Name: Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca 2 + Transitori e correnti di membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Scopri l'isolamento dei miociti atriali umani per misurare simultaneamente i transitori di Ca²⁺ e le correnti di membrana. Questo metodo consente di studiare la fisiologia cardiaca e le malattie come la fibrillazione atriale.

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Inoltre, ringraziamo i cardiochirurghi dell&#39;Università di Heidelberg per la fornitura di tessuto atriale umano e Claudia Liebetrau, Katrin Kupser e Ramona Nagel per l&#39;eccellente supporto tecnico. Un ringraziamento speciale anche a Andy W. Trafford per i suoi utili suggerimenti e consigli durante la creazione dei Ca 2 + misure transitorie. Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine più profonda per i membri del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia (testa: Ursula Corvi) del Dresden University of Technology per l&#39;opportunità che ci hanno offerto di apprendere le tecniche di base e le competenze in elettrofisiologia cellulare e l&#39;isolamento dei cardiomiociti. Ricerca degli autori è sostenuta dal tedesco Research Foundation (Do769/1-1-3), il ministero federale tedesco dell&#39;Istruzione e della ricerca attraverso la Fibrillazione Atriale Rete di competenza (01Gi0204) e il Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, l&#39;Unione europea attraverso l&#39;EuRete pea per la ricerca traslazionale nella fibrillazione atriale (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, progetto di integrazione di grandi dimensioni, Proposta N. 261057) e l&#39;europeo-nordamericano Atrial Fibrillation Research Alliance (ENAFRA) concessione di Fondation Leducq (07CVD03). La panoramica schematica mostrata nel file video è stato prodotto usando Servier arte medica.

Protocolli sperimentali devono essere approvati dal comitato etico locale e tutti i pazienti hanno bisogno di dare un consenso informato scritto. La nostra ricerca è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina di Mannheim, Università di Heidelberg (# 2011-216n-MA) ed è stata eseguita in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato scritto. 0. Ottenere umana tessuto atriale Durante le procedure di incannulazione routine in pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto per bypass cardiopolmonare innesto la punta del diritto appendice atriale è solitamente rimosso e può essere utilizzato per l&#39;isolamento di cardiomiociti atriali. Dopo l&#39;asportazione del campione di tessuto viene trasferito immediatamente in un tubo da 50 ml Falcon con sterile Ca 2 + senza soluzione di trasporto contenente 2,3-butanedione monoxime (tabella I, BDM, inibitore contrattile, impedendo miociti contracture). Con i tempi di trasporto tra i 30 ei 45 minuti, non abbiamo riconosciamo un chiaro vantaggio di raffreddamento o di ossigenazione per quanto riguarda sia il numero e la qualità dei isolate cardiomiociti atriali. In generale, il trasporto al laboratorio deve essere il più velocemente possibile. Tuttavia, se tragitto lungo, non può essere evitato, trasporto a 4 ° C in soluzione ossigenata potrebbe essere vantaggiosa. 