Un modello Zebrafish di diabete mellito e di memoria metabolica

Memoria metabolica è il fenomeno per cui complicanze diabetiche persistono e progredire senza ostacoli anche dopo euglicemia si ottiene farmaceutico. Qui si descrive un modello di diabete mellito zebrafish che è unica in quanto permette di esame dei componenti mitoticamente trasmissibili epigenetiche di memoria metabolica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare un modello di zebrafish per il diabete mellito di tipo uno, che può essere utilizzato per scoprire le basi molecolari delle complicanze del diabete mellito e, soprattutto, per determinare le basi genetiche della loro persistenza. Ciò si ottiene inducendo prima l'iperglicemia con una serie di iniezioni del farmaco diabetogeno STZ e l'incubazione del pesce a temperatura ridotta. Successivamente, dopo tre settimane, vengono determinati i livelli di glucosio nel sangue a digiuno per garantire che lo stato iperglicemico sia stato indotto e che il farmaco venga interrotto per avviare il recupero delle cellule beta.

Quindi la pinna caudale viene amputata e lasciata rigenerarsi per isolare componenti geneticamente trasmissibili della memoria metabolica e per rimuovere fattori potenzialmente complicanti del precedente ambiente iperglicemico. Infine, viene eseguito un saggio di rigenerazione delle pinne per documentare una riduzione persistente della rigenerazione delle pinne e identificare i cambiamenti indotti nel tessuto sezionato tramite un test di interesse. Il vantaggio principale del modello di zebrafish diabetico rispetto a quelli esistenti è che la memoria metabolica può essere studiata in un vero ambiente glicemico U estivo rispetto a quello che si vedrebbe nei pazienti dopo un trapianto di pancreas.

Ci aspettiamo che il modello venga utilizzato per la scoperta delle modificazioni epigenetiche che sono alla base della memoria metabolica e della persistenza delle complicanze diabetiche Per generare pesci zebra con diabete mellito, preparare una vasca di recupero con acqua di pesce normale e una vasca anestetica di acqua di pesce con una diluizione da uno a 1000 di due fenossietanolo sotto una cappa aspirante. Preparare una soluzione allo 0,3% di STREPTOZOTOCINA o STZ aggiungendo sei milligrammi di STZ a due millilitri di cloruro di sodio allo 0,09% e porre immediatamente la soluzione sul ghiaccio in una provetta separata. Aliquotare abbastanza soluzione salina per il controllo.

Il pesce riempie una siringa da mezzo CC dotata di un ago da 27 gauge e mezzo con l'STZ o le soluzioni di controllo, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria. Anestetizzare un singolo pesce mettendolo in acqua anestetica e aspettando che il movimento di nuoto cessi di circa uno o due minuti. Una volta anestetizzato posizionare brevemente il pesce su un tovagliolo di carta per assorbire l'acqua in eccesso, quindi posizionare il pesce in una barca di passaggio e pesarlo.

Quindi, posiziona il pesce su una superficie solida. Quindi inserire l'ago oltre lo smusso nella faccia posteriore del peritoneo ventrale e iniettare 0,35 milligrammi per grammo di TZ o un volume equivalente di soluzione di controllo nella cavità peritoneale del pesce dopo l'iniezione. Metti il pesce nella vasca dell'acqua di recupero e monitoralo per la normale attività di nuoto.

Dopo aver iniettato abbastanza pesci per l'esperimento, trasferirli in normali vasche viventi e mantenerli a una temperatura compresa tra 22 e 24 gradi Celsius. La temperatura ridotta è fondamentale per un'efficace induzione dell'iperglicemia per indurre uno stato prolungato di iperglicemia molto alta, seguire un programma di iniezioni frequenti durante la fase di induzione, seguite da iniezioni di mantenimento settimanali come mostrato qui per raccogliere il sangue. Per determinare FBGL, preparare una provetta PCR etichettata per ogni campione di sangue contenente cinque microlitri di soluzione fisiologica normale.

