Name: Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Impara a misurare la sintesi, l'elaborazione e il decadimento dell'RNA nelle colture cellulari eucariotiche utilizzando la marcatura metabolica con 4-tiouridina. Questo metodo aumenta dieci volte la sensibilità nel rilevare le variazioni dell'espressione genica.

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Vorremmo ringraziare Amie Regan per un&#39;attenta lettura del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da NGFN Inoltre concessione # 01GS0801, MRC comunione concessione G1002523 e NHSBT concessione WP11-05 al LD ​​e DFG concessione FR2938/1-1 alla CCF

1. Marcatura metabolica con 4 thiouridine Fare un piano dettagliato del setup sperimentale / programma, ad esempio, quando aggiungere il 4SU di coltura cellulare e quando raccogliere i campioni. Piano per almeno 5 minuti tra ogni condizione. Solo il trattamento di cellule di una condizione alla volta. Maneggiare max. 3-5 piatti in un dato momento. Maneggiare le cellule più rapidamente possibile per ridurre al minimo i cambiamenti di temperatura e livelli di CO 2. Evitare di esporre le cellule alla luce dopo 4SU viene aggiunto in quanto ciò potrebbe causare la reticolazione di RNA 4SU-etichettati per le proteine ​​cellulari. Avvio di etichettatura <ol><li> Scongelare a 4 thiouridine (4SU) subito prima dell&#39;uso e pipetta quantità necessaria di 4SU per ogni condizione in un tubo Falcon sterile. </li><li> Prendete la quantità di mezzo di coltura cellulare (5 ml per 10 cm di piatto) fuori i piatti e aggiungere al 4SU contenenti tubo Falcon e mescolare accuratamente. Rimuovere e gettare la media residua dai piatti. </li> &lt;li&gt; Applicare 4SU contenente schienale medio per i piatti. </li></ol> Fine di etichettatura <ol start="4"><li> Rimuovere coltura cellulare da cellule. Aggiungere 5 ml di Trizol per ogni piatto. Per gli esperimenti complessi, tra cui più punti o condizioni di tempo, questo passo è fatto meglio da due persone, una rimozione del mezzo, l&#39;altra aggiungendo Trizol e raccogliendo il lisato. </li><li> Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per lisi cellulare completa. </li><li> Utilizzare una pipetta da 10 ml per lavare il piatto con cura con il Trizol aggiunto. Questo favorisce la lisi cellulare completo e il recupero del campione. Maneggiare con cura, come Trizol è estremamente pericoloso al contatto con la pelle o con gli occhi! Avere antidoto per le ustioni fenolo a portata di mano (per esempio polietilenglicole 300 o 400 in alcool denaturato industriale (70:30)). Campioni di trasferimento a tubi di polipropilene. Si prega di notare che i tubi Falcon standard non resistere a queste forze elevate g). I campioni possono essere conservati a -20 ° C per almeno un mese fino RNA totale is preparato. </li></ol> 2. RNA Preparazione Utilizzo Modificata Trizol protocollo <ol><li> Aggiungere 1 ml di cloroformio (0.2 ml per ml Trizol) e agitare vigorosamente per 15 sec. Incubare a temperatura ambiente per 2 - 3 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Trasferire fase superiore acquosa (contenente l&#39;RNA) in una nuova provetta di polipropilene 15 ml. </li><li> Aggiungere ½ il volume di reazione di precipitazione sia RNA tampone e isopropanolo (3 ml per es surnatante aggiungere 1,5 ml di tampone RNA precipitazione e 1,5 ml di isopropanolo). </li><li> Mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Centrifugare brevemente (5.000 × g per 30 sec) e rimuovere residui di isopropanolo con pipetta 200 microlitri. </li><li> Aggiungere un uguale volume di etanolo 75% e agitare fino a quando il tubo stacca pellet. Evitare di romperlo in tanti piccoli pezzi come questo può rendere la rimozione di residuil difficile etanolo. </li><li> Centrifugare a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Spin down RNA brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con una pipetta 200 microlitri. Ripetere il passaggio ed eliminare l&#39;etanolo residuo con una pipetta 20 ml. Dopo questi due passaggi, senza ulteriori asciugatura del pellet dovrebbero essere eseguite. </li><li> Aggiungere 100 ml di H 2 O a 100 pg di RNA rendimento atteso e mescolare bene pipettando su e giù 5 - 6 volte per aiutare nella dissoluzione del RNA. </li><li> Sciogliere e denaturare RNA mediante riscaldamento a 65 ° C per 10 min (agitatore) ed immediatamente posto sul ghiaccio. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop, seguendo le istruzioni del produttore. Questo RNA può essere conservato a -80 ° C per almeno un mese. </li></ol> 3. Tiolo-specifica Biotinilazione di recente RNA trascritto <ol><li> Inizia con 60 - 80 mg di RNA cellulare totale. </li><li> Costituiscono etichettatura reazione. Pipettare nella seguenteordine (per RNA mcg): <ol class="lalpha"><li> 1 ml 10x Buffer Biotinilazione </li><li> 7 RNA microlitri (contenente 1 RNA mcg diluito in nucleasi H 2 O) </li><li> 2 microlitri biotina-HPDP (1 mg / ml di DMF) </li></ol></li></ol> Aggiungere sempre la biotina-HPDP scorso e mescolare immediatamente da pipettaggio. Nel caso la biotina precipita, contenuti DMF può essere aumentata a una concentrazione finale del 40%. <ol start="3"><li> Incubare a temperatura ambiente per 1,5 ore con rotazione. </li><li> Aggiungere un uguale volume di cloroformio. Mescolare energicamente. Incubare per 2-3 minuti fino a quando le fasi cominciano a separarsi e bolle iniziano a scomparire. </li><li> Centrifugare a 20.