Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

Elettrofisiologia basata su membrane sostenute, abbreviata in elettrofisiologia basata su SSM. È un nuovo approccio elettrofisiologico. Offre, per numerose applicazioni, un significativo miglioramento rispetto ai metodi convenzionali.

Lo strumento principale dell'elettrofisiologia convenzionale è l'elettrodo microparticellare riempito di elettrolita, mentre l'elettrofisiologia basata su SSM rileva il trasferimento di carica mediante un elettrodo a membrana sostenuta solida. È estremamente utile in casi in cui l'elettrofisiologia convenzionale non può essere utilizzata, come nel caso dei trasportatori batterici, che, a parte poche rare eccezioni, non possono essere studiati con metodi di voltage clamp o patch clamp. In tali casi, l'elettrofisiologia basata su SSM si è rivelata molto efficace.

È inoltre possibile utilizzarlo per studiare trasportatori eucariotici fisiologicamente rilevanti nelle membrane intracellulari. Esistono diversi modi per eseguire esperimenti di elettrofisiologia basati su SSM. Nella ricerca di base, può essere applicato per determinare parametri cinetici e chiarire il meccanismo di trasporto, ma la sua robustezza e il potenziale per l'automazione lo rendono ideale per applicazioni di screening nella scoperta di percorsi.

L'elettrodo SSM porta un sistema di membrane composite costituito dalla SSM sottostante e dai proteasomi incorporati o dai frammenti di membrana contenenti la proteina di trasporto di interesse. Le proprietà elettriche della membrana composita possono essere descritte mediante un circuito equivalente in cui le membrane formano un sistema accoppiato capacitivamente. Si noti che il comportamento elettrico del sistema è essenzialmente lo stesso indipendentemente che vengano utilizzati frammenti di membrana o liposomi proteici.

Lo spostamento di carica nella proteina di trasporto viene trasmesso al circuito di misurazione attraverso la capacità della membrana della vescicola. Un principio di rilevamento denominato accoppiamento capacitivo. In un esperimento tipico, un rapido scambio di soluzione al VSSM fornisce il substrato per la proteina di trasporto V; l'attività di trasporto elettrogenico della proteina genera una corrente, che è accoppiata al sistema di misurazione attraverso la capacità del SSM.

Nel frattempo, l'attività della proteina elettrogena carica gradualmente la membrana liposomiale, portando a un'inibizione della proteina di trasporto e a una corrente decrescente nel circuito di registrazione; la corrente misurata è il risultato di reazioni di trasporto simultanee di milioni di liposomi proteici assorbiti all'Enzo, ognuno contenente circa 100 trasportatori. L'apparato sperimentale comprende una gabbia di Faraday con un percorso per la soluzione, circuiti esterni per il controllo delle valvole, amplificazione del segnale e acquisizione e analisi dei dati.

La gabbia EC comprende contenitori, valvole e tubi necessari per il controllo del flusso della soluzione, nonché un cubit con un chip XOR. Il chip XOR ospita l'elettrodo SSM e i liposomi prot assorbiti. Il vete è collegato all'amplificatore e al generatore di funzioni del circuito elettrico esterno.

Le misurazioni SSM richiedono due soluzioni, una attivante e una non attivante, a parte il substrato, che è presente soltanto nella soluzione attivante. Entrambe le soluzioni hanno la stessa composizione nella configurazione a scambio singolo. Due valvole a due vie controllano il flusso delle soluzioni non attivante e attivante.

La valvola terminale, una valvola tre per tre collegata meccanicamente, viene utilizzata per commutare tra la soluzione non attivante e quella attivante, indirizzando una delle due soluzioni al contenitore di scarto e l'altra alla qve. Quando la valvola terminale viene commutata, il flusso della soluzione non attivante viene deviato verso lo scarto e la soluzione attivante fluisce verso la qve. Questa configurazione permette un flusso continuo simultaneo di entrambe le soluzioni.

