Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133 + Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire colture cellulari derivate da pazienti da melanomi maligni e isolare cellule staminali tumorali positive CD 1 33. Ciò si ottiene preparando prima singole cellule di melanoma primario da un tessuto tumorale dopo aver depletato gli eritrociti dal pellet cellulare. Se necessario, caratterizzare la coltura cellulare primaria e depletare i fibroblasti.

Il passaggio finale consiste nell'eseguire lo smistamento magnetico delle cellule di melanoma CD 1 33 positive e CD 1 33 negative. In definitiva, questa procedura max ottimizzata è un metodo eccellente per ottenere popolazioni altamente arricchite e vitali di cellule CD 1 33 positive e CD 1 33 negative. Abbiamo utilizzato per la prima volta la tecnica per convalidare i dati insco nella medicina personalizzata, dove cerchiamo di prevedere la risposta ai farmaci dei pazienti oncologici e per questo non è possibile utilizzare una linea cellulare disponibile in commercio.

Il vantaggio principale della tecnica è che abbiamo un rapido accesso alle cellule CD1 33 positive, che sono cellule staminali tumorali putative nel melanoma maligno. La tecnica sarà presentata da Catherine Davis, un tecnico di laboratorio del mio laboratorio. Trasferire il tessuto tumorale appena isolato dall'ambulatorio al laboratorio di coltura tissutale in PBS sterile contenente l'1% di penicillina streptomicina.

Trasferire il tessuto tumorale in una capsula di Petri sterile, aspirare la soluzione in eccesso. Quindi aggiungere 500 microlitri di miscela di dissociazione e tritare il tumore in piccoli pezzi da due a quattro millimetri utilizzando bisturi sterili freschi. Ora trasferisci da due a quattro grammi di tessuto tumorale tritato in una provetta delicata max C contenente cinque millilitri di miscela di dissociazione.

Sciacquare la piastra di Petri con altri 4,5 millilitri di miscela di dissociazione e aggiungere i frammenti di tessuto rimanenti al tubo delicato max C. Chiudere il tubo, fissarlo a testa in giù sul manicotto della dissociazione ed eseguire il programma H tumore zero uno. Quindi, incubare il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius con rotazione continua alla massima velocità di esecuzione.

Ora collegare il tubo capovolto sul manicotto della dissociazione ed eseguire il programma H tumore zero due. Quindi incubare il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius in rotazione continua a 12 giri/min. Quindi, esegui il delicato programma max H tumore zero tre.

Risospendere il campione e far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micron in una provetta da 50 millilitri. Se necessario, agitare la sospensione cellulare con una punta del filtro sterile fino a quando la sospensione completa non è completa. Sciacquare il filtro cellulare con cinque millilitri di pellet medio quantum 2 6 3 la sospensione cellulare per cinque minuti a 300 g ed eliminare il surnatante.

Se il palato cellulare appare letto a causa di un'elevata quantità di tic e bugie, i globuli rossi sono i globuli rossi come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Ri-girare le cellule tumorali in quanto 2 6 3 e seminare una coltura che fa passare regolarmente le cellule quando raggiungono l'80% di confluenza. Analizzare fenotipicamente la coltura cellulare primaria utilizzando un microscopio.

Quindi raccogliere una piccola quantità della coltura cellulare primaria per l'estrazione dell'RNA dopo la sintesi di CD NA ed eseguire R-T-P-C-R con primer per il melanoma neoplastico, le cellule staminali e i geni marcatori delle cellule stromali. I geni più importanti da analizzare sono il marcatore dei fibroblasti CD 90, il melanoma e il marcatore dei melanociti lacera, il marcatore delle cellule staminali tumorali CD 1 33, il marcatore per le cellule dendritiche mature, CD 83, e un gene di housekeeping come HPRT o GAAP dh. Se l'analisi microscopica combinata e R-T-P-C-R ha rivelato un'elevata contaminazione da fibroblasti della coltura primaria del melanoma, procedere all'esaurimento dei fibroblasti utilizzando gli anti fibroblasti, le microsfere e le colonne LD.

Lavare le cellule di confluenza all'80% con PBS preriscaldato, aggiungere una quantità appropriata di Accutane e incubare fino a quando le cellule non si staccano dalla superficie di coltura. Raccogliere le cellule in un terreno quantistico 2 6 3 e trasferirle in una provetta da 50 millilitri. Enumerare le cellule, quindi centrifugare il numero richiesto di celle per cinque minuti a 300 G e da quattro a otto gradi Celsius.

