Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

Così supportato l'elettrofisiologia basata sulla membrana abbreviata in elettrofisiologia basata su SSM. È un nuovo approccio elettrofisiologico. Offre per un certo numero di applicazioni un miglioramento significativo rispetto ai metodi convenzionali.

Lo strumento principale dell'elettrofisiologia convenzionale è l'elettrodo a microparticelle riempito di elettrolita, mentre l'elettrofisiologia basata su M rileva la traslocazione di carica tramite un elettrodo a membrana solido supportato. È estremamente utile nei casi in cui l'elettrofisiologia convenzionale non può essere utilizzata, come nel caso dei trasportatori batterici, che a parte alcune rare eccezioni, non possono essere studiati con metodi di voltage clamp o patch cam. In questi casi, l'elettrofisiologia basata sull'SSM si è dimostrata molto efficace.

Può anche essere impiegato per studiare trasportatori eucariotici fisiologicamente rilevanti nelle membrane intracellulari. Ci sono molti modi per eseguire esperimenti di elettrofisiologia basati sull'SSM. Nella ricerca di base, può essere applicato per determinare i parametri cinetici e chiarire il meccanismo di trasporto, ma la sua robustezza e il potenziale di automazione lo rendono ideale per le applicazioni di screening nella scoperta di tracce.

L'elettrodo SSM trasporta un sistema di membrana composto costituito dall'SSM sottostante e dall'adozione di proteasomi o frammenti di membrana contenenti la proteina di trasporto di interesse. Le proprietà elettriche della membrana composta possono essere descritte da un circuito equivalente in cui le membrane formano un sistema accoppiato capacitivamente. Si noti che il comportamento elettrico del sistema è essenzialmente lo stesso sia che si utilizzino frammenti di membrana o liposomi di protea.

Lo spostamento di carica nella proteina di trasporto viene trasmesso al circuito di misura attraverso la capacità della membrana della vescica. Un principio di rilevamento chiamato accoppiamento capacitivo. In un tipico esperimento, lo scambio rapido di soluzioni al VSSM fornisce il substrato per la proteina di trasporto V, la conseguente attività di trasporto elettrogenico della proteina genera una corrente, che è accoppiata al sistema di misura tramite la capacità SSM.

Allo stesso tempo, l'attività elettrogenica della proteina carica gradualmente la membrana liposomiale portando ad un'inibizione della proteina di trasporto e alla corrente in declino nel circuito di registrazione, la corrente misurata è il risultato di reazioni di trasporto simultanee di milioni di liposomi di protea assorbiti dall'Enzo. Ciascuno contiene circa 100 trasportatori. La configurazione è costituita da una gabbia di Faraday con un percorso della soluzione, circuiti esterni per il controllo delle valvole, l'amplificazione del segnale, oltre all'acquisizione e all'analisi dei dati.

La gabbia EC include contenitori, valvole e tubi necessari per il controllo del flusso della soluzione, nonché un cubito con un chip XOR. Il chip XOR trasporta l'elettrodo SSM e i liposomi prot assorbiti. Il vete è collegato all'amplificatore e al generatore di funzioni del circuito elettrico esterno.

Misure SSM, fuoco scatenato, due soluzioni, una attivante e una non attivante a parte il substrato, che è presente solo nella soluzione attivante. Entrambe le soluzioni hanno la stessa composizione nella configurazione a singolo scambio. Due valvole a due vie controllano il flusso delle soluzioni di non riattivazione e di attivazione.

La valvola terminale, una valvola a tre vie accoppiata meccanicamente per tre volte, viene utilizzata per commutare tra la soluzione non attivante e quella attivante, indirizzando una delle soluzioni al contenitore dei rifiuti e l'altra soluzione al qve. Quando la valvola terminale viene commutata, il flusso della soluzione non attivante viene reindirizzato al rifiuto e la soluzione attivante fluisce verso il qve. Questa configurazione consente un flusso continuo simultaneo di entrambe le soluzioni.

In qualsiasi momento durante il protocollo di flusso, il percorso del flusso può essere ottimizzato in base alle esigenze. Tuttavia, bisogna tenere presente che la distanza tra l'SSM e la giunzione delle soluzioni non attivanti e attivanti dovrebbe essere mantenuta il più breve possibile. Poiché determina la soluzione timer dello scambio di soluzioni.

L'amplificatore di corrente all'esterno della gabbia del ponte di alimentazione è collegato a un chip sensore. In genere, questo è impostato su un'amplificazione di 10 alla potenza di otto a 10, alla potenza di nove volt per amplificatore e al tempo di riposo da uno a 10 millisecondi. All'elettrodo di riferimento è collegato un generatore di funzioni e un computer con software di controllo e acquisizione dati delle valvole e una scatola di interfaccia completano il sistema.

