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals.</a> J Vis. Exp. (40), e1791(2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+or+loose+coupling+between+components+of+the+feeding+neuromusculature+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).</li>
<li>Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+pattern-initiation+and+motor+functions+in+the+B31+and+B32+neurons+of+the+buccal+ganglia+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica.</a> J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+activity+in+motor+neurons+that+produce+radula+movements+distinguishes+ingestion+from+rejection+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).</li>
<li>Iles, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+synaptic+activation+of+the+fast+coxal+depressor+motoneurone+of+the+cockroach.+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana.</a> J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).</li>
<li>Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+buccal+motor+programs+elicited+by+a+cholinergic+agonist+applied+to+the+cerebral+ganglion+of+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica.</a> J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).</li>
<li>Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+patterns+of+the+B31%2FB32+pattern+initiators+innervating+the+I2+muscle+of+the+buccal+mass+during+normal+feeding+movements+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica.</a> J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).</li>
<li>Morton, D. W., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+buccal+nerve+activity+that+distinguishes+ingestion+from+rejection+can+be+used+to+predict+behavioral+transitions+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia.</a> J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).</li>
<li>Warman, E. N., Chiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+chronic+single-unit+extracellular+recording+in+freely+behaving+animals+using+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes.</a> J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).</li>
<li>Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contingent-dependent+enhancement+of+rhythmic+motor+patterns%3A+an+in+vitro+analog+of+operant+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning.</a> J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).</li>
<li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Behavioral+biology+of+Aplysia%22">Behavioral biology of Aplysia</a>. , Freeman. San Francisco. (1979).</li>
<li>Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+organization+of+the+buccal+system+in+Aplysia+californica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica.</a> J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outputs+of+radula+mechanoafferent+neurons+in+Aplysia+are+modulated+by+motor+neurons%2C+interneurons%2C+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).</li>
<li>Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+connections+between+peptidergic+radula+mechanoafferent+neurons+and+neurons+in+the+feeding+system+of+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia.</a> J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).</li>
<li>Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+an+identified+histaminergic+neuron%2C+and+its+possible+role+in+arousal+of+feeding+behavior+in+semi-intact+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia.</a> J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).</li>
<li>Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cerebral-to-buccal+interneurons+implicated+in+the+control+of+motor+programs+associated+with+feeding+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia.</a> J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).</li>
<li>Jing, J., Weiss, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+variants+of+a+motor+act+in+a+modular+and+hierarchical+motor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network.</a> Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).</li>
<li>Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+neurostimulation+using+pulse+code+modulation+%28PCM%29+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips.</a> J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).</li>
