Name: Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Scopri la PCR quantitativa in tempo reale per quantificare l'attecchimento cellulare del donatore in modelli murini di trapianto di midollo osseo. Questo metodo sensibile ed economico è applicabile a diversi ceppi di topi.

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Ringraziamo il Dott. Carlo Greenberg per l&#39;uso della sua macchina in tempo reale PCR. Questo lavoro è supportato da MUSC Hollings Cancer Center di avvio del fondo, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Premio alla Carriera della Fondazione per lo sviluppo, NIH 1K08HL 103780-01A1, e NIH 3P30CA138313-01S3. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o agenti di finanziamento.

1. Midollo osseo di isolamento cellulare <ol><li> Eutanasia maschi donatori FVB / NJ topi e femmine FVB / NJ topi utilizzando CO 2 metodo seguito da dislocazione cervicale. Le femmine FVB / NJ cellule di midollo osseo saranno utilizzate come cellule competitivi. </li><li> Utilizzare piccole forbici e pinze, sezionare femore e tibiaes da topi e metterli in un piatto 60 millimetri tessuto di coltura contenente 6 ml ghiacciata RPMI1640 con FBS di calore 5% inattivato. Usare tessuti Kimwipe per rimuovere muscolo e altri tessuti. Tagliare entrambe le estremità di ciascun albero osso nel piatto. </li><li> Collegare l&#39;estremità dell&#39;osso con l&#39;ago 23G in siringa da 3 cc, risciacquare midollo osseo con RPMI1640 con FBS di calore 5% inattivato nel piatto. Disaggregare i tessuti del midollo osseo da aspirazioni ripetute con lo stesso ago. Trasferire la sospensione cellulare a 15 ml provetta da centrifuga. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 min a 400 xg, rimuovere il surnatante, risospendere le cellule in 1 ml di temperatura ambiente rosso tampone di lisi delle cellule del sangue (155 mM potassium bicarbonato, cloruro di ammonio 10 mM, 0,1 mM di EDTA, pH = 7,4) e incubare a temperatura ambiente per 5 min quindi aggiungere 5-10 ml di RPMI 1640 con 5% di FBS inattivato al calore. </li><li> Far passare le cellule attraverso un colino cellula. Raccogliere il flusso attraverso una nuova provetta. Centrifugare per 5 min a 400 x g. Rimuovere il surnatante, il pellet cellulare non dovrebbe contenere alcun colore rosso. L&#39;assenza di colore rosso indica una rimozione completa di globuli rossi. Risospendere il pellet in 10 ml di RPMI1640 con FBS inattivato al calore 5%. Delicatamente vortex per assicurarsi che la sospensione cellulare è completamente uniforme. Prelevare un &#39;aliquota e contare le cellule in un emocitometro. Calcolare quanto il volume di cellule necessarie per il trapianto di midollo osseo e delle cellule aliquote abbastanza e mescolare cellule del donatore di sesso maschile con le cellule concorrenti femminili in un rapporto di 5:2. Centrifugare per 5 min a 400 xg, lavate con PBS, Risospendere in PBS alla concentrazione finale di cellule donatrici a 5 × 10 6 cellule / ml e concorrente a 2 x 10 6 </sup&gt; / ml. </li></ol> 2. Competitivo di midollo osseo <ol><li> Irradiano topi riceventi femmine (8-12 settimane di età) con radiatore 137Cs raggi gamma alla dose singola di 11Gy 4-6 ore prima del trapianto di midollo osseo. </li><li> Mettere i topi irradiati femminile in un dispositivo di immobilizzazione del mouse. Iniettare il donatore mista e cellule concorrenti con vena della coda in 0,1 ml di volume totale tale che ciascun topo riceve 5 x 10 5 cellule donatrici e 2 × 10 5 concorrente cellule di midollo osseo. </li></ol> 3. Raccolta dei campioni Coppie settimane dopo il trapianto di midollo osseo, raccogliere campioni di sangue periferico (~ 50 ml) di topo ricevente femminile di retro-orbitale sanguinamento in condizioni di anestesia. I campioni vengono raccolti in tubi rivestiti EDTA. BM campioni possono essere raccolti alla fine della sperimentazione, di solito almeno 4 mesi dopo il trapianto, con modalità identiche a prima descritte (Fase 1);% di solito 20-401 tibia cellule BM sono abbastanza per fare una quantità sufficiente di DNA. Campioni di sangue o di BM di pari età topi normali femminili e maschili sono raccolti anche per preparare la curva standard. 