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Trasferire accuratamente la fase superiore acquosa in una nuova provetta. </li><li> Ripetere i passi 3.4 e 3.5 una volta. Si consiglia di eseguire questo passaggio in 2 ml di blocco Gel tubi pesanti fase per ridurre la perdita di RNA. </li><li> RNA precipitazione: add 1/10 del volume di 5 M NaCl e un volume uguale diisopropanolo alla fase acquosa. </li><li> Centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere un uguale volume di etanolo 75%, centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante. </li><li> Spin brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con 200 microlitri pipetta. </li><li> Spin brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con 20 microlitri pipetta. </li><li> Non permettere che l&#39;RNA si asciughino. Risospendere in 50 - 100 ml H 2 O (~ 1 ml per 1 mg di input RNA). Mescolare bene pipettando su e giù per 5-6 volte. </li><li> Verificare la qualità dell&#39;RNA mediante analisi electrophoretical per escludere la degradazione dell&#39;RNA. </li></ol> 4. Dot Blot Analisi di 4SU-incorporazione (Opzionale) Incorporazione 4SU può essere facilmente determinata da analisi dot blot di RNA biotinilato. Questo è un passaggio facoltativo che consente la risoluzione dei problemi e la stima dei tassi di incorporazione 4SU relativi a un controllo biotinilato oligo DNA. Per questo test abbiamo recommend utilizzando iodoacetyl-biotina invece di biotina-HPDP per biotinilazione di RNA 4SU-etichettati in fase 3.2. Ciò si traduce in un biotinilazione irreversibile di 4SU-RNA. Pertanto, (ad es RNeasy) possono essere utilizzati metodi basati colonna per il recupero di molto più piccole quantità di RNA biotinilato (ad esempio 5 mg). Mentre RNA biotinilato utilizzando biotina-HPDP è adatto anche per questo saggio, il segnale risultante è più debole e il rapporto segnale-rumore meno favorevole (Figura 3). <ol><li> Seguire il protocollo per 4SU-etichettatura e l&#39;isolamento di RNA cellulare totale, come descritto nelle sezioni 1 e 2. </li><li> Biotinylate 4SU marcato RNA come descritto nel capitolo 3 sostituendo biotina-HPDP con iodoacetyl-biotina ed effettuare due estrazioni cloroformio per rimuovere completamente i residui di iodoacetyl-biotina eccessivi. </li><li> Recuperare RNA biotinilati da isopropanolo / etanolo precipitazione come descritto o con un approccio basato su colonne (es RNeasy) nel caso di piccole quantità di RNA (&lt;10 mcg) Sono utilizzati. </li><li> Incubare la membrana Zeta in acqua priva di nucleasi con dondolo per 10 min. </li><li> Prendere la membrana fuori dall&#39;acqua nucleasi e rimuovere i liquidi eccessivi mettendo membrana tra due tovaglioli di carta puliti e premendo con decisione. Aria di essiccazione la membrana per 5 minuti si tradurrà in punti più belli. </li><li> Per ogni campione, preparare 20 ml di RNA 200 ng / ml usando ghiaccio freddo dot blot tampone di legame (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Applicare 5 ml di questa diluizione (cioè 1 mg di RNA) e tre successive diluizioni di 10 volte (cioè 100, 10, e 1 ng di RNA, rispettivamente) alla membrana Zeta pipettando. Pipettaggio attraverso un rack vuoto di puntali possono essere impiegati per fornire spaziatura uniformemente distribuito. In alternativa, utilizzare un apparato di dot blot secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Applicare 5 pl della biotina marcato DNA oligo a concentrazioni comprese tra 20 ng / ml a 20 pg / ml (ossia 100-0,1 ng oligo) come cont positivorol alla membrana mediante pipettaggio. Utilizzare un biotinilato, campione 4SU naive come controllo negativo. </li><li> Far asciugare la membrana per 5 min. </li><li> Incubare la membrana per 30 minuti in 40 ml di tampone di bloccaggio con dondolo. </li><li> Incubare la membrana con 10 ml di 1:1.000 streptavidina-perossidasi di rafano per 15 min (5 ml di PBS + 5 ml di 20% SDS + 10 pl streptavidina-perossidasi di rafano) </li><li> Lavare membrana due volte in 40 ml di PBS + 10% SDS (20 ml di PBS + 20 ml di 20% SDS) per 5 min. </li><li> Lavare membrana due volte in 40 ml di PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml di 20% SDS) per 5 min. </li><li> Lavare membrana due volte in 40 ml di PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 microlitri 20% SDS) per 5 min. </li><li> Rimuovere il liquido eccessivo mettendo membrana tra due tovaglioli di carta puliti