<li>Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+internal+state+are+expressed+in+coherent+shifts+of+neuromuscular+activity+in+Aplysia+feeding+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior.</a> J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).</li>
<li>Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+brain+activity+with+voltage-+and+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).</li>
<li>Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFejtl%2C+M+%22Advances+in+Network+Electrophysiology+Using+Multi-Electrode+Arrays%22">Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays</a>. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Negli animali con grandi neuroni identificati, come molluschi (ad esempio, Lymnaea, Helix, e Aplysia), analisi di piscine motore è in genere fatto utilizzando la registrazione intracellulare 1,2,3,4. In questo protocollo, si descrive un processo per identificare univocamente i neuroni motori per un pool motore utilizzando una tecnica extracellulare. Abbiamo usato le misure di forza, come un esempio di questo processo. Si potrebbe anche usare EMG per misurare innervazioni muscolari. Brevement...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S671 </td><td> Biologica, certificata </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217 </td><td> Certificato ACS </td></tr><tr><td> Magnesio cloruro esaidrato </td><td> Acros Organics </td><td> 19753 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Solfato di magnesio eptaidrato </td><td> Fisher Scientific </td><td> M63 </td><td> Certificato ACS </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio diidrato </td><td> Fisher Scientifica </td><td> C79 </td><td> Certificato ACS </td></tr><tr><td> Glucosio (destrosio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td><td> BioXtra </td></tr><tr><td> MOPS buffer </td><td> Acros Organics </td><td> 17263 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Carbacolo </td><td> Acros Organics </td><td> 10824 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Soda caustica </td><td> Fisher Scientific </td><td> SS255 </td><td> Certificato </td></tr><tr><td> Acido cloridrico </td><td> Fisher Scientific </td><td> SA49 </td><td> Certificato </td></tr><tr><td> Singola canna capillare di vetro </td><td> AM Sistemi </td><td> 6150 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming-Brown micropipetta estrattore modello P-80/PC </td><td> Sutter Instruments </td><td></td><td> Incandescenza usata: FT345B </td></tr><tr><td> Smalto filo rivestito in acciaio inox </td><td> California filo sottile </td><td></td><td> 0.001D, rivestimento h </td></tr><tr><td> Delle famiglie in silicone II Colla </td><td> GE </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Duro Quick-Gel supercolla </td&gt; <td> Henkel corp. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> AM Sistemi amplificatore modello 1700 </td><td> AM Sistemi </td><td></td><td> Le impostazioni del filtro: 10-500 Hz per il nervo I2 / muscolare, 300-500 Hz per tutti gli altri nervi </td></tr><tr><td> Pulsemaster multicanale Stimolatore </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> A300 </td><td></td></tr><tr><td> Stimolo Isolator </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> A360 </td><td></td></tr><tr><td> AxoGraph X </td><td> AxoGraph scientifico </td><td></td><td> Software per le registrazioni </td></tr><tr><td> Pin del connettore d&#39;oro </td><td> Bulgin </td><td> SA3148 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Gold Connector Sockets </td><td> Bulgin </td><td> SA3149 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 in silicone elastomero </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 x 15 millimetri piatto cristallizzazione </td><td> Pyrex </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vuoto Grasso Alta </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pipetta Suggerimenti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-375D </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Modellazione argilla </td><td> Sargent Art </td><td> 22-4400 </td><td></td></tr><tr><td> Whisper pompa ad aria </td><td> Tetra </td><td> 77849 </td><td></td></tr><tr><td> Acquario Tubi </td><td> Eheim </td><td> 7783 </td><td> 12/16 mm </td></tr><tr><td> Elite Diffusore </td><td> Hagen </td><td> A962 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas Primavera Forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinza sottile </td><td> Belle SciencStrumenti elettronici </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr></tbody></table>

