Name: Cromosoma Preparazione da cellule in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Impara la preparazione dei cromosomi da cellule in coltura per analisi citogenetiche come G-banding e FISH. Questo metodo affidabile consente di isolare cromosomi da linfociti e fibroblasti per studi di biologia cellulare.

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Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato reso possibile da un finanziamento della Fondazione Patrick F. Taylor.

1. Cromosoma raccolta di cellule aderenti <ol><li> Protocollo standard <ol><li> Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (80% di confluenza), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare. Si raccomanda un minimo di 2 x 10 6 cellule. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 45 min. Usando una pipetta sterile, trasferire file multimediali da cellule in una provetta da 15 ml. Mettere da parte. </li><li> Lavare delicatamente le cellule aggiungendo 2 ml di HBSS tampone nel pallone. Tampone Swirl e poi rimuovere con una pipetta. Scartare. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina, assicurando che copre l&#39;intera superficie del pallone. Lasciare solo le cellule in tripsina per circa 2 min. Una volta che la maggior parte delle cellule sono distaccato, pipettare i media nel tubo conico indietro sulle cellule. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in aliquote da 10 ml in provette da 15 ml coniche.Centrifugare a 200 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet. </li><li> Aggiungere 10 ml di 0,075 M KCl preriscaldata a 37 ° C al pellet rimasto nel tubo conico. Tubo Vortex a velocità media per mescolare KCl e le cellule. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 10 min. Centrifugare a 200 xg per 5 min a 25 ° C. Rimuovere il surnatante (fino a circa 0,5 ml resti) e risospendere pellet. </li><li> Aggiungere con cautela 5 ml di fissativo fresco di Carnoy (3:1 rapporto di metanolo: acido acetico glaciale) alle cellule, mentre vortex. Aggiungere quindi 5 ml più di fissativo, senza vortex per un totale di 10 ml. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e sospendere nuovamente. Aggiungere 5 ml di fissativo ad ogni provetta. </li><li> Centrifugare a 200 xg per 5 min. Rimuovere le cellule surnatante e sospendere nuovamente. Aggiungere 5 ml di fissativo ad ogni provetta. Le cellule possono essere conservate a 4 ° C fino ad un anno. </li></ol></li><li> Modifica del protocollo: harvesti cromosoming di linee cellulari linfoblastoidi <ol><li> Crescere le cellule in base alle specifiche condizioni di coltura delle cellule. (Usa pallone appropriato per la quantità di cellule in coltura). Quando le cellule hanno raggiunto la fase logaritmica (circa 2 giorni dopo le cellule sono split), aggiungere 10 microlitri / ml di Colcemid al pallone di coltura cellulare. </li></ol></li><li> Modifica del protocollo: Cromosoma raccolta da sangue intero Fitoemoagglutinina (PHA), una lectina derivato dal fagiolo rosso, è un potente mitogeno per le cellule T umane 16. 72 ore dopo l&#39;aggiunta di PHA alla cultura, circa il 45% delle cellule sono in fase S. Questo rappresenta il picco di attività mitotica, ed è il punto ottimale in cui per raccogliere per gli studi cromosomici. Altri mitogeni come pokeweed (1-10 mg / ml) possono essere utilizzati nell&#39;analisi cellule B 17,18. <ol><li> Raccogliere almeno 1 ml di sangue intero in una parte superiore del tubo di sodio eparina verde. Usare entro 3 giorni dopo la raccolta. Sangue Conservare a temperatura ambiente delle Nazioni Unitetil pronto all&#39;uso. </li><li> Aliquotare 0,25 ml di sangue intero in 10 ml di mezzi RPMI completo contenente L-glutammina (siero fetale bovino 20%, 1% di penicillina / streptomicina, 1% fungizone, e 1% PHA). Coltura a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Modifica del protocollo: Cromosoma raccolta dal midollo osseo Analisi citogenetica sul midollo osseo è utile in molti disturbi ematologici maligni come l&#39;osservazione di un clone cromosomicamente anormale può essere diagnostica per un tipo specifico di leucemia. Studi cromosomiche sono utilizzati anche per valutare la progressione della malattia, come l&#39;insorgenza di crisi blastica e risposta al trattamento. Poiché le cellule del midollo osseo sono attivamente dividono, nessuno stimolo mitogeno è necessaria 9,19. Per le leucemie acute 24 e 48 hr culture sono anche impostati. <ol><li> Raccogliere almeno 1 ml di midollo osseo in una parte superiore del tubo di sodio eparina verde. Aliquotare 0,25 ml di midollo osseo in 10 ml di mezzi RPMI completo contenente