e premendo su di loro con fermezza. </li><li> Visualizza legata alla membrana HRP utilizzando ECL le istruzioni del produttore. </li><li> Trasferire la membrana in pellicola plastica / sacchetto, rimuovere le bolle d&#39;aria e incubare per 2 minuti al buio. </li><li> Esporre membranapellicola per 1-5 min. </li></ol> 5. Separazione di RNA etichettati e senza etichetta Uso rivestite di streptavidina biglie magnetiche <ol><li> Calore tampone di lavaggio (3 ml per campione) a 65 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Preparare fresco 100 mM ditiotreitolo (DTT) in nucleasi H 2 O. Fatelo per decantazione 15-30 mg di polvere DTT in un ambiente pulito tubo da 50 ml Falcon collocato sulla scala ultra-fine. Pesare e aggiungere la quantità necessaria di nucleasi H 2 O. </li><li> Calore biotinilato campioni di RNA a 65 ° C per 10 minuti per denaturare ed immediatamente posto sul ghiaccio. </li><li> Luogo μMacs colonne nel supporto magnetico. Si raccomanda di non elaborare più di 12 campioni per volta (6-8 campioni sono ottimali). </li><li> Pre-equilibrare colonne MILTENYI con 1 ml di tampone di lavaggio temperatura ambiente. Questo richiederà circa 15 min. </li><li> Nel frattempo, aggiungere 100 ml di perline streptavidina a 50 - 100 ml di RNA biotinilato. Incubare a temperatura ambiente per 15 min con rotazione. </li> &lt;<html> li&gt; Se una qualsiasi delle colonne non ha avviato drenante ormai questo può essere facilitato da una leggera pressione sulla parte superiore della colonna con un dito guantato. Una volta che il flusso è avviato colonne drenano facilmente. </li><li> Applicare le RNA / branelli per le colonne. Gettare il flow-through a meno che non si desidera recuperare la frazione di RNA non marcato (vedi sezione 7). </li><li> Lavare tre volte con 0,9 ml di 65 ° C tampone di lavaggio (1 ml puntali si restringono quando pipettaggio buffer a 65 ° C). </li><li> Lavare tre volte con 0,9 ml di tampone di lavaggio temperatura ambiente. </li><li> Pipetta 700 microlitri Buffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in nuovi ml provette 2 e metterli sotto le colonne. </li><li> Eluire l&#39;RNA appena trascritto nel buffer RLT con l&#39;aggiunta di 100 ml di 100 mM DTT alle colonne. </li><li> Eseguire una eluizione secondo turno 3 minuti più tardi nella stessa provetta con l&#39;aggiunta di altri 100 ml di 100 mM DTT. </li></ol> 6. Recupero di recente RNA trascritto ontent &quot;&gt; Continua con la Pulitura MinElute RNeasy (Qiagen) protocollo seguendo le istruzioni del produttore. Elute in 25 H 2 O. concentrazioni di RNA Misura nucleasi microlitri utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Per evitare la necessità di scongelare e ricongelare RNA prima di presentare ad un saggio ad alta prestazione, si consiglia di preparare cDNA subito dopo la nuova trascritto RNA è purificato. Utilizzare 2,5 ml di RNA appena trascritto in 20 microlitri mix sintesi del DNA per la sintesi del DNA seguendo le istruzioni del produttore. Eseguire controlli di RT-PCR quantitativa utilizzando 1 : 10 diluizioni del mix cDNA Conservare RNA a -80 ° C.. 7. Recupero di Senza etichetta, Unbound RNA (Opzionale) Nel caso l&#39;RNA non associato devono essere recuperati; raccogliere e combinare il flusso passante (dopo l&#39;aggiunta della soluzione perline RNA-streptavidina alle colonne) ed il primo lavaggio per successiva precipitazione. Di solito è sufficiente per far precipitare solo il 50% del non legato RNA come this conterrà&gt; 80% del materiale di partenza. <ol><li> Aggiungere un uguale volume di isopropanolo (senza sale deve essere aggiunto come tampone di lavaggio contiene già 1 M NaCl). </li><li> Centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere un uguale volume di etanolo 75%, centrifugare a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il surnatante. </li><li> Spin brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con 200 microlitri pipetta. </li><li> Spin brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con 20 microlitri pipetta. </li><li> Non permettere che l&#39;RNA si asciughino. Risospendere in 100 ml H 2 O. Mescolare bene pipettando su e giù per 5-6 volte. Incubare a 65 ° C per 10 minuti con agitazione e trasferire direttamente su ghiaccio. </li><li> Verificare la qualità dell&#39;RNA mediante analisi electrophoretical per escludere la degradazione dell&#39;RNA. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Marcatura metabolica di nuova trascritto RNA aumenta sensibilmente la potenza delle tecnologie high-throughput, come microarrays e RNA-Seq fornendo modelli più adeguati per affrontare la questione biologica di interesse. Il presente protocollo ha subito ottimizzazione vasta. Permette&gt; 1.000 volte arricchimento di RNA appena trascritto e fornisce risultati altamente riproducibili. Il disegno sperimentale di un esperimento 4SU-tagging è di importanza cruciale come RNA trascritto appena si r...