extracellulare identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; aplysia californica</em

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

Negli animali con grandi neuroni identificati (ad esempio molluschi), analisi di piscine motore viene fatto utilizzando tecniche intracellulari 1,2,3,4. Recentemente, abbiamo sviluppato una tecnica per stimolare extracellulare e registrare i singoli neuroni in Aplysia californica 5. Descriviamo ora un protocollo per utilizzare questa tecnica per identificare e caratterizzare motoneuroni all&#39;interno di un pool motore. Questa tecnica ha vantaggi extracellulare. Primi elettrodi extracellulari, può stimolare e registrare i neuroni attraverso la guaina 5, quindi non ha bisogno di essere rimosso. Così, i neuroni saranno più sani in esperimenti extracellulari che in quelli intracellulari. Secondo, se gangli sono ruotate di appropriate pinning della guaina, elettrodi extracellulari possono accedere neuroni su entrambi i lati del ganglio, che rende più facile e più efficace per identificare neuroni multipli nella stessa preparazione. In terzo luogo, extracellulareLAR elettrodi non devono penetrare nelle cellule, e quindi può essere facilmente spostato avanti e indietro tra neuroni, causando meno danni. Ciò è particolarmente utile quando si cerca di registrare i neuroni multipli durante ripetere schemi motori che possono persistere per qualche minuto. In quarto luogo, gli elettrodi extracellulari sono più flessibili di quelli intracellulari durante i movimenti muscolari. Elettrodi intracellulari può tirare fuori e danneggiare i neuroni durante le contrazioni muscolari. Al contrario, poiché elettrodi extracellulari pigiate delicatamente sulla guaina sopra neuroni, di solito soggiornare sopra il neurone stesso durante le contrazioni muscolari, e quindi può essere utilizzato in più preparazioni intatti. Per identificare in modo univoco i neuroni motori per un parco macchine (in particolare, la I1/I3 muscolo in Aplysia) con elettrodi extracellulari, si possono usare le funzioni che non richiedono misure intracellulari come criteri: dimensione del soma e la posizione, la proiezione assonale, e innervazione muscolare 4, 6,7. Per la piscina particolare motore utilizzato per illustrare la tecnica, abbiamo registrato da nervi vestibolari 2 e 3 per misurare proiezioni assonali, e misurato le forze di contrazione del muscolo I1/I3 per determinare il modello di innervazione muscolare per i motoneuroni singoli. Dimostriamo il processo completo della prima motoneuroni identificano con innervazione del muscolo, quindi caratterizzare la loro tempistica durante schemi motori, la creazione di un metodo semplificato diagnostico per l&#39;identificazione rapida. Il metodo più semplice e rapida diagnosi è superiore per preparazioni più intatte, ad esempio nella preparazione massa sospesa buccale 8 o 9 in vivo. Questo processo può essere applicato anche in altri autoveicoli piscine 10,11,12 in Aplysia o in altri sistemi animali 2,3,13,14.

Le figure 4 e 5 mostrano i risultati tipici per identificare due I1/I3 motoneuroni. Figura 4 mostra le registrazioni soma di un grande motoneuroni, B3, durante schemi egestive-simili e ingestive-like (figure 4C, 4D). L&#39;uno-per-uno picchi corrispondenti sul canale soma e il canale ipsilaterale BN2 (figura 4E) mostrano che la specificità di registrazione B3 soma è stata mantenuta durante modelli. B3 incendi durante il medio-tardiva fa...

Negli animali con grandi neuroni identificati (<em&gt; Ad esempio,</em&gt; Molluschi), l&#39;analisi delle piscine motore viene fatto utilizzando tecniche intracellulari<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;. Recentemente, abbiamo sviluppato una tecnica per stimolare extracellulare e registrare i singoli neuroni in<em&gt; Aplysia californica</em<sup&gt; 5</sup&gt;. Descriviamo ora un protocollo per utilizzare questa tecnica per identificare e caratterizzare motoneuroni all&#39;interno di un pool motore.