1. Predisposizioni <ol><li> Accendere il thermocirculator, che controlla la temperatura del becher incamiciata (Tabella II). Assicurarsi che la temperatura all&#39;interno del bicchiere equivale a 37 ° C. Coprire il becher con un coperchio di vetro per mantenere una temperatura costante all&#39;interno del becher in tutto il processo di isolamento. </li><li> Pesare il Collagenasi I e proteasi XXIV in tre bicchieri di vetro e conservarla a temperatura ambiente. Gli enzimi saranno diluiti prima dell&#39;uso. </li><li> Conservare 20 ml di Ca 2 + soluzione gratuita in una capsula di Petri a 4 ° C. </li><li>Negozio 250 ml di Ca 2 + soluzione libera in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li></ol> 2. Pulizia del Tissue <ol><li> Trasferire il campione di tessuto insieme alla soluzione di trasporto in una capsula Petri (~ 10 cm di diametro) e rimuovere il tessuto adiposo all&#39;incirca usando forbici. </li><li> Pesare il campione di tessuto. Tra 200 e 600 mg sono utilizzati per l&#39;isolamento delle cellule. Il restante tessuto può essere congelato in azoto liquido per la successiva analisi biochimica. </li><li> Trasferire il campione di tessuto nella capsula di Petri contenente 20 ml di Ca 2 + soluzione a 4 ° C (vedi punto 1.3) e tritare il campione di tessuto in piccoli pezzi di circa 1 mm 3 di dimensione. </li><li> Le seguenti operazioni devono essere eseguite a 37 ° C e sotto la continua emissione di gas con il 100% O 2. Una punta di pipetta può essere posizionato sul tubo ossigeno ad evitare forti bubbling e generare il flusso d&#39;aria continuo. </li><li> Trasferire i pezzi di tessuto insieme alla soluzione 2 +-libero in Caper il bicchiere con guaina e mescolate con cura per circa 3 minuti con un agitatore magnetico. </li><li> Smettere di mescolare e lasciare i pezzi di tessuto di stabilirsi per qualche secondo. Colare attenzione il surnatante con una rete di nylon (200 micron, tabella II). Restituire i pezzi di tessuto trattenuto dalla maglia nel bicchiere con pinze. </li><li> Riempire il bicchiere con Ca 2 + soluzione gratuita e ripetere la fase di lavaggio 2.4 e 2.5 due volte. </li></ol> 3. Prima digestione enzimatica <ol><li> Risospendere i pezzi di tessuto con 20 ml di soluzione enzimatica E1 (Tabella I) contenente collagenasi e proteasi e mescolate con cura per 10 min. </li><li> Aggiungere 40 ml di 10 mM CaCl 2-soluzione per ottenere una concentrazione finale di 20 mM Ca 2 +. </li><li> Dopo 35 min forzerebbe il surnatante con cura attraverso una maglia di nylon (200 micron, tabella II) in un modo che la maggior parte dei pezzi di tessuto rimangono nel becher. Resto Ritornopiovuto pezzi di tessuto dalla maglia nel bicchiere. </li></ol> 4. Seconda digestione enzimatica <ol><li> Sospendere di nuovo i pezzi di tessuto con 20 ml di soluzione di enzima E2 contenente collagenasi ho solo (Tabella I). Aggiungere 40 ml di 10 mM CaCl 2-soluzione immediata per ottenere una concentrazione finale di 20 mM Ca 2 +. </li><li> Durante il secondo uso forbici digestione di tagliare ulteriormente i coaguli di tessuto di tanto in tanto. </li><li> Dopo 5 min prendere un campione con una pipetta Pasteur controlla la dissociazione delle cellule. Ripetere questa operazione ogni 2-3 minuti fino a quando appaiono a forma di bastoncello, cardiomiociti striati. </li><li> Smettere di mescolare e lasciare i pezzi di tessuto di stabilirsi per circa 20-30 sec. </li><li> Filtrare il surnatante con cura attraverso una rete di nylon (200 micron, tabella II) in una provetta da 50 ml Falcon (metro A). Restituire i pezzi di tessuto trattenuto dalla maglia nel bicchiere. </li><li> Risospendere i pezzi di tessuto nel bicchiere con 20 ml Storage soluzione (Tabella I) 10 e di dissociare ulteriormente le cellule dolce triturazione meccanica utilizzando un 20 ml pipetta sierologica con dispenser. Cercate di evitare la formazione di bolle in quanto le bolle sono dannose per la sopravvivenza delle cellule e di qualità. </li><li> Filtrare il surnatante con cura attraverso una rete di nylon (200 micron, la tabella II) in un tubo ml Falcon 50 (metro B). </li></ol> 5. Preparazione finale e regolazione di Finale Ca 2 + Concentrazione <ol><li> Centrifugare sia Falcon tubi A e B (vedi punto 4.5 e 4.7) a 95 g per 10 min. </li><li> Rimuovere il surnatante da entrambi i tubi con attenzione per aspirazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet. Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere pellet in entrambe le soluzione di storage da 1,5 ml (Tabella I) ogni (temperatura ambiente). </li><li> Aggiungere due volte 7,5 ml di 10 mM CaCl 2 soluzione per ogni Falcon e mescolate con cura. Incubare per 10 minuti dopo ogni passaggio. </li><li>Aggiungere 15 ml di 10 mM di soluzione di CaCl 2 per ottenere una finale Ca 2 + concentrazione di 0,2 mM. </li></ol> 6. Caricamento dei miociti con lo fluorescente Ca 2 +-Indicatore Fluo-3 AM (Figura 1) <ol><li> Trasferire 1,5 ml di sospensione cellulare (tubo A e / o il tubo B) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml (provetta Eppendorf). </li><li> Le seguenti operazioni devono essere eseguite e considerando la sensibilità alla luce del Ca 2 + indicatore fluorescente Fluo-3. </li><li> Sciogliere 50 mg della membrana permeabile derivato estere acetossimetilico di Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabella III) in 44 microlitri della Pluronic F-127 (Tabella III) soluzione madre (20% w / v in DMSO anidro) per ottenere ± 1 mm Fluo-03:00 soluzione madre, che può essere conservato a -20 ° C per un massimo di 1 settimana. </li><li> Aggiungere 15 microlitri della Fluo-03:00 soluzione madre alla provetta contenente 1,5 ml di sospensione cellulare (vedi punto 6.1) e agitareattentamente. </li><li> Incubare la sospensione cellulare per 10 min in una scatola otticamente opaca. </li><li> Centrifugare brevemente a circa 6.000 giri al minuto. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1,5 ml di soluzione del bagno (Tabella IV). </li><li> Lasciare la sospensione cellulare per circa 30 min per de-esterificazione prima di iniziare con gli esperimenti. </li></ol> 7. Simultanei patch-clamp e epifluorescente Ca 2 + Misure Dal momento che le misurazioni di patch-clamp non sono l&#39;argomento principale di questa recensione, rimandiamo il lettore interessato ad altre pubblicazioni che forniscono una descrizione più approfondita di questa tecnica. 11-14 Per completezza forniamo una breve sintesi di un protocollo per misurare potenziali d&#39;azione o di tipo L Ca 2 + correnti, entrambi con simultanei Ca 2 +-registrazioni transitori. Durante gli esperimenti miociti sono superfuse a 37 ° C con bagno solutisu (tabella IV) utilizzando un sistema di perfusione rapido (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Per gli esperimenti di tensione-clamp, K + correnti vengono bloccati aggiungendo 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl 2 (0,1 mmol / L) alla soluzione del bagno. Microelettrodi di vetro borosilicato sono utilizzati e dovrebbero avere la mancia resistenze di 2-5 MW, quando riempita con pipetta soluzione (Tabella V). Oltre al Fluo-03:00 caricando dei miociti (vedere fase 6), Fluo-3 è anche incluso nella soluzione pipetta (Tabella V). Fluorescenza è eccitato a 488 nm e la luce emessa (&lt;520 nm) convertito [Ca 2 +] i supponendo <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> dove k d = costante di dissociazione di Fluo-3 (n 864M), F = Fluo-3 fluorescenza. F max = Ca 2 +-fluorescenza saturo ottenuto al termine di ogni esperimento 12 Entrambi i segnali elettrici e epifluorescente Ca 2 + segnali vengono registrate contemporaneamente. I potenziali d&#39;azione sono stimolate a 0,5 Hz in modalità current-clamp con 1 msec attuali impulsi di forza soglia 1.2x. L-tipo Ca 2 +-correnti sono misurati in modalità voltage-clamp utilizzando un potenziale di mantenimento di -80 mV e 100 msec-ramp-impulso a -40 mV per inattivare la rapida Na +-corrente, seguito da un 100-msec test-impulso a +10 mV a 0,5 Hz.