Profili di espressione genica è uno strumento chiave utilizzata per lo studio dei processi cellulari e la rete associata complessa interazione. Studi su mRNA abbondanza sono stati in genere il metodo di scelta per ottenere intuizioni fondamentali sui meccanismi molecolari sottostanti. Lo sviluppo di microarrays intero trascrittoma-1 e, più recentemente, di sequenziamento di nuova generazione di RNA (RNA-Seq) 2-4 alimentato questo approccio. Mentre queste tecnologie hanno rivoluzionato la nostra comprensione della complessità di espressione genica cellulare, si trovano ad affrontare gravi limitazioni dovute alle proprietà intrinseche delle loro campione modello, cioè RNA cellulare totale. In primo luogo, i cambiamenti a breve termine dei livelli totali di RNA non corrispondono a variazioni dei tassi di trascrizione, ma sono intrinsecamente dipendente dalla RNA emivita delle rispettive trascrizioni. Mentre un quintuplo induzione di un trascritto di breve durata, per esempio codifica per un fattore di trascrizione, sarà prontamente rilevabile in RNA totaleentro un&#39;ora, la stessa induzione di una trascrizione vita lunga, ad esempio la codifica per un enzima metabolico, rimane praticamente invisibile. Inoltre, anche un completo spegnimento (&gt; 1.000 volte down-regulation) del tasso di trascrizione di un gene medio con un RNA emivita di cinque ore sarà semplicemente prendere cinque ore per i suoi livelli di RNA totale di diminuire solo del duplice . Pertanto, l&#39;analisi di RNA totale favorisce l&#39;individuazione di up-regolazione di trascritti di breve durata, molti dei quali codificano per fattori di trascrizione e geni con funzioni regolatrici 5. Inoltre, la vera cascata cinetica di regolazione è oscurata e segnalazione di eventi primari non può essere differenziata da secondario. Entrambi, a loro volta, possono generare una distorsione nella valle analisi bioinformatica. In secondo luogo, alterazioni nei livelli totali di RNA non può essere attribuito a cambiamenti nella sintesi di RNA o di decadenza. Misurazioni di quest&#39;ultimo richiedono approcci invasivi cellule, ad esempio bloccanti trascrizionisull&#39;uso actinomicina D 6, e il monitoraggio prolungato di continuo decadimento RNA nel tempo. Con un mRNA emivita media nelle cellule di mammifero di 5-10 ore 5,7, i livelli di mRNA della maggior parte dei geni saranno solo sono diminuiti di meno di due volte a seguito di diverse ore di arresto trascrizionale. Piuttosto queste piccole differenze determinare misurazioni grossolanamente imprecise di mRNA emivite per la maggioranza dei geni cellulari a causa della natura esponenziale delle equazioni matematiche sottostanti. Infine, mentre l&#39;RNA-Seq di RNA cellulare totale ha rivelato che circa la metà dei nostri geni sono soggetti ad eventi alternative splicing 8, la cinetica di fondo, nonché i meccanismi dinamici che guidano tessuto e contesto-specifica regolamentazione del trattamento RNA sono ancora limitate. Inoltre, il contributo di RNA elaborazione per l&#39;espressione genica differenziale, in particolare per RNA non codificanti, rimane da determinare. Complessivamente, queste limitazioni rappresentano i principali ostacoli permodellazione cinetica bioinformatica dei meccanismi molecolari sottostanti. Recentemente abbiamo sviluppato un approccio, definito ad alta risoluzione profili di espressione genica, per superare questi problemi 5,7,9. Si basa sulla marcatura metabolica di RNA appena trascritto utilizzando 4 thiouridine (4SU-tagging), un derivato uridina naturale, e offre accesso diretto alle trascrizioni appena trascritto con la minima interferenza nella crescita cellulare e l&#39;espressione genica (vedi Figura 1) 5, 10-12. L&#39;esposizione delle cellule eucariotiche ai risultati 4SU nella sua rapida diffusione, la fosforilazione di 4SU-trifosfato, e l&#39;incorporazione in RNA appena trascritto. Dopo aver isolato RNA cellulare totale, la frazione di RNA 4SU marcato è tiolo specificamente biotinilato generando un legame disolfuro tra biotina e l&#39;RNA appena trascritto. &#39;RNA cellulare totale&#39; può quindi essere quantitativamente separati in etichetta (&#39;appena trascritto&#39;) e senza etichetta (&#39;pre-existing &#39;), l&#39;RNA con elevata purezza utilizzando biglie magnetiche rivestite di streptavidina. Infine, etichettato RNA viene recuperato dalle perline semplicemente aggiungendo un agente riducente (ad esempio ditiotreitolo) scindere il legame disolfuro e libera gli RNA appena trascritto dalle perline. Recentemente trascritto RNA raffigura l&#39;attività trascrizionale di ogni gene durante il periodo di tempo di esposizione 4SU. 4SU-tagging nella scala temporale di minuti quindi fornisce una fotografia istantanea di espressione genica eucariotica e un modello ideale per a valle bioinformatici analisi (ad esempio l&#39;analisi del promotore). Nei casi in cui le condizioni di steady-state possono essere assunte, i