La scatola di interfaccia contiene l'acquisizione dei dati dei driver delle valvole e il flusso della soluzione hardware di uscita digitale è mantenuto da aria pressurizzata di 0,22 ohm. La pressione di un bar viene monitorata utilizzando un millimetro digitale. Può essere mantenuto riempiendo un contenitore di acciaio installato tra l'alimentazione dell'aria e i contenitori della soluzione nella gabbia EC tramite una valvola a spillo.

Il CVIC si compone di quattro parti. Il chip zen è inserito tra la base veterinaria e la testa veterinaria. Un connettore di uscita cilindrico è avvitato alla testa vet e trasporta il gruppo elettrodo di riferimento.

L'elettrodo di riferimento è costituito da un filo d'argento clorurato con un connettore SMC miniaturizzato ed è isolato dal percorso di flusso da un ponte salino in gel di poliacrilico. Non in uso, il gruppo ponte in gel è conservato in una soluzione di fosfato di potassio 100 millimolare pH sette contenente 100 millimolari di cloruro di potassio. Innanzitutto, l'elettrodo di riferimento deve essere montato nel gruppo di elettrodi di riferimento contenente il ponte geografico.

È importante evitare bolle d'aria durante l'installazione dell'elettrodo di riferimento. Ora questa parte del vete è attaccata al connettore di uscita, che è stato preriempito con soluzione tampone. Tutti i collegamenti devono essere sigillati con O-ring.

Questo SM è formato su un chip zor, una luce strutturata in vetro rivestito di capra. Questa strada sematica ha un diametro di un millimetro ed è collegata alla piastra di contatto tramite una striscia di contatto bianca di 0,2 millimetri. Un pin di contatto a molla crea un contatto con l'amplificatore.

Il chip zen è conservato al buio in una soluzione di etanolo tiolico Okta Deccan 10 LAR. Per mantenere il suo strato arcano thi per rimuovere le molecole virali di Okta deccan, che non sono state assorbite, l'elettrodo viene risciacquato con etanolo puro e l'elettrodo essiccato in azoto gassoso. Ora il monostrato di fosfocolina può essere assemblato.

La soluzione lipidica contiene 15 milligrammi per millilitro di colina DFI e 250 microgrammi per millilitro. Okta due Una miniera in decadimento ed è immagazzinato a meno 20 gradi. L'elettrodo è ora posizionato con precisione sulla base del cubito SA.

Un microlitro della soluzione viene aggiunto all'elettrodo SSM senza toccare lo strato d'oro. Subito dopo aver aggiunto la soluzione lipidica, il vete può essere assemblato. Il volume vete sigillato da un O-ring è cilindrico con un volume interno di 17 microlitri quando montato.

L'SSM deve essere centrato sotto il foro di aspirazione. Prima di collegare il veterinario, il sistema del fluido deve essere preriempito con una soluzione tampone di fosfato di potassio 100 millimolare. È importante assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nei tubi e nelle valvole.

Ora il veterinario può essere montato nella gabbia diurna della tiroide, collegare l'amplificatore, l'ingresso e l'uscita del percorso del flusso della soluzione e il generatore di funzioni. Infine, il cubito può essere risciacquato con un tampone di fosfato di potassio da 100 millimetri. Ciò porta alla formazione spontanea di SSM per verificarne la qualità.

La capacità e la conduttanza vengono misurate utilizzando il generatore di funzioni per misurare la conduttanza Viene utilizzata una tensione CC di 100 millivolt. Il decadimento di corrente mostra la carica del condensatore a membrana dopo che il condensatore è completamente carico. La corrente misurata produce la conduttanza della membrana utilizzando la legge di M.

Qui osserviamo una conduttanza di oh 0,17 nano Siemens. La capacità può essere misurata utilizzando una tensione CA triangolare di 50 millivolt di ampiezza picco-picco e una frequenza di 0,5 hertz. L'ampiezza della corrente d'onda quadra risultante rappresenta la corrente di giudizio del condensatore.

La capacità è uguale alla carica trasferita divisa per la tensione imposta. Questa membrana mostra una capacità di 2,3 nano, un'alta conduttanza e una bassa capacità indicano che l'SSM non è formato correttamente. In questi casi, la membrana deve essere scartata e un altro SSM deve essere preparato utilizzando un nuovo chip di elettrodi.

Di solito i liposomi prot vengono conservati congelati a Meno 80. La sonicazione del campione su ghiaccio è essenziale perché un campione aggregato assorbe la puleggia all'SSM per ottenere una sospensione omogenea di prot liposomi. Tre cicli di sonicazione di dieci secondi sono alternati a intervalli di raffreddamento di dieci secondi sul ghiaccio.