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare singoli neuroni motori appartenenti a un pool motorio mediante registrazione extracellulare, per poi monitorarli e controllarli durante i pattern motori. Questo obiettivo viene raggiunto innanzitutto posizionando la massa buccale preparata di plegia, con elettrodi ad uncino collegati ai nervi principali, in una piastra di registrazione specializzata, quindi preparando i gangli buccali e il ganglio cerebrale per stimolazioni e registrazioni extracellulari. Il secondo passaggio consiste nell'applicare elettrodi a suzione sui nervi principali e sui muscoli della massa buccale, collegare trasduttori forzati al muscolo bersaglio e posizionare elettrodi in vetro extracellulari sulla guaina dei gangli buccali.Successivamente, localizzare i neuroni motori bersaglio mediante elettrodi in vetro extracellulari. L'ultimo passaggio consiste nello stimolare e registrare extracellularmente i neuroni motori bersaglio mentre vengono misurate contemporaneamente le forze di contrazione muscolare. In definitiva, la tecnica di stimolazione e registrazione extracellulare viene utilizzata per dimostrare l'identificazione di singoli neuroni motori e della loro attività neurale durante diversi schemi motori simili all'alimentazione.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'identificazione intracellulare dei neuroni, è che le elettrodi di vetro extracellulari possono identificare e monitorare contemporaneamente più neuroni motori nello stesso preparato durante i movimenti muscolari. A dimostrare la procedura sarà Jeff McManus, un altro studente laureato del mio laboratorio. In questo procedimento, per preparare le elettrodi a succhiello, tagliare innanzitutto un pezzo di tubo in polietilene lungo circa 10 centimetri. Tenere il tubo alle due estremità e avvicinarlo molto alla fiamma prodotta dal becco di Bunsen, ruotandolo fino a quando non diventa morbido.Quindi allungare con attenzione il tubo mentre lo si allontana dalla fiamma. La parte centrale del tubo si allungherà e restringerà man mano che viene tirata; successivamente, tagliare il tubo a metà per ottenere due elettrodi sezioni. Questi elettrodi a suggente vengono generalmente applicati alle estremità recise di nervi o muscoli, anche se a volte possono essere applicati a cavallo.Dopo aver collegato gli elettrodi ad uncino sotto il microscopio, recidere il nervo buccale uno e il nervo esofageo bilateralmente nel punto di attacco alla massa buccale. Successivamente, tirare in avanti il ganglio cerebrale per spostarlo fuori dalla traiettoria del muscolo I due. Quindi effettuare un'incisione nel muscolo I due sopra il sacco ular.Estendere il taglio lateralmente e anteriormente, quindi tirare in avanti il lembo del muscolo I due per esporre il nervo ular. Tagliare i due rami RN e assicurarsi che i rami siano abbastanza lunghi da permettere l'applicazione dell'elettrodo a suggente. Continuare il taglio del I due in un ampio cerchio intorno ai gangli buccali.Avendo cura di non tagliare i nervi buccali due né i nervi buccali tre fino a quando i gangli buccali e la parte ad essi attaccata del muscolo I due possono essere completamente separati dalla massa buccale. Successivamente, tagliare i nervi buccali tre bilaterali nel punto di attacco alla massa buccale oltre il punto di fissazione dell'elettrodo ad uncino. Quindi applicare uno strato sottile di grasso da vuoto alla tacca nella bacinella di registrazione che collega la camera posteriore e la piattaforma centrale.Applicare successivamente uno strato sottile di colla cianoacrilica rapida sulla parte inferiore in vetro della camera anteriore dove verrà posizionato il massiccio buccale. Trasferire con attenzione il ganglio cerebrale, i gangli buccali e il massiccio buccale alla piastra di registrazione. Assicurarsi che nessuno degli elettrodi ad ago venga tirato eccessivamente, il che potrebbe danneggiare i nervi.Successivamente, posizionare con attenzione la massa buccale sulla colla nella camera anteriore della piastra di registrazione. Assicurarsi che la superficie ventrale sia incollata al fondo della piastra e fare attenzione a non far toccare la colla ai gangli e agli elettrodi. Successivamente, aggiungere la soluzione salina plegica alla piastra per indurre l'indurimento della colla.Quindi, sotto il microscopio, afferrare con una pinzetta la guaina del ganglio cerebrale e tirarla nella camera posteriore, assicurandosi che i CBC passino attraverso l'incisione. Successivamente fissare con spilli i nervi del ganglio cerebrale, escludendo i CBC, per evitare danni ai CBC integri.Applicare ulteriore grasso da vuoto sulle CBC in modo che la superficie superiore del grasso da vuoto sia leggermente più alta rispetto al bordo di protezione, in