4. Isolamento del DNA genomico <ol><li> Aggiungere 4 × volume della camera lisi temperatura del tampone RBC (~ 200 pl) per ogni campione di sangue. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 ml di PBS, poi girare verso il basso per rimuovere la maggior parte del lisato RBC. </li><li> Isolare DNA utilizzando un kit del DNA del sangue di estrazione (kit del DNA QIAmp Sangue estrazione). Pre-riscaldare il tampone di eluizione (AE) a 37 ° C per migliorare la resa di DNA eluito. DNA di sesso maschile e femminile per la curva standard sono isolati in modo simile. </li><li> (Facoltativo) DNA genomico può essere ulteriormente purificato o concentrati usando EtOH metodo di precipitazione in presenza di 3 M acetato di sodio (pH = 5,5). I pellet di DNA vengono quindi risospese in 40-50 microlitri di acqua distillata per analisi immediatamente o conservato a -20 ° C per utilizzo futuro. </li><li> Misurare la Concentrazione DNAzione con Nanodrop ND-1000 fotometro spettri. I campioni con OD 260/280 tra 1,8-2,0 vengono utilizzati per ulteriori analisi. </li><li> Diluire con DNA DNAasi libera H 2 O a 4ng/μl in un volume totale di 50 microlitri. </li></ol> 5. Preparazione Curva standard Diluire DNA maschio e femmina DNA ad una concentrazione di 4 ng / mL, e rendere la miscela di DNA secondo la Table1 <table border="1"><tbody><tr><td> % Di DNA maschile in background Femmina </td><td> Volume (pl) di 4ng/μl DNA maschile </td><td> Volume (pl) di 4ng/μl DNA femminile </td><td> Volume totale (pl) </td></tr><tr><td> 0,2 </td><td> 1 </td><td> 499 </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 0,5 </td><td> 1 </td><td> 199 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 2,5 </td><td> 5 </td><td> 195 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 25 </td><td> 175 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 87,5 </td><td> 175 </td><td> 25 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 200 </td><td> 0 </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Preparazione del campione per la curva standard. Normali maschili e femminili FVB / NJ topi all&#39;età di 8-12wks sono stati sacrificati. Cellule del sangue e BM sono stati raccolti. DNA da cellule maschili e femminili cellule sono state isolate e risospese ad una concentrazione di 4ng/μl. I DNA maschili e femminili sono stati miscelati in rapporti diversi per generare le miscele standard del campione di DNA. 6. Real-time PCR <ol><li> Impostare la piastra di reazione PCR mediante miscelazione dei reagenti SYBR Green Supermix con primer e del DNA genomico. Il volume di reazione (20 pl) contenente 400 nM di ciascun primer e 5 microlitri di DNA genomico delle cellule del sangue (4ng/μl pl x5 = 20 ng) in ciascuna reazione. DNA samples e gli standard sono stati istituiti in triplice copia. Le sequenze dei primers sono mostrati nella Tabella 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nome del gene </td><td> Avanti </td><td> Invertire </td></tr><tr><td> Bcl2 </td><td> 5&#39;-AAGCTGTCACAGAGGGGCTA </td><td> 5&#39;-CAGGCTGGAAGGAGAAGATG </td></tr><tr><td> Zfy1 </td><td> 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA </td><td> 5&#39;-CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC </td></tr></tbody></table> Tabella 2. RT-PCR per la sequenza del primer Bcl2 murino e Zfy1. <ol start="2"><li> Effettuare reazione di PCR utilizzando Biorad iQ5 macchina PCR con le seguenti condizioni: 95 ° C 3 min, 42 cicli di amplificazione di 95 ° C per 10 sec, 58 ° C per 25 sec e 72 ° C per 15 secondi, seguito da una curva di fusione- passo. </li><li> Ottenere ciclo soglia (Ct) i valori da Bio-Rad iQ5 2.1 Sistema Standard Edition ottico. Calcola ACT (Ct Zfy1 &lt;/ Sup&gt;-Ct Bcl2) valore, e Zfy1 livello di espressione viene calcolato come valore di 2-δ Ct. </li><li> Stabilire curve standard per ogni serie di reazione con 2-ACT lettura di note miscele standard maschio / femmina. Le curve standard sono generati tracciando la media di 2-ACT valore triplicati al DNA% noto maschio nella miscela con raccordo regressione lineare. </li></ol>