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</ol>

Worthington Biochemical Corp. sostenuto questa pubblicazione per coprire i costi di produzione di file video. I finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Qui si descrive un metodo per l&#39;isolamento di miociti atriali umane da appendici atriali giuste ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto. Per poter utilizzare questi miociti per misure di Ca 2 + citosolico abbiamo adattato un metodo precedentemente descritto 4-11 omettendo dell&#39;EGTA dalla soluzione di storage. Già nel 1970 si è osservato che, sebbene miociti dissociano in presenza di Ca 2 + durante la digestione, tutti erano in contrattura e non vitali. 16,17 Pertanto, isolamento cellulare è eseguita in Ca 2 +-soluzione libera. Tuttavia, la reintroduzione di concentrazioni fisiologiche di Ca 2 + comportato rapida Ca 2 + afflusso e la morte cellulare. Questo è stato descritto come il Ca 2 + fenomeno paradosso originariamente osservata nei cuori perfusi da Zimmerman e Hulsman. 18 Le modifiche dei terreni di isolamento tra cui la riduzione del pH a 7,0, &lt;sup&gt; 19 aggiunta di taurina 20 o di piccole quantità di Ca 2 + (vedi punto 3.2 e 4.1), 21 come pure la memorizzazione dei miociti isolati in dell&#39;EGTA contenenti storage-soluzione 22 sono state proposte per evitare che il Ca 2 + paradosso. 17 Tuttavia, è ben noto che Ca 2 + attraverso bufferizzazione EGTA riduce l&#39;ampiezza di tipo L Ca 2 + corrente indotta Ca 2 + transitori ampiezze e comporta un decadimento delle bifasica Ca 2 + transitori. 23 Pertanto, abbiamo omesso EGTA durante l&#39;intero processo di isolamento per ottenere Ca 2 + transitori con proprietà tipiche e decadimenti monofasici. Per proteggere le cellule dal Ca 2 + paradosso abbiamo aumentato la finale Ca 2 + concentrazione della soluzione di stoccaggio in modo graduale fino a 0,2 mM. La scelta di collagenasi è probabilmente la fase più critica per il successo isolamento dei miociti. Coll convenzionaleagenases sono preparazioni grezze ottenute da Clostridium histolyticum e contengono collagenasi oltre ad una serie di altre proteinasi, polysaccharidases e lipasi. Sulla base delle loro collagenasi generali di composizione sono suddivise in diverse tipologie. Worthington 24 Tipi collagenasi I e II sono stati utilizzati con successo per l&#39;isolamento dei miociti atriali umani. 4-10,15,25-30 Nel nostro protocollo attualmente descritto si consiglia l&#39;uso di collagenasi tipo I, anche se siamo stati anche in grado di ottenere quantità accettabili di cellule vitali mediante collagenasi di tipo II. Tuttavia, anche all&#39;interno di un unico tipo collagenasi vi è una significativa variazione da lotto a lotto sulle attività enzimatiche. Queste variazioni richiedono un&#39;attenta selezione del lotto e la sperimentazione di vari lotti per ottimizzare la procedura di isolamento. Lo strumento a disposizione batch selezione on-line da Worthington Biochemical Corp. ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) può essere usato per trovare batch disponibili con una composizione che ha dimostrato di essere adatto per l&#39;isolamento di miociti atriali umani. Attualmente usiamo collagenasi di tipo I con 250 U / mg attività collagenasi, 345 U / mg attività caseinase, 2.16 U / mg attività clostripain e 0.48 U / mg attività trittico (lotto # 49H11338). Le cellule ottenute utilizzando la procedura descritta in questo manoscritto possono essere utilizzati entro 8 ore per studi di patch-clamp, Ca 2 + transitori misurazioni e una combinazione di entrambi. 15 Inoltre, queste cellule consentono misure di contrazione cellulare in risposta alla stimolazione del campo elettrico o stimolazione elettrica usando la pipetta di patch-clamp (osservazioni non pubblicate).