In qualsiasi momento durante il protocollo di flusso, il percorso di flusso può essere ottimizzato in base alle esigenze. Tuttavia, è necessario tenere presente che la distanza tra il SSM e il punto di congiunzione delle soluzioni non attivanti e attivanti deve essere mantenuta il più breve possibile, poiché determina il tempo di soluzione dello scambio tra le soluzioni.

L'amplificatore di corrente esterno alla gabbia del modulo di alimentazione è collegato a un chip sensore. Tipicamente, l'amplificazione è impostata da 10 alla potenza di otto a 10 alla potenza di nove volt per ampere e il tempo di riposo è compreso tra uno e 10 millisecondi. Un generatore di funzioni è collegato all'elettrodo di riferimento e un computer con software di controllo delle valvole e di acquisizione dati, insieme a un box di interfaccia, completano il sistema.

La scatola dell'interfaccia contiene i driver delle valvole, l'acquisizione dati e la soluzione hardware per l'uscita digitale; il flusso della soluzione viene mantenuto mediante aria compressa con filtro da 0,22 µm. Una pressione di un bar viene monitorata utilizzando un manometro digitale ed è possibile mantenerla riempiendo un contenitore in acciaio installato tra la sorgente d'aria e i contenitori della soluzione all'interno della gabbia EC attraverso una valvola a spillo.

Il CVIC è composto da quattro parti. Il chip zen è inserito tra la base vet e la testa vet. Un connettore di uscita cilindrico è avvitato alla testa vet e supporta l'insieme dell'elettrodo di riferimento.

L'elettrodo di riferimento è costituito da un filo d'argento clorurato con un connettore SMC miniaturizzato ed è isolato dal percorso di flusso da un ponte salino in gel di poliacrilato. Quando non viene utilizzato, l'assiemaggio del ponte di gel viene conservato in una soluzione di fosfato di potassio 100 millimolare a pH 7 contenente 100 millimolare di cloruro di potassio. Innanzitutto, l'elettrodo di riferimento deve essere montato nell'assiemaggio dell'elettrodo di riferimento contenente il ponte geo.

È importante evitare bolle d'aria durante il montaggio dell'elettrodo di riferimento. Ora questa parte del vete viene collegata al connettore di uscita, che è stato preventivamente riempito con soluzione tampone. Tutti i collegamenti devono essere sigillati con guarnizioni ad anello (O-ring).

Questo SM è formato su un chip zor, un vetro illuminante rivestito con capra strutturata. Questa strada sematica ha un millimetro di lunghezza e di diametro ed è collegata al pad di contatto tramite una striscia di contatto bianca di 0,2 millimetri. Un perno di contatto a molla stabilisce il collegamento con l'amplificatore.

Il chip zen viene conservato al buio in una soluzione di etanolo tiolico 10 LAR Okta Deccan. Per mantenere il suo strato ti arcano e rimuovere le molecole virali di Okta Deccan non assorbite, l'elettrodo viene risciacquato con etanolo puro e quindi essiccato in atmosfera di azoto. A questo punto, il monostrato di fosfocolina può essere assemblato.

La soluzione lipidica contiene 15 milligrammi per millilitro di DFI colina e 250 microgrammi per millilitro di Okta due A ammina in decadimento e viene conservata a meno 20 gradi. L'elettrodo viene ora posizionato con precisione alla base del cubito SA.

Un microlitro della soluzione viene aggiunto all'elettrodo SSM senza toccare lo strato d'oro. Immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione lipidica, è possibile assemblare il vete. Il volume del vete sigillato da un anello O ha forma cilindrica e un volume interno di 17 microlitri quando è montato.

Il SSM deve essere centrato sotto il foro di ingresso. Prima di collegare il dispositivo di controllo, il sistema fluidico deve essere riempito in anticipo con una soluzione tampone di fosfato di potassio 100 millimolare. È importante assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nei tubi e nelle valvole.