L-glutammina (20% di siero bovino fetale, 1% di penicillina / streptomicina, 1% fungizone). Coltura a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Presentazione Preparazione e colorazione Solid Una rapida valutazione di una diapositiva rappresentante fornirà informazioni sulla qualità del raccolto prima di procedere ad ulteriori procedure come G-banding, FISH, CGH, o SKY. Alcuni laboratori preferiscono macchia solida alle cellule per la raccolta rapida e la valutazione dei cromosomi. In alternativa, un microscopio a contrasto di fase può essere utilizzata per questa analisi. I vetrini sono meglio preparati quando l&#39;umidità è circa il 50% e la temperatura ambiente (20-25 ° C). <ol><li> Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 min a 25 ° C. Rimuovere il surnatante fino a soli 0,3-0,5 ml resti. </li><li> Dopo aver risospeso delicatamente i pellet, pipette tre gocce della sospensione di cellule da una distanza di circa 2 in su un vetrino che è inclinato di un angolo di circa 45 ° e consentire la sospensionerotolare attraverso la diapositiva. Aggiungere una grossa goccia di fissativo fresco di Carnoy alla diapositiva. </li><li> Asciugare il retro del vetrino su un tovagliolo di carta e poi sedersi il vetrino ad asciugare per almeno 10 min. La slitta deve essere completamente asciutto. </li><li> Preparare fresco Giemsa soluzione (rapporto 3:1 di Gurr Buffer e Giemsa). Porre i vetrini in un rack per colorazione. Coprire l&#39;intera diapositiva nella soluzione colorante Giemsa. Lasciare che i vetrini rimangono nella soluzione colorante per 5 min. Sciacquare i vetrini con acqua distillata, drenare, e lasciare asciugare. </li><li> Aggiungere 4 gocce di Permount e un vetrino alla diapositiva. Assicurarsi che non vi siano bolle sotto il vetrino. L&#39;eccesso Permount può essere rimosso con un tovagliolo di carta. </li><li> Analizzare le cellule con un microscopio ottico sotto 10X e 100X ingrandimento. Se le cellule in metafase sono abbondanti e ben diffusione, le diapositive rimanenti possono essere utilizzati per altre procedure sperimentali. </li></ol> 3. G-Banding Uso tripsina e Giemsa (GTG) &lt;p&gt; La tripsina è un enzima proteolitico che denatura istoni eucromatiche nelle regioni del DNA con l&#39;attività trascrizionale maggiore risultante. A seguito di Giemsa, queste regioni appariranno come bande luminose. Cromatina altamente condensato con poca o nessuna attività trascrizionale (eterocromatina) avrà un gran parte delle sue istoni protette dalla tripsina e pertanto macchia scura seguente Giemsa. È essenziale inizialmente G-band una diapositiva a monitorare le condizioni e regolare la temporizzazione tripsina se necessario per le diapositive successive. <ol><li> Aggiungere le seguenti soluzioni a 4 vaschette Coplin. Jar # 1 = 30 ml di 1x HBSS e 4 ml di tripsina 10x (0,5%) Jar # 2 = 50 ml di 1x HBSS Jar ° 3 = 45 ml di 1x HBSS e 5 ml di siero fetale bovino Jar # 4 = 50 ml di 1x HBSS </li><li> Immergere ogni diapositiva in Jar # 1 per 5 secondi, rapido risciacquo in Jar # 2, lasciare ogni diapositiva in Jar # 3 per almeno 30 secondi, rapido risciacquo in Jar # 4 poi permettono vetrini si asciughino. </li><li> Preparare fresh Giemsa colorazione Solution (rapporto 3:1 di Gurr Buffer e Giemsa). Porre i vetrini in un rack per colorazione. Coprire l&#39;intera diapositiva nella soluzione colorante Giemsa. Lasciare che i vetrini rimangono nella soluzione colorante per 5 min. </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua distillata nello stesso ordine in cui erano macchiate. Lasciare i vetrini ad asciugare per circa 10 min. La slitta deve essere completamente asciutto. </li><li> Aggiungere 4 gocce di Permount e un vetrino alla diapositiva. Assicurarsi che non vi siano bolle sotto il vetrino. L&#39;eccesso Permount può essere rimosso con un tovagliolo di carta. </li><li> Analizzare le cellule con un microscopio ottico sotto 10X e 100X ingrandimento. Regolare la temporizzazione tripsina del resto delle diapositive sulla base dei risultati della prima slitta. </li></ol>

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</ol>

Abbiamo utilizzato il presente procedimento per il cromosoma isolamento da cellule di vari organismi, tra cui vari tipi di cellule ottenute da umano, macachi Rhesus, ratti e topi 11,20-22. Il protocollo standard è disponibile, ma alcuni passaggi chiave e variabili potrebbe essere necessario regolare per questi diversi tipi di cellule. Diversi passaggi specifici sono cruciali sia nella preparazione cromosomica e G-bande per garantire la migliore qualità dei risultati. Una delle variabili che possono influenzar...