Studiare le proprietà elettrofisiologiche dei canali ionici cardiaci con la tecnica del patch-clamp e l&#39;esplorazione di cellulare Ca 2 + di movimentazione anomalie richiedono cardiomiociti isolati. Questi sono solitamente ottenuti dopo l&#39;esposizione in vitro di campioni di tessuto cardiaco di enzimi digestivi (collagenasi, ialuronidasi, peptidasi ecc). Dal momento che il primo rapporto di isolamento di miociti cardiaci vitali nel 1955 2 una grande quantità di protocolli è stato sviluppato al fine di raccogliere singoli cardiomiociti atriali e ventricolari da specie diverse, tra cui topo, ratto, coniglio, cane, cavia e umani. In questa recensione ci concentriamo su isolamento dei miociti atriali umani. Per quanto riguarda le procedure di isolamento dei miociti da altre specie ci si riferisce al &quot;Worthington Tissue guida dissociazione&quot; fornito da Worthington Biochemical Corp., USA ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al. 3 Qui forniamo una descrizione step-by-step di una tecnica, che è tratto da un metodo pubblicato in precedenza, al fine di ottenere miociti atriali adatte non solo per gli esperimenti patch clamp ma anche per simultanei Ca2 + intracellulare misurazioni. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-idrossi-b-butirrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Acido L-glutammico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>Kh2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Proteasi XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: 7,40</td></tr><tr><td>aggiustato con</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Soluzione di trasporto&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione priva di Ca2+&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione enzimatica E1 ed E2&lt;/em&gt;: NaOH 1 M&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Soluzione di conservazione&lt;/em&gt;: KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">Concentrazioni espresse in mM se non diversamente indicato. BDM, monossima del 2,3-butanedione. *La proteasi XXIV è inclusa solo nella soluzione enzimatica E1.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella I. Soluzioni.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maglia di nylon (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germania</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Beccherino a doppia parete</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella II. Attrezzature specifiche.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (confezione speciale)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella III. Sostanze per il caricamento dei miociti con Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: 7,35</td></tr><tr><td>aggiustato con</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Soluzione di bagnatura&lt;/em&gt;: HCl 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella IV. Soluzione di bagnatura per il patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopiridina e BaCl sono inclusi solo negli esperimenti di voltage-clamp.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sale potassico del DL-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 0,02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Soluzione per pipetta&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7,20</td></tr><tr><td>aggiustato con</td><td></td><td></td><td>KOH 1 M</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabella V. Soluzione per pipetta per patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*Nei giorni dell’esperimento, la soluzione per pipetta viene conservata sul ghiaccio fino all’uso. **Il Fluo-3 viene aggiunto da una soluzione madre 1 mM nei giorni dell’esperimento.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; transitori e correnti di membrana

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

Lo studio delle proprietà elettrofisiologiche dei canali ionici cardiaci con la tecnica del patch-clamp e l&#39;esplorazione delle cardiaco cellulare Ca 2 + movimentazione anomalie richiede cardiomiociti isolati. Inoltre, la possibilità di indagare miociti da pazienti che utilizzano queste tecniche è un requisito prezioso per delucidare le basi molecolari di malattie cardiache come la fibrillazione atriale (AF). 1 Qui si descrive un metodo per l&#39;isolamento di miociti atriali umani che sono adatti per entrambi studi di patch-clamp e misurazioni simultanee di concentrazioni intracellulari di Ca 2 +. In primo luogo, appendici atriali giuste ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto sono tagliate in piccoli pezzi di tessuto (&quot;metodo chunk&quot;) e lavati a Ca 2 + soluzione priva. Poi i pezzi di tessuto vengono digeriti in collagenasi e proteasi contenente soluzioni con 20 mM Ca 2 +. Successivamente, i miociti isolati sono harvested per filtrazione e centrifugazione della sospensione tessuto. Infine, il Ca 2 + concentrazione nella soluzione di conservazione delle cellule viene modificata gradualmente a 0,2 mM. Discuteremo brevemente il significato di Ca 2 + e Ca 2 + tampone durante il processo di isolamento e anche fornire registrazioni rappresentativi di potenziali d&#39;azione e correnti di membrana, entrambi insieme con contestuale Ca 2 + misure di transienti, eseguita in questi miociti isolati.