Ora il vet può essere montato nella gabbia tiroidea, collegando l'amplificatore, l'ingresso e l'uscita del percorso di flusso della soluzione e il generatore di funzioni. Infine, il cubit può essere risciacquato con un buffer di fosfato di potassio 100 millimolare. Questo porta alla formazione spontanea di SSM per verificare la qualità dell'SSM.

La capacità e la conduttanza sono misurate utilizzando il generatore di funzioni per misurare la conduttanza; viene utilizzata una tensione continua di 100 millivolt. Il decadimento della corrente mostra la carica del condensatore della membrana dopo che il condensatore è completamente carico. La corrente misurata fornisce la conduttanza della membrana utilizzando la legge di M'S.

Qui osserviamo una conduttanza di 0,17 nano Siemens. La capacità può essere misurata utilizzando una tensione alternata triangolare con un'ampiezza picco-picco di 50 millivolt e una frequenza di 0,5 hertz. L'ampiezza della corrente a onda quadra risultante rappresenta la corrente di giudizio del condensatore.

La capacità è uguale alla carica trasferita divisa per la tensione applicata. Questa membrana presenta una capacità di 2,3 nano; una conduttanza elevata e una capacità bassa indicano che l'SSM non è stato correttamente formato. In questi casi, la membrana deve essere scartata e un nuovo SSM deve essere preparato utilizzando un chip elettrodo nuovo.

Di solito, i protoliposomi vengono conservati congelati a meno 80. È fondamentale mantenere il campione sul ghiaccio durante la sonica perché un campione aggregato assorbe male al SSM per ottenere una sospensione omogenea di protoliposomi. Si alternano tre cicli di sonica della durata di dieci secondi ciascuno a intervalli di raffreddamento di dieci secondi sul ghiaccio.

Sciacquare il loro SSM con soluzione non attivante. Quindi svitare il connettore di uscita insieme al campione dell'elettrodo di riferimento. Utilizzando una pipetta, iniettare 30 microlitri del campione proteico attraverso l'uscita del vete nel volume dell'ette.

Montare innanzitutto la punta della pipetta sul foro di uscita. Quindi aprire il manuale sopra nel percorso non attivante e iniettare i liposomi di protea. Prima di rimuovere la punta della pipetta.

Chiudere il manuale in alto per evitare un ulteriore flusso della soluzione. Lasciare assorbire i liposomi proteici al SSM per un tempo di incubazione da uno a due ore. Utilizzare la finestra del protocollo di flusso del software di controllo delle valvole e acquisizione dati per definire il proprio protocollo di flusso.

Se si desidera effettuare misurazioni in condizioni simmetriche, come per la determinazione della specificità del substrato, del valore di KM o della dipendenza dal pH, scegliere il protocollo di scambio con singola soluzione. Impostare la durata del flusso per ciascuna soluzione su 0,5-1 secondo. La corrente viene registrata per l'intero protocollo di flusso.

L'amplificazione viene generalmente impostata a 10 alla potenza di nove e, per la frequenza di campionamento, si sceglie di acquisire 2000 punti dati al secondo. Infine, salvare il nuovo protocollo con il titolo NA a e a. Nella seconda scheda della finestra del protocollo di flusso, è possibile definire lo stato aperto o chiuso di valvole specifiche per controllare il flusso di soluzioni non attivanti o attivanti attraverso il qubit.

Qui mostriamo la misurazione di protea liposomi, il trasporto di protoni legato allo zucchero Y proveniente da E. coli. La soluzione attivante contiene il substrato trasportato, il lattosio, mentre la soluzione non attivante contiene la stessa quantità di glucosio, uno zucchero non trasportato, come composto compensativo. Oltre agli zuccheri, le soluzioni contengono fosfato di potassio 100 millimolare a pH 7,6 e 1 millimolare di DTT.