Analisi cromosomica è una tecnica tradizionale utilizzata in tutto il mondo per diagnosticare instabilità cromosomica e riarrangiamenti che portano a malattie genetiche e tumori maligni 1,2,8,9. Inoltre, una risoluzione maggiore per la diagnosi e la ricerca di anomalie genetiche e costituzionali cancro acquisita può essere realizzato con la combinazione delle procedure citogenetiche classiche e metodologie citogenetiche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH) , e cariotipo spettrale (SKY) 14,15. Più recentemente, queste tecniche sono state utilizzate per la valutazione di instabilità cromosomica associata ricerca sulle cellule staminali. Anomalie del cariotipo come aneuploidia di cellule in coltura a lungo termine embrionali (ES) e cellule staminali di diversi organismi sono stati riportati da diversi laboratori. Recenti evidenze sostiene che alcune linee cellulari sono intrinsecamente più inclini al cromosoma instabilità indipendentemente dalle condizioni di coltura. Per questo motivo, al momento di stabilire e / o il mantenimento di linee di cellule staminali umane Rhesus, mouse, o, analisi cromosomica è raccomandata come parte del processo di controllo di qualità. Molti rapporti descrivono il crescente interesse per l&#39;uso di routine e citogenetica molecolare per monitorare la stabilità cromosomica di cellule staminali e cellule maligne o vari organismi in coltura 10-13. Questi protocolli sono sempre più utilizzati dai laboratori non genetici per una rapida valutazione cromosomica delle loro cellule in coltura 13. Presentiamo nostre procedure di base per la preparazione cromosoma da vari tipi di cellule, che possono essere applicate per entrambi gli scopi e le cellule clinici e di ricerca derivati ​​da vari organismi.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Compresse tampone "GURR"</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Caledon Laboratorio Sostanze chimiche</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

cromosoma preparazione da cellule in coltura

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Cromosoma (citogenetica) analisi è ampiamente utilizzato per il rilevamento di instabilità cromosomica. Quando seguito da G-banding e le tecniche molecolari come ibridazione in situ fluorescente (FISH), questa analisi ha la potente capacità di analizzare le singole celle per le aberrazioni che coinvolgono gli utili o le perdite di porzioni del genoma e riarrangiamenti che coinvolgono uno o più cromosomi. Negli esseri umani, anomalie cromosomiche si verificano in circa 1 ogni 160 nati vivi 1,2, il 60-80% di tutti gli aborti spontanei 3,4, il 10% dei nati morti 2,5, il 13% degli individui con malattia cardiaca congenita 6, 3-6% dei casi di infertilità 2, e in molti pazienti con ritardo dello sviluppo e difetti di nascita 7. Analisi citogenetica di malignità è abitualmente utilizzato dai ricercatori e clinici, come osservazioni di anomalie cromosomiche clonali hanno dimostrato di avere sia un significato diagnostico e prognostico 8,9.60; isolamento Cromosoma è prezioso per la terapia genica e la ricerca sulle cellule staminali degli organismi inclusi primati non umani e roditori 10-13. I cromosomi possono essere isolate da cellule di tessuti vivi, compresi i linfociti del sangue, fibroblasti cutanei, amniociti, placenta, midollo osseo, e campioni tumorali. I cromosomi sono analizzati nella fase metafase della mitosi, quando sono più condensati e quindi più visibile. Il primo passo della tecnica di isolamento cromosoma comporta la rottura delle fibre del fuso mediante incubazione con Colcemid, per evitare che le cellule di procedere alla fase successiva anafase. Le cellule sono poi trattate con una soluzione ipotonica e conservati nel loro stato gonfio di fissativo di Carnoy. Le cellule vengono poi trascinati nella vetrini e possono quindi essere utilizzati per una varietà di procedure. G-banding comprende il trattamento tripsina seguita da colorazione con Giemsa per creare luce caratteristico e bande scure. Lo stesso procedure isolare cromosomi può essere utilizzato per la preparazione di cellule per procedure quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY) 14,15.