modo da evitare perdite tra le camere. Quindi aggiungere ulteriore soluzione salina Plegia in entrambe le camere della piastra in modo che i gangli siano completamente immersi. Per stabilizzare i gangli buccali, fissare innanzitutto le estremità dei tre BN alla base di sughero della piattaforma centrale.Poiché i nervi buccali (BN) verranno registrati utilizzando elettrodi ad uncino, i perni devono essere posizionati più distalmente rispetto ai punti di attacco degli elettrodi ad uncino; quindi fissare con perni le estremità dei nervi buccali e le loro terminazioni. Successivamente, utilizzare due perni piegati ad angolo retto a forma di uncino per distendere e ancorare i CBC in modo che non vengano danneggiati. Infine, fissare con perni i rami del nervo radiale (RN) compresi tra la camera posteriore e i gangli buccali.Il muscolo I due si troverà quindi sopra i gangli buccali; per esporre il nervo I due, utilizzare la pinzetta per afferrare il muscolo I due e tirarlo oltre i gangli buccali, quindi fissare con due puntine due angoli del muscolo I due per evitare di danneggiare il nervo I due. Successivamente, recidere il nervo I due in posizione distale rispetto al punto in cui i suoi due rami innervano il muscolo I due, rimuovere il resto del muscolo I due e ribaltare indietro il nervo I due, fissandolo con una puntina tra i due rami RN. In seguito, regolare la posizione delle puntine per allungare e aumentare la tensione nel caso in cui un nervo sia troppo lasco, oppure per ridurre la tensione se un nervo sia troppo teso.Per stabilizzare ulteriormente i gangli buccali, aggiungere altri perni sulla guaina tra i nervi. Poiché i gangli buccali sono posizionati con il lato coddle rivolto verso l'alto, ruotare i gangli buccali. Se i neuroni di interesse si trovano sul lato rostrale.Per ruotare uno dei due gangli buccali, utilizzare pinzette fini per afferrare una parte in eccesso della guaina del CBC vicina ai gangli buccali. Quindi fissare con un perno la guaina in eccesso del CBC tra il CBC e il BM tre, e aggiungere un ulteriore perno sulla guaina del ganglio buccale dal lato vicino alla camera anteriore per ridurre al minimo il movimento del ganglio buccale. Per tagliare la guaina che ricopre i gangli buccali.Utilizzare pinzette fini per afferrare la guaina sul lato vicino alla camera posteriore. Quindi rimuovere con forbici fini l'eccesso di guaina senza esporre i corpi cellulari. Per minimizzare i danni, rimuovere solo la quantità minima di guaina necessaria per visualizzare i corpi cellulari.Dopo aver tagliato la guaina dei gangli buccali, tirare il nervo iTune e i neuroni sul ganglio buccale e fissarli tra i gangli buccali e la camera anteriore. Per ruotare ulteriormente i gangli buccali e riempire l'elettrodo con soluzione salina aple, collegare l'estremità libera di un tubo di polietilene lungo da 15 a 20 centimetri, montato sulla siringa, all'estremità dell'elettrodo di vetro. Successivamente, tirare indietro lo stantuffo della siringa per riempire l'elettrodo con soluzione salina plegia.Posizionare l'elettrodo vetroso extracellulare riempito nella scanalatura del supporto sul manipolatore. Quindi utilizzare il manipolatore per posizionare la punta dell'elettrodo nella soluzione salina plegica contenente i gangli buccali. Successivamente, inserire un filo di argento, cloruro di argento nell'elettrodo per collegare il filo di registrazione e connetterlo a un cavo BNC che si collega all'amplificatore.Quindi collegare un altro filo al cavo BNC per utilizzarlo come filo di riferimento, posizionando l'altra estremità del filo nella soluzione salina di plegia. In questo passaggio, tagliare l'estremità stretta della punta dell'elettrodo a succhio in modo da farne corrispondere il diametro a quello del nervo. Il diametro interno della punta dell'elettrodo dovrebbe essere simile o leggermente inferiore al diametro del nervo, per garantire un'aderenza stretta.Poiché il nervo iTune e il RN sono molto vicini tra loro, posizionare i loro elettrodi nello stesso manipolatore per risparmiare spazio. Ruotare i due elettrodi e assicurarsi che le loro punte siano vicine tra loro. Quindi sceglierne uno per la registrazione del nervo iTune e l'altro per la registrazione del RN.Posizionare la punta dell'elettrodo nella soluzione salina plegica. Collegare l'estremità libera del tubo di polietilene sulla siringa all'elettrodo di aspirazione. Quindi