Sciacquare il loro SSM con una soluzione non attivante. Quindi svitare il connettore di uscita insieme al campione dell'elettrodo di riferimento. Utilizzando una pipetta, iniettare 30 microlitri di campione proteico attraverso l'uscita del vete nel volume ette.

Per prima cosa montare il puntale della pipetta sul foro di uscita. Quindi apri il manuale sopra nella via non attivante e inietta i liposomi di protea. Prima di retrocedere il puntale della pipetta.

Chiudere il manuale sopra per evitare un ulteriore flusso di soluzione. Lasciare che i liposomi di protea vengano assorbiti dall'SSM per un tempo di incubazione di una o due ore. Utilizzare la finestra del protocollo di flusso del software di controllo e acquisizione dati della valvola per definire il protocollo di flusso.

Se si desidera eseguire la misurazione in condizioni simmetriche, ad esempio per la determinazione della specificità del substrato, del valore KM o della dipendenza dal pH, scegliere il protocollo di scambio di una singola soluzione. Imposta la durata del flusso per ogni soluzione da 0,5 a un secondo. La corrente viene registrata durante l'intero protocollo di flusso.

L'amplificazione è in genere impostata su 10 alla potenza di nove e per la frequenza di campionamento scegliamo 2000 punti dati al secondo. Infine, salva il tuo nuovo protocollo con il titolo NA a e a. Nel secondo tocco della finestra del protocollo di flusso, è possibile definire lo stato aperto o chiuso di valvole specifiche per controllare il flusso della soluzione non attivante o attivante tramite qubit.

Qui dimostriamo la misurazione dei liposomi di protea, l'importazione di protoni di zucchero come Y da E coli. La soluzione attivante contiene il substrato trasportato lattosio, mentre la soluzione non attivante contiene la stessa quantità di glucosio non trasportato di un composto compensatorio. Oltre agli zuccheri, le soluzioni contengono 100 millimolari di fosfato di potassio a pH 7,6 e un millimolare di DTT.

Dopo aver cambiato le soluzioni, utilizzare la valvola manuale per assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse. Prima di iniziare un protocollo di flusso, regolare la pressione appena prima di iniziare la misurazione. Utilizziamo abitualmente la pressione di Ø 0,6 bar, che nella nostra specifica configurazione di valvole e tubi produce una portata di circa un millilitro al secondo.

Quindi selezionare un protocollo di flusso sicuro qui, il protocollo NAA, e premere il pulsante di avvio per avviare ogni misurazione. Durante le prime misurazioni poco assorbite, i liposomi di protea vengono rimossi e quindi la corrente di picco può diminuire. Ripetere la misurazione fino a quando la corrente di picco rimane costante.

Durante la prima fase del flusso di soluzione non attivante, la corrente è zero. Lo scambio dalla soluzione non attivante a quella attivante, che contiene lattosio, induce l'attività di trasporto elettrogenico della membrana. La carica positiva della proteina si accumula all'interno dei liposomi proteici e l'amplificatore rileva una corrente transitoria positiva dovuta all'accoppiamento positivo tramite l'SSM.

Questa corrente positiva accoppiata positivamente è chiamata scambio V del segnale di accensione dalla soluzione di attivazione. Tornando alla soluzione non attivante, induce il trasporto del codice dello zucchero protonico fuori dai liposomi. In questo caso, viene visualizzata una corrente accoppiata a LY negativa il cosiddetto segnale off per l'analisi cinetica delle proteine.

Viene utilizzato solo il segnale di accensione, poiché il segnale di spegnimento è scarsamente definito a causa dello stato di carica della valvola a membrana, la commutazione crea artefatti meccanici ed elettrici. Fortunatamente, questi sono limitati a un intervallo di tempo prima che vengano osservati i segnali indotti dalle proteine. Si noti che il ritardo di 50 millisecondi tra gli artefatti di commutazione della valvola e i segnali del trasportatore è il tempo necessario alla soluzione per propagarsi dalla valvola terminale alla superficie dell'SSM Rapid Solution Exchange, come quello eseguito sull'SSM rappresenta un tipico esperimento di rilassamento.

In tali esperimenti, la corrente si rilassa attraverso una fase di pre-stato stazionario dipendente dal tempo in uno stato stazionario costante. I dettagli cinetici attuali del ciclo di reazione possono essere derivati dalla forma e dall'entità della corrente pre-stazionaria. Mentre la corrente di stato stazionario fornisce informazioni sul continuo turnover proteico di membrana.

Nel sistema accoppiato in cui i liposomi di protea vengono assorbiti nel loro SSM, le correnti pre-stazionarie sono praticamente inalterate. Mentre non si ottiene mai una corrente costante allo stato stazionario, ma a causa della carica dei liposomi, la corrente misurata diminuisce gradualmente. La corrente del trasportatore può essere calcolata dalla corrente accoppiata misurata mediante l'analisi del circuito.