Spread metafase alta qualità sono essenziali per l&#39;analisi cromosomica. Un test riuscito produce cromosomi che sono ben diffuse e di adeguata morfologia cromosoma. Cromosomi Correttamente G-banda contengono la luce caratteristico e modelli di bande scure. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Figura 1. Una diffusione cromosomico succ...

I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere e preparare i cromosomi per la colorazione GB e per test citogenetici molecolari. In primo luogo, coltivare le cellule fino alla fase logaritmica. Successivamente, raccogliere i cromosomi utilizzando smid, un ipotonico e un fissativo.Lasciare cadere la sospensione cellulare sui vetrini. Colorare un vetrino. Come controllo della preparazione cromosomica, procedere alla bandeggio GB o alle tecniche molecolari sui vetrini rimanenti.Come passo finale della bandeggio GB, analizzare i cromosomi mediante microscopia ottica e cariotipizzazione. In definitiva, i cromosomi e i nuclei saranno disponibili per la cariotipizzazione o per l'FISH. L'idea iniziale di pubblicare questo metodo è nata a causa dell'elevata richiesta da parte di altri ricercatori che chiedevano assistenza nel rilevamento dell'instabilità cromosomica in diversi tipi di cellule provenienti da vari organismi e per successivi test citogenetici molecolari.Questa tecnica è essenziale per la diagnosi e, in ultima analisi, per la prognosi di molte malattie genetiche congenite, inclusi i tumori, perché consente la visualizzazione di riarrangiamenti cromosomici, che hanno val

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Cariotipo è una tecnica semplice e utile ampiamente utilizzato per la rilevazione di alterazioni genetiche. Qui si descrive un passo dal protocollo passo per la preparazione diffusione cromosoma di cellule staminali embrionali umane per monitorare lo stato cromosomico di queste cellule mantenute in coltura.

Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo

Un metodo per l'analisi quantitativa di temporizzazione cromosoma replica è descritto. Il metodo utilizza incorporazione di BrdU in combinazione con...

Cromosoma Timing Replica combinazione con fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione

Percorsi di riparazione del DNA sono essenziali per il mantenimento dell'integrità genomica e prevenire la mutazione e il cancro. L'obiettivo di questo protocollo è quello di quantificare l'instabilità genomica mediante l'osservazione diretta di aberrazioni cromosomiche in metafase si diffonde dalle cellule B del mouse utilizzando ibridazione in situ fluorescente (FISH) per ripetizioni telomeriche del DNA.

Analisi rapida di aberrazioni cromosomiche in linfociti B mouse da PNA-FISH

I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.

Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi

Viene descritto un protocollo per la preparazione di diffusioni cromosomiche vegetali mitotiche di alta qualità con un metodo di goccia veloce all'aria adatto per la rilevazione FISH di sonde di DNA singole e ad alta copia.

Un rapido aria secca cadente Cromosoma Metodo di preparazione adatto per i pesci nelle piante

Questo protocollo descrive le tecniche per la quantificazione e la caratterizzazione delle aberrazioni cromosomiche in vitro in RAW264.7 macrofagi di topo dopo il trattamento con particolato nell'aria ambiente.

L&#39;analisi del particolato ambientale indotto aberrazioni cromosomiche L&#39;utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; sistema

Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

La combinazione di preparazioni di alone di DNA con ibridazione fluorescenza in situ consente un'analisi ad alta risoluzione delle interazioni genomiche con il nucleoscheletro. Il genoma attaccato porta a segnali fluorescenti ibridati situati all'interno dei nuclei residui estratti, mentre il genoma non attaccato è nell'alone di DNA che circonda i nuclei residui.

Ibridazione fluorescenza in situ su preparati di alone di DNA per rivelare interi cromosomi, telomeri e loci genici

Hi-C 3.0 è un protocollo Hi-C migliorato che combina crosslinker di formaldeide e disuccinimidil glutarato con un cocktail di enzimi di restrizione DpnII e DdeI per aumentare il rapporto segnale-rumore e la risoluzione del rilevamento dell'interazione cromatina.

Acquisizione della conformazione cromosomica su scale di lunghezza

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

Impara la preparazione dei cromosomi da cellule in coltura per analisi citogenetiche come G-banding e FISH. Questo metodo affidabile consente di isolare cromosomi da linfociti e fibroblasti per studi di biologia cellulare.

Cromosoma Preparazione da cellule in coltura

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