rapporti di recente trascritto / totale, appena trascritte / senza etichetta e senza etichetta / RNA totale forniscono l&#39;accesso non invasivo per RNA precise emivita 7,13. Inoltre, è importante notare che l&#39;RNA appena trascritto purificato dopo appena 5 minuti di 4SU-tagging (5 min 4SU-RNA) è più giovane di 15 e 60 min 4SU-RNA.Quando si esegue entrambi ultra-corta e progressivamente più 4SU-tagging in una singola impostazione sperimentale combinato con RNA-Seq, la cinetica di trasformazione dell&#39;RNA vengono rivelati alla risoluzione nucleotide 9. Infine, l&#39;analisi tempo-corso di RNA appena trascritto e totale in combinazione con modelli computazionali consentono un&#39;analisi integrativa di sintesi di RNA e di decadimento 14. In conclusione, questo approccio permette l&#39;analisi diretta della dinamica di sintesi dell&#39;RNA, trasformazione e degradazione nelle cellule eucariotiche. È applicabile in tutti i principali organismi modello tra cui mammiferi, insetti (Drosophila), anfibi (Xenopus), e lievito 5,15,16. Esso è direttamente compatibile con microarray analisi 5,17, RNA-Seq 9,13,14, ed è applicabile in vivo 12,15. Qui, abbiamo dettaglio la metodologia di etichettare, isolare e purificare l&#39;RNA appena trascritto in cellule di mammifero in coltura. Inoltre, potenziometrosono discussi Al problemi e le insidie.

<table><tbody><tr><td>4-tiouridina</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>Preparare 50 mM di stock in H2O, conservare a -20 &deg; C in aliquote da 50-500 &mu; l, gettare il reagente non utilizzato, non ricongelare.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td><forte>AVVERTENZA - CORROSIVO e PERICOLOSO PER LA SALUTE!</forte> Garantire l'accesso immediato all'antidoto fenolico (PEG-Metanolo); Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td>AVVERTENZA - PERICOLOSO PER LA SALUTE</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Citrato di sodio, senza nucleasi</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>Preparare una soluzione madre 1,6 M utilizzando acqua priva di nucleasi.</td></tr><tr><td>5M NaCl Sigma</td><td></td><td>71386</td> senza nucleasi <td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>H2O senza nucleasi</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>Produrre aliquote da 1 ml in provette prive di nucleasi.</td></tr><tr>Tampone <td></td><td></td><td>di precipitazione dell'RNA</td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M citrato di sodio in acqua priva di nucleasi. Preparare in anticipo in condizioni rigorosamente prive di nucleasi. Conservare a temperatura ambiente in provette falcon da 50 ml.</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Utilizzare con acqua priva di nucleasi per preparare etanolo all'80%, conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>1 M Tris Cl privo di nucleasi, pH 7,5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>500 mM EDTA senza nucleasi, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Soluzione madre</td></tr><tr><td>10x Tampone di biotinilazione (BB)</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in acqua priva di nucleasi, fare aliquote da 1 ml.</td></tr><tr><td>Dimetilformammide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link biotina-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di biotina-HPDP in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Conservare a 4 gradi C in aliquote da 1 ml.</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Opzionale per la fase di estrazione del cloroformio.</td></tr><tr><td>Membrana Zeta</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampone</td><td></td><td></td> legante il dot blot <td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Biotina-oligo</td><td></td><td></td><td>5'-biotina, 25 nucleotidi, qualsiasi sequenza</td></tr><tr><td>Sodio dodecil solfato</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>Per 100 ml di soluzione madre al 20%, aggiungere 20 g di SDS a 80 ml di PBS pH 7-8 e regolare il volume a 100 ml. Mantenere tutte le soluzioni SDS ad alta percentuale al di sopra di 20 °C. Caldo le soluzioni leggermente dovrebbero precipitare SDS.</td></tr><tr><td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>Preparare 1 mg/ml di soluzione madre sciogliendo 50 mg di iodoacetil-biotina in 50 ml di DMF. Il riscaldamento delicato migliora la solubilizzazione. Conservare a 4 gradi C in aliquote da 1 ml. Genera una biotinilazione irreversibile e specifica per i tioli.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tampone bloccante</td><td></td><td></td> dot blot <td>Miscelare 20 ml 20% SDS con 20 ml 1 x PBS pH 7-8 e aggiungere EDTA alla concentrazione finale di 1 mM.</td></tr><tr><td>Streptavidina-rafano perossidasi </td><td>Vector Laboratories</td><td>SA5004</td><td>Conservare a -20 °C. Mescolare 10 ml 20% SDS con 10 ml 1 x PBS. Aggiungi 20 &mu; l. Streptavidina-HRP prima dell'uso. </td></tr><tr><td>Reagente ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>Utilizzare seguendo le istruzioni del produttore.