Cromosoma Preparazione da cellule in coltura
28 gennaio 2014
I cromosomi possono essere isolate da cellule vive come linfociti o fibroblasti cutanei, e da organismi compresi gli esseri umani o topi. Queste preparazioni cromosomiche possono essere ulteriormente utilizzati per routine di G-banding e le procedure di citogenetica molecolare quali la ibridazione in situ fluorescente (FISH), ibridazione genomica comparativa (CGH), e cariotipo spettrale (SKY).
L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere e preparare i cromosomi per la colorazione GB e per test citogenetici molecolari. In primo luogo, coltivare le cellule fino alla fase logaritmica. Successivamente, raccogliere i cromosomi utilizzando smid, un ipotonico e un fissativo.
Lasciare cadere la sospensione cellulare sui vetrini. Colorare un vetrino. Come controllo della preparazione cromosomica, procedere alla bandeggio GB o alle tecniche molecolari sui vetrini rimanenti.
Come passo finale della bandeggio GB, analizzare i cromosomi mediante microscopia ottica e cariotipizzazione. In definitiva, i cromosomi e i nuclei saranno disponibili per la cariotipizzazione o per l'FISH. L'idea iniziale di pubblicare questo metodo è nata a causa dell'elevata richiesta da parte di altri ricercatori che chiedevano assistenza nel rilevamento dell'instabilità cromosomica in diversi tipi di cellule provenienti da vari organismi e per successivi test citogenetici molecolari.
Questa tecnica è essenziale per la diagnosi e, in ultima analisi, per la prognosi di molte malattie genetiche congenite, inclusi i tumori, perché consente la visualizzazione di riarrangiamenti cromosomici, che hanno valore diagnostico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui riarrangiamenti cromosomici riscontrati in vari tipi di cellule umane, può essere applicato anche a cellule di altri organismi, come le scimmie Rhésus Macaque, i ratti e i topi in coltura.
2 milioni di cellule aderenti al 80% di confluenza e aggiungere 10 microlitri di 10 microgrammi per millilitro. Col per millilitro di cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% CO2 per 45 minuti.
Quindi, utilizzando una pipetta sterile, trasferire il terreno di coltura dal contenitore in un tubo conico da 15 millilitri e conservarlo per un uso successivo. Per lavare le cellule, aggiungere due millilitri di HBSS nella fiasca, agitare delicatamente e rimuovere il tampone. Successivamente, aggiungere un millilitro di tripsina, assicurandosi che ricopra l'intera superficie della fiasca. Una volta che la maggior parte delle cellule si è staccata, pipettare nuovamente il terreno presente nel tubo conico sulle cellule.
Aliquotare 10 millilitri della sospensione cellulare in provette coniche da 15 millilitri. Centrifugare a 200 G per 10 minuti. Rimuovere il soprannatante.
Risospendere il pellet in 10 millilitri di cloruro di potassio 75 millimolari, che sarà preriscaldato a 37 gradi Celsius dopo un'incubazione di 10 minuti a 37 gradi Celsius. Centrifugare a 200 G per cinque minuti. A 25 gradi Celsius, rimuovere tutto tranne 0,5 millilitri del soprannatante e risospendere il pellet con attenzione.
Aggiungere cinque millilitri di fissativo fresco al car noise alle cellule. Quindi aggiungere altri cinque millilitri di fissativo e vortexare, centrifugare a 200 G per cinque minuti. Sospendere ogni pellet cellulare in cinque millilitri di fissativo.
Conservare le cellule a quattro gradi per un periodo massimo di un anno. Centrifugare le cellule a 200 G per cinque minuti. A 25 gradi Celsius.
Rimuovere il soprannatante fino a quando rimangono solo da 0,3 a 0,5 millilitri dopo aver risospeso delicatamente il pellet. Pipettare tre gocce della sospensione cellulare da una distanza di circa cinque centimetri su un vetrino inclinato ad un angolo di circa 45 gradi e lasciare che la sospensione scorra lungo il vetrino.
Aggiungere una grossa goccia di soluzione fissante fresca sul vetrino. Premere il retro del vetrino su un tovagliolo di carta e quindi lasciare asciugare completamente il vetrino. Preparare una soluzione sostenitrice di gim fresca.
Posizionare i vetrini su un supporto per colorazione. Coprire completamente il vetrino con la soluzione sostenitrice gim. Dopo cinque minuti, risciacquare i vetrini con acqua distillata, farli scolare e lasciarli asciugare all'aria.
Aggiungere quattro gocce di perm mount sul vetrino e posizionare un coprioggetto assicurandosi che non ci siano bolle d'aria sotto il coprioggetto. Rimuovere l'eccesso di per mount con un tovagliolo di carta. Analizzare le cellule con un microscopio ottico a un ingrandimento di 10 x e 100 x.
Se le cellule in metafase sono abbondanti e ben distese, i vetrini rimanenti possono essere utilizzati per altre procedure sperimentali. Aggiungere 50 millilitri delle soluzioni di trattamento a quattro barattoli Copeland. Immergere ciascun vetrino nel barattolo numero uno per cinque secondi successivamente.
Risciacquare rapidamente il vetrino nel barattolo numero due. Lasciarlo nel barattolo numero tre per almeno 30 secondi. Risciacquare nel barattolo numero quattro, quindi lasciare asciugare i vetrini.
Preparare una soluzione di GIM appena fatta. Posizionare i vetrini su un supporto per colorazione. Coprire completamente il vetrino con la soluzione di GIM per cinque minuti.