Dopo aver anestetizzato il pesce, tamponare l'acqua in eccesso, posizionare il pesce su un vetrino da microscopio e utilizzando un bisturi, rimuovere la testina alla base dell'opercolo, raccogliere il sangue che viene rilasciato sul vetrino e aggiungerlo rapidamente alla provetta PCR di soluzione fisiologica sterile, pipettando su e giù per assicurarsi che il sangue non si coaguli, posizionare immediatamente il campione sul ghiaccio. Determinare il volume del campione di sangue misurando il volume totale del liquido nella provetta e sottraendo i cinque microlitri di soluzione fisiologica. Trasferire cinque microlitri di sangue diluito da ciascuna provetta PCR in una provetta micro fuge da 1,5 millilitri e utilizzare il kit per il dosaggio del glucosio quantico secondo le istruzioni del produttore per determinare la concentrazione di glucosio nel sangue.

Dopo aver anestetizzato un pesce, metterlo in una capsula di Petri e sotto un cannocchiale da dissezione, utilizzare un bisturi sterile di misura 10 per amputare la pinna di coccodrillo tagliando una linea retta prossimale al primo punto di ramificazione della trachea lipidica per la fase di crescita rigenerativa del saggio. Metti il pesce in una vasca di recupero a 33 gradi Celsius per rigenerare le pinne. Dopo aver anestetizzato un pesce, allargare la pinna in modo che sia completamente estesa e utilizzare un cannocchiale da dissezione dotato di una fotocamera e di un software per elementi NIS.

Raccogli le immagini con un ingrandimento x per misurare la crescita rigenerativa. Stampa le immagini e utilizza il software J per immagini e un blocco da disegno per tracciare l'intera area di nuova crescita per l'accuratezza del tracciamento. Assicurarsi che non siano presenti ombre o goccioline d'acqua ed eseguire ogni misurazione cinque volte per calcolare la media.

Per normalizzare le misurazioni, misurare la lunghezza del sito di amputazione lungo l'asse ventrale dorsale e dividere l'area precedentemente determinata per questa misurazione. Dopo aver generato un gruppo di DM FISH e i loro controlli a 21 giorni, determinare l'FBGL per un sottoinsieme del gruppo e dividere i DM fish in due sottogruppi per la durata dell'esperimento. Continuare le iniezioni settimanali di STZ per uno dei gruppi poiché i controlli DM per il secondo gruppo interrompono le iniezioni di STZ e incubano il pesce a temperatura normale.

Entro 14 giorni, questi pesci zebra ripristineranno il normale controllo dell'insulina e del glucosio nel sangue attraverso la rigenerazione del pancreas. Questi pesci sono ora chiamati memoria metabolica o MM, i pesci al giorno 30 dopo la rimozione del farmaco amputano le pinne del merluzzo dei pesci DM e MM di controllo, come dimostrato in precedenza in questo video, per consentire la crescita del tessuto della memoria metabolica. Riportare il pesce alle normali condizioni dell'acqua per la rigenerazione delle pinne per 30 giorni al giorno 60.

Eseguire una seconda amputazione all'interno del tessuto che si è rigenerato nel periodo da 30 a 60 giorni ed eseguire un test di rigenerazione della pinna di coccola, isolare il tessuto ed eseguire un test di interesse. Il pesce zebra diabetico di tipo uno non solo mostra le complicanze secondarie note della retinopatia e della nefropatia, ma mostra anche un'ulteriore complicanza come si può vedere qui a 72 ore dopo l'amputazione. Questa complicanza persiste a causa della memoria metabolica nei pesci che hanno ripristinato il normale controllo del glucosio dopo un periodo iperglicemico come mostrato qui, i pesci zebra mm mostrano un deficit nella rigenerazione delle pinne di circa il 40% rispetto ai pesci di controllo, e la compromissione è stata osservata fino a 150 giorni dopo l'amputazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come avviare lo stato iperglicemico nel pesce zebra, misurare i livelli di glucosio nel sangue a digiuno, eseguire studi di rigenerazione delle pinne e, infine, generare pesci con memoria metabolica.