utilizzare la siringa per riempire l'elettrodo con soluzione salina aple.Successivamente, avvicinare la punta dell'elettrodo all'estremità del nervo I due e utilizzare la siringa per aspirare il nervo all'interno dell'elettrodo. La lunghezza del nervo all'interno dell'elettrodo dovrebbe essere di circa 0,5-1 millimetro. Per garantire una sigillatura stretta, ripetere l'aspirazione per l'elettrodo che verrà collegato all'rn per fissare i trasduttori di forza al muscolo.Piegare l'ago curvo di ciascun punto e fissare il punto al trasduttore di forza. Afferrare delicatamente e sollevare una piccola quantità di muscolo con la pinzetta ed inserire l'ago attraverso la parte posteriore del muscolo I uno I tre fino al punto in cui l'ago è piegato. A questo punto, fissare un altro trasduttore di forza alla parte anteriore del muscolo alle ganasce.Successivamente, sollevare i trasduttori di forza fino a quando i punti di sutura non sono ben tesi, ma senza sovrastirarli per verificare ciò. Osservare la misurazione sul trasduttore di forza quando il filo di sutura presenta un certo gioco. Dopodiché, sollevare il trasduttore fino a quando la misurazione risulti leggermente superiore a questo valore di riferimento.Per individuare un neurone candidato, utilizzare il manipolatore per premere delicatamente la punta dell'elettrodo in vetro extracellulare sulla guaina al centro del soma del neurone, che rappresenta la posizione migliore per la stimolazione e la registrazione della selettività cellulare. Questa figura mostra la stimolazione extracellulare di B three e la registrazione dal soma di B three, nonché dai nervi e dalle regioni muscolari corrispondenti, dall'alto verso il basso. I canali corrispondono alle registrazioni provenienti dal soma di B three, dal BN two controlaterale, dal BN two omolaterale, dal BN three omolaterale, dalla forza di contrazione della regione anteriore del muscolo I one I three e dalla forza di contrazione della regione posteriore del muscolo I one I three.Il riquadro blu evidenzia la durata delle forze nelle regioni anteriore e posteriore del muscolo I uno I tre; B tre proietta solo sul BN due controlaterale. Qui sono riportati i registrazioni extracellulari dal soma di B tre e dai nervi in un modello motorio simile all’EST, nonché in un modello motorio simile all’ingestione. I riquadri blu indicano le fasi di protrazione e retrazione dei modelli.Le barre rosse nel canale SOMA di B tre evidenziano i potenziali d'azione registrati dal soma di B tre, mentre le barre rosse nel canale IB due indicano il momento corrispondente in cui B tre scarica nel BN due controlaterale. Durante i modelli motori del comportamento alimentare. Si noti che l'unità BN due di B tre è la più grande tra tutte le unità.Pertanto, possiamo anche rilevare le due unità BN di B tre direttamente dalle registrazioni BN due, senza registrazioni SOMA. Questa figura mostra la stimolazione extracellulare di B 43 e la registrazione dal suo soma, nonché dai nervi e dalle regioni muscolari corrispondenti, dall'alto verso il basso. I canali rappresentano le registrazioni provenienti dal soma di B 43, dal BN due controlaterale, dal BN due ipsilaterale, dal BN tre ipsilaterale, dalla forza di contrazione della regione anteriore del muscolo I uno I tre e dalla forza di contrazione della regione posteriore del muscolo I uno I tre.Il riquadro blu evidenzia le misurazioni della forza del muscolo I uno I tre durante B 43. L'attività B 43 si proietta solo sul BN due controlaterale. Di seguito sono riportate le registrazioni extracellulari dal soma di B 43 e dai nervi in un modello motorio simile all'ingestione, nonché un modello motorio simile all'ingestione.I riquadri blu indicano le fasi di protrazione e retrazione dei modelli. Le barre rosse nel canale SOMA di B 43 evidenziano i potenziali d'azione registrati dal soma di B 43, mentre le barre rosse nel canale IBN due indicano il momento corrispondente in cui B 43 scarica nel BN due controlaterale. In questi modelli, si noti che le unità di BN due di B 43 sono piccole e molto difficili da rilevare senza registrazioni sommate, ma si attivano in modo costante alla fine del programma motorio di BN due, il che fornisce un ulteriore modo per identificarle.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare singoli neuroni moderni in modo extracellulare per più scopi.

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