Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire una tecnica basata sulla PCR per quantificare l'attecchimento di cellule del donatore in un modello competitivo di trapianto di midollo osseo murino, questo si ottiene eseguendo prima il trapianto di midollo osseo in topi riceventi femmine utilizzando cellule di donatore maschile. Successivamente, il sangue periferico viene raccolto dai topi riceventi in diversi momenti e il DNA genomico viene isolato. I campioni vengono preparati per una curva standard.

Infine, la PCR in tempo reale viene effettuata con campioni standard e campioni di prova. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'attecchimento di cellule derivate da donatori maschi nei topi riceventi femmine attraverso il calcolo rispetto a una curva standard con una percentuale nota di DNA maschile rispetto a quello femminile. Il vantaggio maschile di questa tecnica rispetto al metodo esistente, come un metodo basato sulla citometria a flusso, è che è più sensibile, più economico e i campioni possono essere conservati a lungo.

Ancora più importante, la nostra tecnica è la maggior parte indipendente dalle stringhe e può essere utilizzata per qualsiasi background genomico di topi come un marcatore di superficie cellulare ben definito per differenziare la cellula donatrice dalle cellule riceventi Dopo l'eutanasia FVB nj, i topi donatori maschi e femmine sotto una cappa a flusso laminare usano piccole forbici e pinze per sezionare le ossa del femore e della tibia e metterle in una piastra di coltura tissutale da 60 millimetri contenente sei millilitri di ghiaccio freddo RPMI 1640 con il 5% di inattivazione termica. FBS usa una salvietta Kim per rimuovere i muscoli e altri tessuti e taglia entrambe le estremità di ciascun fusto osseo nel piatto. Quindi collegare l'estremità delle ossa a un ago calibro 23 collegato a una siringa da tre cc riempita con RPMI 1640 con FBS inattivato al 5% di calore e sciacquare il midollo.

Utilizzare lo stesso ago per disaggregare il tessuto del midollo osseo mediante aspirazioni ripetute. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e farla girare per cinque minuti a 400 G.Dopo aver rimosso il supernat, risospendere le cellule in un millilitro di temperatura ambiente, lisi dei globuli rossi, tamponare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti prima di aggiungere da cinque a 10 millilitri di RPMI 1640 con FBS inattivato al 5% di calore, far passare le cellule attraverso un filtro cellulare e raccogliere il flusso in un nuovo tubo. Dopo aver centrifugato le cellule per cinque minuti a 400 G e aver rimosso il surnatante, il pellet dovrebbe essere privo di colore rosso che indica la completa rimozione dei globuli rossi risospesi in 10 millilitri di RPMI 1640 con il 5% di FBS inattivato a caldo dopo aver agitato delicatamente, aggiungere una piccola aliquota a un emocitometro e contare le cellule.

Calcolare il volume di cellule necessarie per mescolarsi con le cellule femminili concorrenti con un rapporto di cinque a due per il trapianto di midollo osseo. Come passaggio finale per preparare le cellule per l'iniezione, mescolare le cellule donatrici e concorrenti, pellettare le cellule con PBS e risospendere in PBS a una concentrazione finale di cinque volte 10 al sesto per millilitro di cellule donatrici e due volte 10 al sesto per millilitro per le cellule concorrenti, da quattro a sei ore prima del trapianto di midollo osseo. Irradiare topi riceventi femmine con radiazioni gamma al cesio 1 37 a una singola dose di 11 grigi.

Posizionare i topi femmina irradiati in un sistema di contenzione per topi e iniettare le cellule miste del donatore e del concorrente attraverso la vena caudale in un volume totale di 0,1 millilitri in modo tale che ogni topo riceva cinque volte 10 al quinto donatore e due volte 10 al quinto concorrente cellule del midollo osseo per prelevare campioni di sangue. Dopo l'anestetizzazione, i topi raccolgono circa 50 microlitri di sangue in tubi rivestiti di EDTA mediante sanguinamento retroorbitale. Raccogli anche campioni da topi maschi e femmine della stessa età.

Accanto a isolare il DNA genomico da topi e topi soggetti. Per la curva standard, aggiungere circa 200 microlitri di tampone di lisi RBC a temperatura ambiente a ciascun campione di sangue e incubare per cinque minuti. Aggiungere un millilitro di PBS e centrifugare per rimuovere la maggior parte dei globuli rossi lisati.

Quindi utilizzare un kit di estrazione del DNA del sangue per isolare il DNA preriscaldando il tampone eluciano a 37 gradi Celsius. Per aumentare la resa, misurare la concentrazione di DNA di ciascun campione. Quelli con un rapporto OD due 60 a 2 80 tra 1,8 e 2,0 vengono utilizzati per ulteriori analisi.

Per impostare una curva standard, diluire il DNA maschile e femminile a una concentrazione di quattro nanogrammi per microlitro e preparare la miscela di DNA secondo queste linee guida. Impostare la piastra di reazione PCR mescolando il reagente super mix verde cyber con i primer mostrati qui e il DNA genomico. Ogni reazione da 20 microlitri contiene 400 nanomolari di ciascun primer e cinque microlitri di DNA genomico delle cellule del sangue eseguito in triplicato.

Eseguire la PCR secondo le condizioni presenti nel protocollo di testo e ottenere i valori di soglia del ciclo o CT. Calcola delta CT moltiplicato per la quantità CT alla potenza di ZY uno meno CT alla potenza di BCL due e ZY uno livelli di espressione o due alla potenza di meno delta CT genera curve standard tracciando la media del triplicato due alla potenza dei valori delta CT alla percentuale nota di DNA maschile nella miscela con un adattamento di regressione lineare mostrato. Ecco alcuni esempi di curve standard tracciate con valori medi di due alla potenza del delta CT rispetto alle percentuali di DNA maschile.

Questo grafico include una temperatura di fusione specifica per gli ampliconi BCL two e ZFY one localizzati rispettivamente a 78,5 e 88,5 gradi Celsius. BCL 2 viene utilizzato come gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA caricato in ciascuna reazione PCR. BCL: due curve di amplificazione per ogni campione standard si fondono tra loro indipendentemente dalla concentrazione di DNA maschile, indicando quantità uguali di DNA caricato.

Tuttavia, le curve di amplificazione di ZFY one sono migrate a sinistra con quantità crescenti di DNA maschile nel campione di cellule staminali ematopoietiche da topi PIM TKO hanno difetti nel ricostituire topi irradiati letalmente e, come previsto, i topi riceventi trapiantati con cellule PIM TKO avevano una percentuale molto più bassa di cellule maschili rispetto ai topi trapiantati con cellule wild type. Per convalidare il nostro metodo, abbiamo testato l'attecchimento di cellule di donatore maschile in topi femmine trapiantati, ricevendo cellule del midollo osseo da topi wild type rispetto a topi PIM triplo knockout o TKO in diversi momenti dopo il trapianto, sia sangue periferico a sei settimane che campioni di midollo osseo a 16 settimane. Sono stati analizzati Dopo aver visto questo video.

Dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il metodo basato sulla PCR per quantificare l'attecchimento di cellule del donatore in un modello competitivo di trapianto di midollo osseo marino.