Figura 2A mostra tre esempi rappresentativi di isolati miociti atriali diritto umano. Per quantificare il rendimento delle cellule abbiamo pipetta 10 ml di sospensione cellulare (passo 5.5) su un vetrino da microscopio CellFinder ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Produzioni di cellule mediata della figura 2B indicano chiaramente che vi è una tendenza a produzioni di cellule inferiori in FA cronica (CAF) campioni di pazienti (tubo A: 16.5 ± 3.1 cells/10 microlitri (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 microlitri (n = 10) in SR e Caf, rispettivamente, p &lt;0,05; tubo B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ml (n = 29) vs 5.9 ± 2.0 cells/10 ml (n = 9) in SR e Caf, rispettivamente, p = 0,107). Esempi rappresentativi di azione-potenziali misurazioni e registrazioni simultanee di Ca 2 + citosolico transienti sono riportati nella figura 3. In circa il 90% delle cellule indagati, tha azione-potenziale-triggered Ca 2 + rilascio provoca chiare e regolari contrazioni delle cellule. Come riportato in precedenza, il potenziale di membrana a riposo, che è un indicatore accettato per l&#39;integrità delle cellule, in media circa -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 miociti / pazienti) e -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 miociti / pazienti ) in SR e Caf, rispettivamente (p&gt; 0,05). 15 La figura 4 mostra le registrazioni rappresentative simultanee di voltaggio-dipendenti di tipo L di Ca 2 + correnti e Ca 2 + citosolico transienti. Applicazione del non selettivo β-adrenergici isoprenalina agonista (1 mM) aumenta ampiezze di entrambi I Ca, L e Ca 2 + citosolico transitori, suggerendo intatta β-adrenergico cascata di trasduzione del segnale. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso dei miociti Fluo-03:00 caricando protocollo (vedi passo 6,1-6,5). m / v, massa / volume. <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figura 2. A, con separazione dei diritti umani miociti atriali dopo un&#39;ora in una soluzione di archiviazione. B, Media ± SEM della produzione di cellule contate in 10 ml di cellule in soluzione di conservazione (vedi punto 5.5). n si riferisce al numero di preparati di ciascun gruppo. * P &lt;0.05. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figura 3. Registrazioni rappresentative di azione-potenziale-triggered Ca 2 + transitori (CAT) in uno dei miociti atriali da un ritmo sinusale e un chronic paziente fibrillazione atriale. Top: corrente iniettata membrana (I M) utilizzato per la stimolazione (0,5 Hz). Sotto: Registrazione simultanea di potenziale di membrana (V M), e il gatto scatenato (in basso). (Rappresentato nuovamente con il permesso di Voigt et al. 2012) 15 <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figura 4. Registrazioni rappresentativi del (1 mM) effetto isoprenalina su L-tipo Ca 2 + corrente attivata da Ca 2 + transitori (CAT) in uno dei miociti atriali da un ritmo sinusale e un paziente fibrillazione atriale cronica. Top: tensione-clamp protocollo (0,5 Hz). Sotto: Registrazione simultanea di membrana totale netta corrente (I M), riflettendo prevalentemente di tipo L Ca 2 Cat. + corrente (al centro) e attivato (in basso). (Rappresentato nuovamente con il permesso di Voigt,et al. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabella 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabella I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabella 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabella II. Attrezzature specifiche. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabella 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabella III. Sostanze per il carico dei miociti con Fluo-3 AM. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabella 4" fo:content-width = &quot;2.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabella IV. Soluzione del bagno di patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabella 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabella soluzione Pipetta V. per patch-clamp *.

Descriviamo l&#39;isolamento di miociti atriali umani, che possono essere utilizzati per Ca intracellulare<sup&gt; 2 +</sup&gt; Misure in combinazione con studi elettrofisiologici di patch-clamp.