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<li>Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+HSCs+and+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors.</a> Blood. 115, 2391-2396 (2010).</li>
<li>Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+candidate+testis-determining+Y+genes+%28Zfy-1+and+Zfy-2%29+are+differentially+expressed+in+fetal+and+adult+mouse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues.</a> Genes & development. 4, 63-74 (1990).</li>
<li>Grundler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+PIM+serine%2Fthreonine+kinases+in+FLT3-ITD-induced+leukemogenesis+reveals+PIM1+as+regulator+of+CXCL12-CXCR4-mediated+homing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration.</a> J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).</li>
</ol>

Noi non abbiamo interessi finanziari concorrenti di divulgare.

L&#39;obiettivo del nostro studio è quello di fornire il pubblico una tecnica PCR per quantificare l&#39;attecchimento delle cellule del donatore in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo. Diversi studi sono stati riportati con RT-PCR per rilevare le cellule del donatore in modelli di trapianto 9-10. Gruppo del Dr. Schwarzenberger primo sviluppato un modello murino di midollo osseo trapianto con real-time PCR per amplificare y-cromosoma-specifici 8. Questo metodo è stato utilizzat...

Murine midollo osseo (BM) trapianto di modello è stato sviluppato nel 1960 1. Questo modello è stato ampiamente utilizzato per lo studio di cellule staminali ematopoietiche del donatore (HSC) biologia in un mouse destinatario host. Murine midollo osseo trapianto di modello ci ha fornito preziose conoscenze sulle funzioni HSC e la loro regolazione ed è indispensabile nella ricerca HSC. Trapianto allogenico di midollo osseo trapianto di modello come C57BL/6J H2b-Balb / C H2D o modello trapianto congenic come C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 sono utilizzati in molti laboratori per studiare la funzione dei geni sull&#39;attività HSC 2, effetto di trattamento farmacologico di patologie HSC funzione 3 o il trapianto correlati, come graft-versus-host disease (GvHD) 4. Marcatori cellulari di superficie come aplotipo MHC o CD45.1 sono comunemente usati per distinguere i donatori cellule derivate da cellule destinatario-origine. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup&gt;, Balb / C e H2D B6.SJL CD45.1 sono i ceppi di topi più comunemente utilizzate nel trapianto di midollo osseo in quanto il contributo cellula donatrice può essere facilmente valutata mediante citometria a flusso misurando CD45.1 vs CD45.2 o H2b vs H2D. Tuttavia, molti altri ceppi come FVB / NJ 5 e C3H sono spesso utilizzati per generare transgenici o geneticamente topi knockout. Questi topi possono essere re-incrociata a una linea inbred e mantenuto in un ambiente misto genetico / MHC sfondo. In questi casi, la determinazione delle cellule attecchimento donatore e funzione HSC potrebbe essere difficile da donatori specifici marcatori di superficie delle cellule può non essere disponibile. Utilizzando Y-cromosoma-specifici test sul DNA per individuare le cellule del donatore di sesso maschile con macchia meridionale sesso non corrispondenti trapianto di midollo osseo è stato sviluppato dal gruppo del Dr. Miwa 6. Poi, una real-time PCR per l&#39;determina il sesso Y regione è risultato essere un metodo accurato ed altamente specifico per quantificare maLe cellule fetali nel sangue materno sistema 7. Questo concetto è stato adattato da Dr. Schwarzenberger gruppo per lo sviluppo di una real-time PCR in un modello murino di trapianto di midollo osseo per determinare cellula donatrice attecchimento 8. Abbiamo ulteriormente modificato questo metodo per la misura di attecchimento delle cellule del donatore in FVB / NJ modello trapianto di midollo osseo del mouse. Questo metodo è attualmente ampiamente utilizzata nel nostro gruppo per studiare il ruolo della chinasi PIM1 in biologia HSC.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Hyclone </td><td> SH30255.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-017 </td><td> Inattivato al calore </td></tr><tr><td> Cloruro di ammonio </td><td> MP Biomedicaals </td><td> 194806 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato di potassio </td><td> Pescatore </td><td> P184-500 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp DNA sangue minikit </td><td> Qiagen </td><td> 51106 </td><td></td></tr><tr><td> Cella filtro </td><td> Bioscienze BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> iQ SYBR Green Supermix </td><td> Biorad </td><td> 170-8882 </td><td></td></tr><tr><td> iQ5 real time PCR macchina </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spectra fotometro </td><td> Nanodrop ND-1000 </td><td> ND-1000 </td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando quantitativa real-time pcr per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murini osseo modelli di trapianto di midollo fornire un importante strumento per la misurazione di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni e geni che determinano / molecole che regolano la CSE. In questi sistemi modello di trapianto, la funzione di CSE è determinato dalla capacità di queste cellule di topi riceventi attecchire e ricostituire letalmente irradiati. Comunemente, la cellula donatrice contributo / attecchimento si misura con gli anticorpi alle proteine ​​delle cellule del donatore-specifici di superficie in citometria a flusso. Tuttavia, questo metodo dipende fortemente la specificità e la capacità del marcatore di superficie cellulare per differenziare donatore cellule derivate da cellule destinatario-origine, che possono non essere disponibili per tutti i ceppi di topo. Considerando i vari ambiti di provenienza di ceppi di topi geneticamente modificati sul mercato, questa superficie delle cellule / citometria a flusso a base di metodo presenta limitazioni significative soprattutto in ceppi di topi che mancano ben definiti marcatori di superficie di cellule del donatore separate da congenic destinatario ceLLS. Qui, abbiamo riportato un PCR-based tecnica per determinare l&#39;attecchimento delle cellule del donatore / contributo in topi riceventi di trapianto. Abbiamo trapiantato maschi donatori cellule staminali emopoietiche del midollo osseo di topi irradiati letalmente congenici femminili. Campioni di sangue periferico sono stati raccolti in diversi tempi post-trapianto punti. Campioni di midollo osseo sono stati ottenuti al termine degli esperimenti. DNA genomico è stato isolato e il gene cromosoma Y specifico Zfy1, è stato amplificato mediante PCR quantitativa in tempo reale. L&#39;attecchimento dei maschi donatori cellule derivate nei topi riceventi femminili è stato calcolato contro curva standard con percentuale nota di DNA maschile vs femminile. Bcl2 è stato usato come un gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA. I nostri dati suggeriscono che questo approccio determina affidabile attecchimento delle cellule del donatore e fornisce un metodo utile, ma semplice per misurare la ricostituzione delle cellule ematopoietiche in modelli murini di trapianto di midollo osseo. Il nostro metodo può essere eseguita di routine nella maggior parte dei laboratori perché noapparecchiature costose quali citometria di flusso è necessario.