Risciacquare le preparazioni e l'acqua distillata nello stesso ordine in cui sono state colorate. Quindi asciugare per almeno 10 minuti. Posizionare un'immersione con montaggio permanente come mostrato in precedenza.
Quindi analizzare le cellule al microscopio ottico per i restanti vetrini. Regolare il tempo di incubazione con tripsina in base ai risultati ottenuti dal primo vetrino.
Un dosaggio riuscito produce cromosomi ben distribuiti e con una morfologia cromosomica adeguata. I cromosomi bandati con la tecnica GB presentano i caratteristici schemi di bande chiare e scure. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle modalità per isolare i cromosomi per la bandatura GB e per ulteriori analisi citogenetiche molecolari finalizzate alla chiarificazione dell'instabilità cromosomica.
Una volta padroneggiata, questa tecnica di raccolta può essere eseguita in circa tre ore se effettuata correttamente. Per la procedura di bandeggio GB, è importante testare inizialmente il tempo di incubazione con tripsina su un vetrino prima di passare al bandeggio GB. I restanti vetrini.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta la procedura per l'isolamento e la preparazione di cromosomi da cellule vive, inclusi linfociti e fibroblasti cutanei. I cromosomi preparati possono essere utilizzati per diverse tecniche citogenetiche, come la bandeggio G e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH).
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Citogenetica
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- I cromosomi possono essere isolati da cellule vive.
- Le fonti più comuni includono cellule umane e di topo.
- Le preparazioni cromosomiche sono essenziali per varie analisi citogenetiche.
- Tecniche come il bandeggio G e la FISH sono ampiamente utilizzate nella ricerca.
Scopo dello studio
- Isolare cromosomi per analisi di bandeggio G e test citogenetici molecolari.
- Fornire un metodo affidabile per la preparazione dei cromosomi.
- Facilitare ulteriori analisi mediante tecniche citogenetiche avanzate.
Metodi Utilizzati
- Coltivare le cellule fino alla fase logaritmica.
- Isolare i cromosomi utilizzando una soluzione ipotonica e un fissativo.
- Deporre la sospensione cellulare su vetrini.
- Colorare i vetrini per monitorare la preparazione cromosomica.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cromosomi da cellule in coltura.
- Preparazione adatta per tecniche di bandeggiatura G e analisi molecolari.
- Monitoraggio efficace dell'integrità cromosomica mediante colorazione.
- Applicabilità dimostrata del metodo per varie analisi citogenetiche.
Conclusioni
- Il metodo descritto fornisce un approccio affidabile per la preparazione dei cromosomi.
- Permette una serie di tecniche citogenetiche.
- La procedura è applicabile sia a cellule umane che murine.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La preparazione dei cromosomi da cellule in coltura consente il rilevamento dell'instabilità genomica, supportando la validazione del bersaglio nella ricerca oncologica e sulle malattie genetiche. Questo metodo fornisce un'elevata affidabilità predittiva identificando aberrazioni cromosomiche che informano la riduzione del rischio meccanicistica nei modelli preclinici. Costituisce un sistema rilevante per la malattia per valutare l'allineamento dei biomarcatori traducibili e le decisioni di triage del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'interrogazione di ipotesi terapeutiche attraverso la visualizzazione di riarrangiamenti cromosomici.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico rilevando guadagni, perdite e alterazioni strutturali nel genoma.
- Valore predittivo: Facilita la valutazione della fiducia sul bersaglio mediante l'analisi di anomalie cromosomiche clonali in modelli di patologie maligne.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Produce cromosomi metafasici adatti per applicazioni di bandeggio G, FISH, CGH e SKY.
- Riproducibilità: Un protocollo standardizzato di raccolta garantisce una distribuzione e una morfologia cromosomica costanti.
- Scalabilità: Consente la preparazione a partire da vari tipi cellulari, inclusi linfociti, fibroblasti e campioni tumorali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Applicabile a disturbi congeniti, infertilità, ritardo dello sviluppo e ricerca sul cancro.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica attraverso la valutazione dell'instabilità cromosomica.
- Decisioni adattate al rischio: Fornisce informazioni per prendere decisioni di avanzamento basate sul significato diagnostico e prognostico delle anomalie cromosomiche.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'analisi iniziale dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, consentendo l'analisi cromosomica in punti critici di svolta.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi citogenetica dell'instabilità cromosomica.
- Screening: Fornisce preparati cromosomici pronti per saggi, utilizzabili in tecniche molecolari successive come FISH e CGH.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti tramite cariotipizzazione e analisi dei modelli di bandeggio.
- Ricerca traslazionale: Permette la continuità preclinica consentendo il tracciamento delle aberrazioni cromosomiche nei modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile di analisi cromosomica in diversi progetti e sistemi modello.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie al rilevamento di anomalie cromosomiche diagnostiche e prognostiche.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità del reperimento di cromosomi tra diversi tipi cellulari e organismi.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie al rilevamento precoce dell'instabilità.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate sui dati sull'integrità cromosomica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare, nel trattamento ipotonico e nelle tecniche di fissazione.
- È subordinato all'accesso a centrifughe, microscopi e attrezzature per la colorazione necessarie per il bandeggio G e la FISH.
- Necessita di una standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire preparazioni cromosomiche e tecniche di stesura dei vetrini costanti.
- Le considerazioni per l'adattamento includono tempi di esposizione al colcemid e temperature della soluzione ipotonica variabili a seconda del tipo cellulare.
- I limiti pratici includono la dipendenza dall'indice mitotico e dalla corretta acquisizione di metafasi per un'analisi di successo.