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitori e correnti di membrana

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare miociti atriali umani adatti per misurazioni simultanee del calcio, dei transitori e delle correnti di membrana. Il campione atriale destro viene ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca a cuore aperto e viene trasportato rapidamente per iniziare la procedura. Il primo passaggio della procedura consiste nel pulire il tessuto e tagliarlo in piccoli frammenti.Il secondo passaggio consiste in una doppia digestione enzimatica del tessuto con enzimi proteolitici, che porta alla produzione di miociti atriali isolati. L'ultimo passaggio comprende il caricamento dei miociti con un colorante fluorescente sensibile al calcio. Infine, l'uso combinato della microscopia a fluorescenza episcopica e della tecnica del patch clamp consente di ottenere registrazioni simultanee di transitori del calcio insieme a correnti di membrana o potenziali d'azione.Questo metodo può contribuire a comprendere la base molecolare delle alterazioni del controllo cellulare del calcio alla base di patologie cardiache come la fibrillazione atriale. A dimostrazione del metodo sarà Claudia Lira, tecnico senior del nostro laboratorio. Il tessuto atriale umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca a cuore aperto per bypass coronarico o sostituzione della valvola mitrale deve essere trasportato rapidamente in laboratorio in soluzione di trasporto. Una volta in laboratorio, trasferire il campione di tessuto e la soluzione in una piastra da 10 centimetri. Successivamente, rimuovere grossolanamente il tessuto adiposo utilizzando le forbici.Successivamente, agitare il campione di tessuto. Conservare tra 200 e 600 milligrammi per l'isolamento cellulare e congelare il resto in azoto liquido per l'analisi biochimica. Trasferire il tessuto destinato all'isolamento cellulare in una piastra contenente soluzione fredda priva di calcio e tagliare il tessuto in frammenti di un millimetro cubo per lavare il tessuto.Trasferirlo insieme alla soluzione priva di calcio nel becher con giacca. Riscaldare a 37 gradi. Fornire ossigeno da una linea terminante con la punta di una pipetta per evitare un'eccessiva formazione di bolle.Mescolare delicatamente il tessuto per circa tre minuti con una barretta magnetica. Lasciare quindi depositare il tessuto. Filtrare ora con attenzione il soprannatante attraverso una maglia in nylon da 200 micron.La maggior parte del tessuto dovrebbe rimanere nel becher. Riempire nuovamente il becher con soluzione priva di calcio riscaldata a 37 gradi. Quindi, utilizzando pinze, riposizionare nel becher i frammenti di tessuto filtrati dalla maglia e ripetere la procedura di lavaggio due volte.Iniziare questa parte della procedura preparando 20 millilitri di soluzione enzimatica E1 riscaldata a 37 gradi Celsius, contenente collaghenasi e proteasi. Filtrare attentamente la soluzione priva di calcio dopo l'ultimo passaggio di lavaggio e risospendere il tessuto lavato nella soluzione E1. Reintrodurre il tessuto raccolto sulla maglia nel becher.Agitare delicatamente la sospensione per 10 minuti. Quindi aggiungere 40 microlitri di cloruro di calcio 10 millimolare e continuare ad agitare per 35 minuti. Successivamente, filtrare con attenzione il soprannatante attraverso una maglia di nylon.La maggior parte del tessuto deve rimanere nel becher. Preparare 20 millilitri di soluzione enzimatica E due contenente solo collaghenasi uno e utilizzarla per riempire nuovamente il becher. Reintrodurre nel becher il tessuto raccolto sulla maglia.Quindi aggiungere immediatamente 40 microlitri di soluzione di cloruro di calcio 10 millimolare durante la seconda digestione, utilizzando occasionalmente le forbici per tritare i coaguli di tessuto. Dopo cinque minuti, prelevare un campione della sospensione per verificare la dissociazione delle cellule al microscopio. Continuare a prelevare campioni ogni due o tre minuti finché non risultino chiaramente visibili cardiomiociti striati a forma di bastoncello.Quindi arrestare l'agitazione, permettendo al tessuto di sedimentare. Una volta sedimentato, filtrare con attenzione il soprannatante attraverso una maglia di nylon e raccoglierlo in un tubo di plastica da 50 millilitri. Successivamente, sospendere il tessuto in 20 millilitri di soluzione di conservazione e reinserire nel becher i pezzi di tessuto filtrati dalla maglia.Dissociare ulteriormente le cellule mediante pipettaggio meccanico delicato. Con una pipetta da 20 millilitri, cercare di evitare la formazione di bolle. Successivamente, filtrare attentamente il soprannatante