Qui dimostriamo risultati rappresentativi utilizzando il co-trasportatore di protoni di zucchero, come Y nell'intervallo PA compreso tra 8,5 e 7,6. La corrente del trasportatore è dominata da una reazione elettrogenica in ritardo nel ciclo di reazione. In queste condizioni, la faccia dello stato prestazionario consiste in un semplice aumento di corrente al suo valore di stato stazionario.

Questo poi decade a causa dell'accoppiamento capacitivo. Siamo interessati alla corrente di trasporto in regime stazionario. In assenza di un potenziale di membrana, questo è rappresentato in buona approssimazione dalla corrente di picco.

La cinetica di Ali Mein può quindi essere analizzata tamponando le correnti di picco per diverse concentrazioni di substrato, ma si consideri che le ampiezze di corrente di picco possono essere confrontate rigorosamente solo se ottenute da un singolo sensore in un esperimento. Uno dei motivi è la variabilità dell'efficienza di assorbimento. Quando il pH si riduce ulteriormente, il segnale monofasico diventa bifasico.

E infine, un rapido transitorio rimane per il mutante Y lag carente di trasporto. Il transitorio rapido è seguito da una piccola componente negativa più lenta. La componente negativa è caratteristica delle correnti transitorie rapide misurate nei sistemi ad accoppiamento continuo ed è causata dalla scarica di capacità della membrana.

Qui, la corrente di picco non rappresenta il trasporto allo stato stazionario, ma piuttosto una conferma elettrogenica della transizione all'inizio del ciclo ionico, che diventa evidente perché un mutante a y non mostra alcun trasporto allo stato stazionario, e per il ritardo wildtype, il trasporto allo stato stazionario y è inibito da un pH basso. L'evidenza sperimentale fornisce un'interpretazione meccanicistica della traslocazione di carica nel ciclo di reazione del ritardo y, che è mostrata nel modello cinetico. Il transitorio veloce osservato per il mutante carente di trasporto, o nel caso del ritardo Y wildtype in condizioni acide, è dovuto a una rapida reazione elettrogenica settimanale dopo il legame del lattosio a valori di pH più elevati, il segnale è dominato dalla principale reazione elettrogenica alla fine del ciclo di reazione, che è stata proposta per rappresentare il rilascio di protoni pseudo plasmatici nel sistema accoppiato capacitivamente.

Ciò porta a correnti transitorie che rappresentano il trasporto allo stato stazionario del ritardo a causa della forte interazione degli Ute. Con l'SSM, gli artefatti elettrici vengono generati quando vengono scambiate soluzioni di diversa composizione. Assicurati che le soluzioni non attivanti e attivanti siano il più simili possibile, soprattutto per quanto riguarda il pH e la forza ionica.

Il controllo deve essere effettuato perché anche i substrati possono produrre artefatti. Prima di aggiungere il campione proteico, è sempre possibile testare il sistema tampone specifico e il protocollo di flusso per individuare eventuali artefatti utilizzando l'SSM nudo. Dopo aver aggiunto il campione di proteine, le misure di controllo possono essere eseguite con soluzioni che non contengono substrati, che sono strutturalmente simili al substrato.

Inoltre, c'è la possibilità di testare il substrato per artefatti utilizzando liposomi o frammenti di membrana senza la proteina di interesse. È inoltre possibile aggiungere inibitori alle soluzioni o pipettarle. Dopo l'esperimento direttamente all'uscita del vete per misurare l'inibizione del segnale del trasportatore, i segnali specifici della proteina scompariranno, lasciando solo gli artefatti di scambio della soluzione.

Il segnale proteico può quindi essere facilmente corretto. Assicurarsi che la perdita di prot, liposomi assorbiti o la degradazione delle proteine non influenzino la misurazione. Eseguendo misurazioni di controllo ripetute in condizioni identiche, un rundown del segnale fino al 20% è accettabile e può essere corretto assumendo una dipendenza temporale lineare del rundown.

Questa configurazione è il risultato di 20 anni di sviluppo tecnico nel nostro laboratorio. Inoltre, sono disponibili sistemi specializzati con una soluzione con timer più elevato per l'analisi cinetica e un consumo di soluzione inferiore per substrati costosi. Per lo screening dei farmaci, utilizziamo configurazioni completamente automatiche con una maggiore produttività.

Ad oggi, più di 20 trasportatori sono stati caratterizzati utilizzando questo metodo. Questi includono APA di trasporto, complessi di catene respiratorie, trasportatori freddi, scambiatori e persino canali di ferro. Quindi, quando non sei in grado di risolvere il tuo problema con l'elettrofisiologia standard, prendi in considerazione l'utilizzo dell'elettrofisiologia SS Mase.