</td></tr><tr><td>Pellicola Super RX, X-RA, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&mu; Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Conservare le perline a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di lavaggio <td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in H2O privo di nucleasi.</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Preparare come 100 mM di DTT in H2O senza nucleasi, preparare sempre fresco prima dell'uso.</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Memorizza colonne a 4 gradi C, componenti rimanenti del kit a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Provette in polipropilene con tappo a vite da 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Compatibile con Dimetilformammide</td></tr><tr><td>Tubi in polipropilene con tappo a vite da 2,0 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Compatibile con Dimetilformammide</td></tr><tr><td>Provette da 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatibile con Dimetilformammide</td></tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatibile con Dimetilformammide</td></tr><tr><td colspan="4">Tutte le soluzioni/reagenti devono essere conservati a temperatura ambiente se non diversamente specificato.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/VIS</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>O equivalente. Utilizzare un volume basso (1-2 &mu; l) per misure di basse concentrazioni di RNA per evitare un'eccessiva perdita di campione.</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga in polipropilene da 15 ml</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>A differenza delle provette standard da 15 ml, tollerano fino a 15.000 &#215; g</td></tr><tr><td>Centrifuga ad alta velocità</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-25</td><td>O apparecchiature equivalenti in grado di raggiungere i 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Rotore ad alta velocità</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA-16250</td><td>O attrezzatura equivalente in grado di raggiungere 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Adattatori per provette da 15 ml</td><td>Laborger&#228; te Beranek</td><td>356964</td><td>O apparecchiature equivalenti in grado di raggiungere 13.000&#215; g</td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer compact</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>Un supporto contiene 8 persone &mu; Colonne Mac.</td></tr><tr><td>Concessione per bagnomaria</td><td></td><td>SUB Aqua 5</td><td>o equivalente.</td></tr><tr><td>Scala ultrafine</td><td>A& D</td><td>GR-202</td><td>O equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>Per gel di RNA; o equivalente.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarosio gel prefabbricati</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>Per gel di RNA; o equivalente.</td></tr></tbody></table>

marcatura metabolica di rna recentemente trascritto per alta risoluzione profili di espressione genica di rna di sintesi, trattamento e decay in coltura cellulare

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

Lo sviluppo di microarrays intero trascrittoma e sequenziamento di nuova generazione ha rivoluzionato la nostra comprensione della complessità di espressione genica cellulare. Insieme a una migliore comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti, misure precise della cinetica sottostanti sono diventati sempre più importanti. Qui, questi potenti metodologie incontrano notevoli limitazioni dovute alle proprietà intrinseche dei campioni template studiano, cioè RNA cellulare totale. In molti casi cambiamenti RNA cellulare totale verificano o troppo lentamente o troppo velocemente per rappresentare gli eventi molecolari sottostanti e la loro cinetica con risoluzione sufficiente. Inoltre, il contributo delle alterazioni della sintesi dell&#39;RNA, elaborazione e decadimento non sono facilmente differenziate. Recentemente abbiamo sviluppato ad alta risoluzione-profili di espressione genica di superare queste limitazioni. Il nostro approccio si basa sulla marcatura metabolica di nuova RNA trascritto con 4 thiouridine (quindi anche denominato 4SU-tagging) seguita da una rigorosa purificazione dell&#39;RNA trascritto recente utilizzando biotinylation tiolo-specifici e biglie magnetiche rivestite di streptavidina. È applicabile ad una vasta gamma di organismi vertebrati, compresi Drosophila e lieviti. Abbiamo applicato con successo 4SU-tagging per studiare la cinetica in tempo reale delle attività di fattore di trascrizione, di fornire misure precise di RNA emivita, e ottenere nuove informazioni sulle cinetiche di trasformazione dell&#39;RNA. Infine, modellazione computazionale può essere impiegato per generare un, analisi completa integrata dei meccanismi molecolari sottostanti.