Figura 1 e 2 mostrato esempi di curve standard tracciate con valori medi di 2-ACT contro percentuali di DNA maschile. Figura 1A mostrato specifica temperatura di fusione per Bcl2 e Zfy1 ampliconi localizzati a 78,5 ° C e 88,5 ° C, rispettivamente. Bcl2 è utilizzato come gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA caricato in ciascuna reazione PCR. Bcl2 curve di amplificazione (vedi Log) per ciascun campione standard fondersi tra loro indipendente dalla conc...

Determinare l&#39;attecchimento delle cellule del donatore rappresenta una sfida in modelli di trapianto di midollo osseo di topo che non hanno ben definiti marcatori fenotipici. Abbiamo descritto una metodologia per quantificare maschio attecchimento delle cellule del donatore nel topo femmina riceventi di trapianto. Questo metodo può essere utilizzato in tutti i ceppi di topo per lo studio delle funzioni HSC.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una tecnica basata sulla PCR per quantificare l'attecchimento delle cellule donatrici in un modello murino competitivo di trapianto di midollo osseo; ciò viene realizzato innanzitutto effettuando un trapianto di midollo osseo in topi riceventi femmina utilizzando cellule donatrici maschio. Successivamente, viene prelevato sangue periferico dai topi riceventi in diversi momenti temporali ed è isolato il DNA genomico. I campioni vengono quindi preparati per la costruzione di una curva standard.Infine, viene eseguita una PCR in tempo reale con campioni standard e campioni sperimentali. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'attecchimento di cellule provenienti da donatore maschio in topi riceventi femmine, calcolando i valori rispetto a una curva standard con una percentuale nota di DNA maschile rispetto a quello femminile. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come quelli basati sulla citometria a flusso, consiste nella maggiore sensibilità, nel minor costo e nella possibilità di conservare i campioni per un lungo periodo.Particolarmente importante, la nostra tecnica è altament

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Murine trapianto di midollo osseo è una tecnica ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi immunologici che regolano graft-versus-host disease negli esseri umani. La capacità di monitorare il traffico delle cellule T...