Dopo aver cambiato soluzione, utilizzare la valvola manuale per assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse. Prima di avviare un protocollo di flusso, regolare la pressione immediatamente prima dell'inizio della misurazione. Utilizziamo abitualmente una pressione di 0,6 bar, che, con la nostra specifica configurazione di valvola e tubi, produce una portata di circa un millilitro al secondo.

Quindi selezionare qui un protocollo di flusso sicuro, il protocollo NAA, e premere il pulsante di avvio per iniziare ogni misurazione. Durante le prime misurazioni vengono rimossi i liposomi di protea leggermente assorbiti e pertanto la corrente di picco può diminuire. Ripetere la misurazione finché la corrente di picco non rimane costante.

Nella prima fase del flusso della soluzione non attivante, la corrente è nulla. Lo scambio dalla soluzione non attivante a quella attivante, contenente lattosio, induce l'attività di trasporto elettrogeno della membrana. Una carica positiva proteica si accumula all'interno dei proteliposomi e l'amplificatore rileva una corrente transitoria positiva dovuta al coupling positivo tramite il SSM.

Questo flusso di corrente positivo positivamente accoppiato viene definito segnale di accensione V di scambio dalla soluzione attivante. Il ritorno alla soluzione non attivante induce il trasporto all'esterno dei liposomi del codice zuccherino protonico. In questo caso, viene visualizzato un flusso di corrente negativo accoppiato LY, il cosiddetto segnale di spegnimento per l'analisi cinetica delle proteine.

Viene utilizzato solo il segnale di accensione, poiché il segnale di spegnimento è mal definito a causa degli artefatti meccanici ed elettrici generati dal cambiamento dello stato di carica della valvola della membrana. Fortunatamente, questi artefatti sono limitati a un intervallo temporale precedente all'osservazione dei segnali indotti dalle proteine. Si noti che il ritardo di 50 millisecondi tra gli artefatti dovuti all'attivazione della valvola e i segnali del trasportatore corrisponde al tempo necessario alla soluzione per propagarsi dalla valvola terminale alla superficie del SSM durante lo scambio rapido di soluzione, come quello effettuato sul SSM, che rappresenta un tipico esperimento di rilassamento.

In questi esperimenti, la corrente si evolve attraverso una fase dipendente dal tempo pre-stazionaria fino a raggiungere uno stato stazionario costante. I dettagli cinetici della corrente relativi al ciclo di reazione possono essere ricavati dalla forma e dall'entità della corrente pre-stazionaria. Mentre la corrente allo stato stazionario fornisce informazioni sul turnover continuo della proteina di membrana.

Nel sistema liposomiale accoppiato, in cui i liposomi proteici sono assorbiti al loro SSM, le correnti in pre-steady state sono praticamente inalterate. Mentre una corrente costante in condizioni di steady state non viene mai raggiunta, a causa della carica accumulata sui liposomi la corrente misurata diminuisce gradualmente. La corrente del trasportatore può essere calcolata dalla corrente liposomiale accoppiata misurata mediante analisi di circuito.

Qui mostriamo risultati rappresentativi ottenuti utilizzando il cotrasportatore di protoni e zuccheri, come Y nell'intervallo di PA compreso tra 8,5 e 7,6. La corrente del trasportatore è dominata da una reazione elettrogena in una fase tardiva del ciclo di reazione. In queste condizioni, la fase pre-stazionaria consiste in un semplice incremento della corrente fino al suo valore stazionario.

Questo poi decade a causa dell'accoppiamento capacitivo. Siamo interessati alla corrente di trasporto in regime stazionario. In assenza di un potenziale di membrana, questa è rappresentata con buona approssimazione dalla corrente di picco.

La cinetica di Ali Mein può quindi essere analizzata riportando su un grafico le correnti di picco relative a diverse concentrazioni di substrato, ma si tenga presente che le ampiezze delle correnti di picco possono essere confrontate rigorosamente solo se ottenute da un singolo sensore in un unico esperimento. Un motivo è la variabilità dell'efficienza di assorbimento. Quando il pH viene ulteriormente ridotto, il segnale monofasico diventa bifasico.