Aspirare completamente il surnatante e risus. Sospendi fino a una volta 10 all'ottava cella in un tampone massimo di 350 microlitri, aggiungi 100 microlitri di reagente bloccante FCR e 50 microlitri di CD 1 33. Una biotina.

Mescolare bene e incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Lavare le celle con 10 millilitri di tampone massimo, seguito da centrifugazione per cinque minuti a 300 G e da quattro a otto gradi Celsius. Aspirare completamente il surnatante dopo un secondo lavaggio.

Risospendere il pellet di cella in 400 microlitri di tampone massimo. Aggiungere 100 microsfere antibiotina da 100 microlitri e mescolare bene, incubare a quattro-otto gradi Celsius per 15 minuti. Nel frattempo, per preparare il separatore max per la separazione magnetica, collegare il quadro max al supporto multis del separatore max.

Inserire il numero richiesto di colonne LS con le alette della colonna in avanti nel campo magnetico del quadro max. Posizionare un filtro di separazione pres in ciascuna colonna LS e un tubo di raccolta appropriato. Sotto ogni colonna, sciacquare il filtro e la colonna con un tampone massimo di tre millilitri e scartare il flusso.

Dopo aver lavato le cellule nel tampone max come descritto in precedenza, risospendere le cellule in un tampone max da 500 microlitri e applicare la sospensione cellulare sulla colonna LS preparata. Lavare tre volte con tre millilitri di tampone massimo per colonna. Raccogli il affluente totale della frazione cellulare negativa cd 1 33 non marcata.

Quindi, scartare il filtro di separazione pres. Rimuovere la colonna dal separatore e posizionarla su una provetta di raccolta adatta. Applicare un tampone massimo di cinque millilitri.

Eliminare immediatamente le celle positive CD 1 33 marcate spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna per aumentare la purezza della frazione negativa. Applicare la sospensione cellulare su una nuova colonna LS equilibrata e raccogliere la frazione negativa dell'effluente CD 1 33. Questa metastasi linfonodale resecata è stata ottenuta da un paziente con melanoma in stadio avanzato.

Dopo la dissociazione meccanica ed enzimatica del tessuto, il pellet di cellule filtrate conteneva un'elevata contaminazione con eritrociti. Successivamente, l'esaurimento dei globuli rossi ha provocato un pellet cellulare di colore marrone chiaro. Queste cellule sono state coltivate in terreno quantico 2 6 3 qui, un R-T-P-C-R di melanociti e melanoma, fibroblasti, dendritici e marcatori di cellule staminali.

I geni vengono utilizzati per verificare che le cellule abbiano avuto origine dal tumore e non dallo stroma circostante. I melanociti adulti sono serviti come cellule di controllo normali per la lacrima e la linea cellulare di carcinoma embrionale N-C-C-I-T come controllo positivo per il marcatore delle cellule staminali CD 1 33. Questi dati rivelano che alcune cellule primarie sono effettivamente positive per la lacrima e quindi di origine melanocitica.

La coltura è negativa anche per CD 83, il marcatore delle cellule dendritiche mature. È interessante notare che questa linea cellulare di melanoma esprime CD 1 33, un gene cruciale per la divisione cellulare asimmetrica e un noto marcatore di cellule staminali tumorali. Qui è mostrata una micrografia in campo chiaro di una coltura cellulare primaria altamente contaminata da fibroblasti dopo il trattamento per la deplezione dei fibroblasti, le colture rappresentano cellule di melanoma primario.

Le cellule primarie del melanoma sono state selezionate in cellule CD 1 33 positive e CD 1 33 negative. Questi dati provenienti dall'immunofluorescenza, dalla colorazione e dall'analisi western blot indicano un'elevata efficacia e purezza della selezione. L'approccio ha grandi implicazioni per la medicina personalizzata perché ora possiamo utilizzare tessuti e cellule derivati dal paziente per prevedere meglio la risposta al farmaco di ciascun paziente individualmente.

Questo metodo ci aiuterà a rispondere a domande chiave come: da dove deriva il tumore? Come si possono trattare i pazienti? E aiuterà a ridefinire meglio gli approcci di biologia dei sistemi convalidando i loro esperimenti.