1. Materiale di partenza e di rendimenti attesi A seguito di 1 ora (ora) di 4SU-esposizione appena trascritto RNA rappresenta circa il 1-4% del totale RNA cellulare. Questa sarà la più bassa in cellule di crescita-arrestati in quanto sintetizzano più RNA per conto per la crescita cellulare / replica. Quando l&#39;etichettatura per 1 ora, si consiglia di iniziare il test con 60 - 80 mg di RNA totale. Partendo con meno di 30 microgrammi di RNA totale risultati in piccoli pellet di RNA che sono di...

L&#39;RNA cellulare totale fornisce un modello povero per studiare variazioni a breve termine in sintesi dell&#39;RNA e il decadimento nonché la cinetica di RNA processing. Qui, descriviamo marcatura metabolica di RNA trascritto recente con 4 thiouridine seguito da biotinylation tiolo-specifica e purificazione dell&#39;RNA trascritto appena consentano di superare queste limitazioni.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Questo metodo ha lo scopo di misurare in modo diretto e preciso la cinetica della sintesi, elaborazione e degradazione dell'RNA in colture di cellule eucariotiche. Le cellule vengono trattate in presenza di quattro tiouridina per etichettare metabolicamente l'RNA appena trascritto, quindi lisate le cellule marcate e purificato l'RNA cellulare totale; successivamente si effettua una donazione specifica di biotina sul gruppo tiolo per biotinilare selettivamente le molecole di RNA appena trascritte. In seguito, si utilizzano microsferette magnetiche rivestite di streptavidina per isolare gli RNA appena trascritti marcati con la tiouridina dalla preesistente popolazione di RNA, ottenendo frazioni di RNA contenenti rispettivamente RNA totale, RNA appena trascritto ed RNA preesistente non marcato.L'RNA può quindi essere sottoposto ad analisi successive, tra cui Q-R-T-P-C-R, microarray o sequenziamento di nuova generazione. Rispetto agli studi sull'RNA totale cellulare, l'analisi dell'RNA appena trascritto fornisce un aumento di circa dieci volte nella sensibilità per il rilevamento di variazioni a breve termine nell'espressione genica. Inoltre, consente misurazioni precise delle emivite dell'RNA e, per la prima volta, rivela effettivamente la cinetica del processamento dell'RNA. La marcatura metabolica dei trascritti appena sintetizzati può essere applicata con successo per svelare i meccanismi molecolari regolatori dell'espressione genica.Si può applicare anche ad altri organismi modello come ops, oph e lievito. Iniziare con un piano dettagliato dell'esperimento, prevedendo almeno cinque minuti tra ogni condizione. Scongelare il marcatore quattro tiouridina appena prima dell'uso e suddividere la quantità necessaria per ogni condizione in provette falcon sterili.Per ogni condizione di trattamento, trasferire cinque millilitri di mezzo di coltura cellulare da ogni piastra da 10 centimetri al tubo contenente quattro tiopurine e mescolare accuratamente; aspirare quindi il mezzo residuo dalle colture. Successivamente, aggiungere nuovamente alle cellule il mezzo contenente l'etichetta e incubare per il tempo definito sperimentalmente. Dopo aver rimosso il mezzo di coltura cellulare, aggiungere cinque millilitri di triolo a ogni piastra.Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per una lisi cellulare completa. Lavare attentamente la piastra con il triolo aggiunto e trasferire i campioni in provette di polipropilene, in grado di resistere alla centrifugazione a 13.000 ×g. I campioni possono quindi essere conservati a meno 20 gradi Celsius oppure utilizzati immediatamente per preparare l'RNA cellulare totale seguendo il protocollo del triolo. Iniziare con campioni di 60-80 microgrammi di RNA cellulare totale. Per la reazione di marcatura, aggiungere un microlitro di buffer biotina 10x a un microgrammo di RNA diluito in sette microlitri di acqua priva di nucleasi.Quindi aggiungere due microlitri di biotina HPDP a una concentrazione di un milligrammo per millilitro, in DMF per ogni microgrammo di RNA e mescolare immediatamente mediante pipettaggio. Se la biotina precipita, il contenuto di DMF può essere aumentato. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 1,5 ore sotto agitazione lenta, alla concentrazione finale del 40%.Successivamente, aggiungere un volume uguale di cloroformio, mescolare vigorosamente e incubare per due o tre minuti, fino a quando le fasi iniziano a separarsi e le bolle cominciano a scomparire. Centrifugare i campioni, quindi trasferire con attenzione la fase acquosa superiore in un nuovo tubo. Dopo una seconda estrazione con cloroformio, aggiungere un decimo del volume di cloruro di sodio cinque molare e un volume uguale di isopropanolo.Per precipitare l'RNA dalla fase acquosa, centrifugare per ottenere il pellet di RNA. Eliminare il soprannatante e lavare il pellet una volta con un volume uguale di etanolo al 75%; dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante. Centrifugare brevemente ed eliminare l'etanolo residuo con una pipetta da 200 microlitri.Centrifugare nuovamente ed eliminare