E infine, permane un transitorio rapido per il mutante lag Y carente di trasporto. Il transitorio rapido è seguito da una piccola componente negativa più lenta. La componente negativa è caratteristica delle correnti transitorie rapide misurate in sistemi accoppiati in ly ed è causata dalla scarica della capacità della membrana.

Qui, la corrente di picco non rappresenta un trasporto in stato stazionario, ma piuttosto una conferma elettrogenica di una transizione iniziale nel ciclo ionico, che diventa evidente poiché un mutante la y non mostra alcun trasporto in stato stazionario e, nel caso del tipo selvatico lag, il trasporto in stato stazionario è inibito da un pH basso. Le evidenze sperimentali forniscono un'interpretazione meccanicistica della translocazione di carica nel ciclo reattivo di lag y, come mostrato nel modello cinetico. Il transiente rapido osservato per il mutante carente di trasporto, o nel caso del tipo selvatico lag Y in condizioni acide, è dovuto a una rapida reazione elettrogenica settimanale successiva al legame del lattosio a valori di pH più elevati; il segnale è dominato dalla principale reazione elettrogenica in una fase tardiva del ciclo reattivo, che è stata proposta come rappresentativa del rilascio di protoni pseudoplasmico nel sistema accoppiato capacitivamente.

Ciò porta a correnti transitorie che rappresentano il trasporto in condizioni di stato stazionario di Lag y dovuto alla forte interazione degli Utes. Con il SSM, si generano artefatti elettrici quando si sostituiscono soluzioni di composizione diversa. Assicurarsi che le soluzioni non attivanti e quelle attivanti siano il più simili possibile, in particolare per quanto riguarda il loro pH e le forze ioniche.

È necessario eseguire un controllo poiché i substrati possono generare artefatti. Testare sempre il proprio specifico sistema di tampone e il protocollo di flusso per individuare artefatti utilizzando il SSM nudo prima dell'aggiunta del campione proteico. Dopo aver aggiunto il campione proteico, le misurazioni di controllo possono essere effettuate con soluzioni contenenti composti non substrato, strutturalmente simili al substrato.

Inoltre, è possibile verificare la presenza di artefatti nel substrato utilizzando liposomi o frammenti di membrana privi della proteina di interesse. È inoltre possibile aggiungere inibitori alle soluzioni o prelevarli con la pipetta. Dopo l'esperimento, direttamente nell'uscita del vete, per misurare l'inibizione del segnale del trasportatore, i segnali specifici della proteina scompariranno, lasciando soltanto gli artefatti dovuti allo scambio della soluzione.

Il segnale proteico può quindi essere facilmente corretto. Assicurarsi che la perdita di proteina assorbita, di liposomi o la degradazione della proteina non influisca sulla misurazione. Eseguendo misurazioni di controllo ripetute in condizioni identiche, una riduzione del segnale fino al 20% è accettabile e può essere corretta assumendo una dipendenza temporale lineare della riduzione.

Questa configurazione è il risultato di 20 anni di sviluppo tecnico nel nostro laboratorio. Sono inoltre disponibili sistemi specializzati con soluzioni temporali più elevate per l'analisi cinetica e un consumo ridotto di soluzione per substrati costosi. Per lo screening farmacologico, utilizziamo configurazioni completamente automatiche ad alto rendimento.

Ad oggi, più di 20 trasportatori sono stati caratterizzati utilizzando questo metodo. Tra questi figurano trasportatori APA, complessi della catena respiratoria, trasportatori di tipo cool, scambiatori e persino canali per il ferro. Pertanto, quando non riuscite a risolvere il vostro problema mediante elettrofisiologia standard, prendete in considerazione l'utilizzo dell'elettrofisiologia SS Mase.