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

Questo video dimostra l'induzione della malattia intestinale del trapianto contro l'ospite, GvHD, in un topo ricevente irradiato letalmente utilizzando cellule staminali ematopoietiche allogeniche e linfociti T alloreattivi splenici che inducono GvHD. Questo protocollo aiuta a stabilire un modello di GvHD intestinale acuta grave per comprendere il meccanismo della malattia e sviluppare opzioni terapeutiche innovative.

Induzione della malattia del trapianto contro l'ospite in modelli murini tramite trapianto allogenico di midollo osseo e cellule spleniche

Masse di tessuto complesse, da organi di tumori, sono composti da vari elementi cellulari. Abbiamo chiarito il contributo di fenotipi cellulari all'interno di un tessuto utilizzando multi-etichettati topi transgenici fluorescenti in combinazione con multiparametrica immunofluorescenza seguita da unmixing spettrale di decifrare origine cellulare e caratteristiche cellulari basati su espressione della proteina.

Quantitative Analysis multispettrali Dopo tessuto fluorescente Trapianto per la visualizzazione delle origini cellulari, tipi e interazioni

Presentiamo un protocollo rapido e flessibile per un sistema di espressione in vivo basato su un singolo recettore delle cellule T (TCR) basato su retrovirus.  I vettori retrovirali sono utilizzati per trasdurre le cellule progenitrici del midollo osseo per studiare lo sviluppo delle cellule T e la funzione di un singolo TCR in vivo come alternativa ai topi transgenici TCR.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

Microscopia di fluorescenza intravital (IVFM) del calvarium è applicata in combinazione con i modelli genetici animali per studiare l'homing e l'attecchimento di cellule ematopoietiche in nicchie del midollo osseo (BM).

La combinazione di microscopia di fluorescenza Intravital (IVFM) con modelli genetici per studiare la dinamica di attecchimento delle cellule ematopoietiche per nicchie di midollo osseo

Questo protocollo fornisce linee guida passo dopo passo per l'impostazione di esperimenti competitivi di trapianto di midollo osseo di topo per studiare la funzione delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche senza previa purificazione delle cellule staminali mediante selezione cellulare.

Trapianti competitivi per valutare staminali ematopoietiche cellule Fitness

Questo manoscritto fornisce una descrizione della metodologia utilizzata per stabilire modelli murini di trasduzione-trapianto. Viene fornito un resoconto dettagliato degli errori tecnici da evitare durante l'esecuzione dei trapianti di midollo osseo. Dovrebbe essere acquisita una chiara comprensione dell'importanza dell'alto titolo virale, della trasfezione/trasduzione e dell'irradiazione.

Trasduzione-trapianto modello murino di neoplasia mieloproliferativa

Qui, presentiamo un protocollo per indurre e segnare la malattia in un modello di malattia xenogeneica innesto contro ospite (xenoGVHD). xenoGVHD fornisce un modello in vivo per studiare l'immunosoppressione delle cellule T umane. Inoltre, descriviamo come rilevare le cellule T umane nei tessuti con la PCR digitale come strumento per quantificare l'immunosoppressione.

Induzione e punteggio della malattia di Graft-Versus-Host in un modello di Murine Xenogeneico e quantificazione delle cellule T umane nei tessuti del topo utilizzando pcR digitale

Descriviamo tre metodi di trapianto di midollo osseo (BMT): BMT con irradiazione totale del corpo, BMT con irradiazione schermata e metodo BMT senza precondi condizionamento (BMT adottivo) per lo studio dell'ematopoiesi clonale nei modelli di topo.

Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Scopri la PCR quantitativa in tempo reale per quantificare l'attecchimento cellulare del donatore in modelli murini di trapianto di midollo osseo. Questo metodo sensibile ed economico è applicabile a diversi ceppi di topi.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo (Video) | JoVE Journal

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

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