l'etanolo residuo utilizzando una pipetta da 20 microlitri; risospendere l'RNA in 50-100 microlitri di acqua, miscelando accuratamente mediante pipettaggio. Valutare la qualità dell'RNA mediante elettroforesi per escludere degradazione dell'RNA.Equilibrare tre millilitri di tampone di lavaggio per campione a 65 gradi Celsius in un bagno termico. Denaturare anche i campioni di RNA biotinilati a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, porre immediatamente sul ghiaccio.Posizionare le colonne microm max sul supporto magnetico. Pre-equilibrare le colonne Milton e con un millilitro di tampone di lavaggio a temperatura ambiente. Nel frattempo, aggiungere 100 microlitri di perle di streptavidina all'RNA biotinilato e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti sotto rotazione.Se una delle colonne non ha iniziato a drenare, premere delicatamente sulla parte superiore della colonna con un dito guantato. Una volta avviato il flusso, le colonne si svuotano facilmente. Applicare le miscele di perle per RNA sulle colonne. Se si desidera analizzare l'RNA non marcato, raccogliere il flusso passante della frazione di RNA non marcato, quindi eseguire tre lavaggi con 0,9 millilitri di buffer di lavaggio a 65 gradi Celsius, seguiti da tre lavaggi con 0,9 millilitri di buffer di lavaggio a temperatura ambiente.Successivamente, pipettare 700 microlitri di tampone RLT in nuove provette da due millilitri e posizionarle sotto le colonne. Aggiungere 100 microlitri di DTT 100 millimolare appena preparato sulle colonne per eluire l'RNA appena trascritto nel tampone RLT. Dopo tre minuti, aggiungere altri 100 microlitri di DTT 100 millimolare sulla colonna e raccogliere l'EENT nella stessa provetta.Proseguire con il protocollo di purificazione RN easy mini loot come descritto nelle istruzioni del produttore: aggiungere 25 microlitri di acqua priva di nucleasi alla colonna e posizionare le colonne nei tubi per la centrifuga. Dopo una centrifugazione di un minuto, rimuovere le colonne dai tubi e determinare le concentrazioni di RNA mediante uno spettrofotometro nano drop. Si tenga presente che le misurazioni spettrofotometriche di RNA appena trascritto non sono molto affidabili e tendono a sovrastimare il contenuto reale di RNA.Per evitare la necessità di scongelare e ricongelare l'RNA prima di sottoporlo a un saggio ad alto rendimento, si raccomanda di preparare il cDNA immediatamente dopo la purificazione dell'RNA appena trascritto. Utilizzare 2,5 microlitri del modello di RNA appena trascritto in una reazione di sintesi del cDNA da 20 microlitri seguendo le istruzioni del produttore. Diluire i campioni di cDNA da uno a dieci e analizzare cinque microlitri della diluizione di cDNA mediante Q-R-T-P-C-R.Conservare i campioni di acido nucleico CD a meno 80 gradi Celsius per determinare la concentrazione minima di quattro SU necessaria per un'efficiente purificazione dell'RNA appena trascritto, dopo il marcaggio con concentrazioni crescenti di quattro SU ed analisi mediante elettroforesi. Qui, il recupero dell'RNA appena trascritto, marcato per un'ora in fibroblasti umani primari, è aumentato notevolmente passando da 50 a 200 micromolari di quattro SU, per poi iniziare a raggiungere un plateau. In alternativa, misurare l'incorporazione di quattro SU mediante analisi dot blot sull'RNA biotinilato, utilizzando un coniugato di streptavidina e perossidasi di rafano.L'efficienza di biotinilazione del biotin. HPDP è approssimativamente tre volte inferiore rispetto a quella dell'acetyl biotin. Otto. Pertanto, uno su tre-quattro residui di su nelle trascrizioni recenti.L'RNA viene effettivamente biotinilato con biotina HPDP. Le intensità del segnale possono essere quantificate anche mediante confronto con il controllo biotinilato. Il recupero degli oligo di DNA dell'RNA appena trascritto è altamente quantitativo.Questi dati derivati da Agilent Bioanalyzer mostrano che l'RNA appena trascritto contiene quantità significativamente maggiori di trascritti lunghi non accoppiati. Infine, i tassi di incorporazione di quattro su nell'RNA appena trascritto possono essere quantificati direttamente mediante analisi spettrofotometrica. Questo richiede la precipitazione dell'RNA appena trascritto con glicogeno, isopropanolo ed etanolo.Il picco aggiuntivo a 330 nanometri riflette la velocità di incorporazione di quattro SU nell'RNA appena trascritto. Non dimenticare che lavorare con tril può essere estremamente pericoloso. Pertanto, un antidoto per le ustioni da fenolo, costituito da polietilene glicole 300 miscelato con alcol metilico industriale, nel rapporto 70 a 30, deve essere prontamente disponibile.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come etichettare metabolicamente e purificare l'RNA appena trascritto, un processo che in totale richiederà circa otto ore per sei-dodici campioni.

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Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare (Video) | JoVE Journal

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