attraverso una maglia di nylon dopo la centrifugazione di filtrazione, raccogliendo entrambi i soprannatanti a 90 5G per 10 minuti.Per formare il pellet delle cellule, rimuovere i soprannatanti per aspirazione senza disturbare il pellet. Sospendere ciascun pellet in 1,5 millilitri di soluzione di conservazione a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di cloruro di calcio 10 millimolare a ciascun tubo e attendere 10 minuti.Quindi aggiungere altri 7,5 microlitri di cloruro di calcio e attendere altri 10 minuti. Trascorso questo tempo, aggiungere un terzo volume di 15 microlitri di cloruro di calcio 10 millimolare per portare la concentrazione finale di cloruro di calcio in soluzione a 0,2 millimolare. Lo scopo di questa isolazione è ottenere cellule adatte alle misurazioni del calcio intracellulare.Pertanto, è un requisito fondamentale omettere eventuali tamponi calcici come EGGA dalla soluzione di conservazione. Trasferire 1,5 millilitri della sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga da due millilitri. I seguenti passaggi devono essere eseguiti tenendo conto della sensibilità alla luce dell'indicatore fluorescente del calcio.Flu O tre. Preparare innanzitutto una soluzione madre di flu OH 3 a una concentrazione di un millimolare. Questa soluzione può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di una settimana.Successivamente, aggiungere 15 microlitri della soluzione madre di flu oh 3:00 AM alla sospensione cellulare da 1,5 millilitri. Agitare attentamente la miscela e incubare la sospensione per 10 minuti a temperatura ambiente in una scatola opaca. Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente il tessuto a circa 6.000 giri al minuto.Quindi eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 1,5 millilitri di soluzione fisiologica. Lasciare la sospensione cellulare per circa 30 minuti per la desesterificazione prima di iniziare gli esperimenti. Procedere quindi con misurazioni simultanee di patch clamp e di calcio in fluorescenza epi utilizzando il protocollo descritto.I miociti sono stati isolati da tessuto atriale e quantificati su un vetrino per microscopio con contatore cellulare. I rendimenti cellulari medi indicano chiaramente una tendenza a rendimenti cellulari più bassi nei campioni provenienti da pazienti con fibrillazione atriale cronica. I miociti carichi di flu oh tre sono stati stimolati a 0,5 hertz in configurazione di blocco della corrente per indurre potenziali d'azione; circa il 90% delle cellule analizzate ha mostrato contrazioni regolari.In risposta a questa stimolazione, il passaggio alla microscopia a fluorescenza permette di visualizzare il rilascio di calcio indotto dal potenziale d'azione dal reticolo sarcoplasmatico, che inizia la contrazione cellulare. Registrazioni rappresentative di pazienti con ritmo sinusale e fibrillazione atriale mostrano che i potenziali d'azione atriali presentano tipicamente una forma a picco e cupola, mentre la triangolazione e l'accorciamento del potenziale d'azione sono caratteristiche tipiche del rimodellamento atriale.In pazienti con fibrillazione atriale, i transitori intracellulari del calcio registrati simultaneamente hanno rivelato livelli di calcio diastolico aumentati e un'ampiezza ridotta del transitorio del calcio nei miociti provenienti da pazienti con fibrillazione atriale, al fine di registrare le correnti calciche di tipo L. Le correnti del potassio sono state bloccate utilizzando tetraamminopiridina e cloruro di bario. Le cellule sono state stimolate a 0,5 hertz in configurazione di blocco del voltaggio, con un potenziale di clamping di -80 millivolt, una rampa di 100 millisecondi fino a -40 millivolt e un impulso di prova di 100 millisecondi a 10 millivolt.Le registrazioni rappresentative mostrano che la fibrillazione atriale è associata a una riduzione della corrente calcica di tipo L. Ancora una volta, il livello di calcio diastolico era aumentato, mentre l'ampiezza del transitorio del calcio era più bassa. Nella fibrillazione atriale.L'applicazione dell'agonista non selettivo dei recettori adrenergici beta, isopreno, ha aumentato l'ampiezza delle correnti calciche di tipo L e del transitorio citosolico del calcio. In entrambi i gruppi, ciò suggerisce che le cellule possiedono una cascata di trasduzione del segnale beta-adrenergica integra. I risultati mostrano che questo metodo fornisce miociti di alta qualità tolleranti al calcio, adatti a misurazioni simultanee mediante patch clamp e del transitorio del calcio.Inoltre, i miociti ottenuti possono essere utili per misurazioni dell'accorciamento cellulare, colorazioni immunoistochimiche o colorazioni per la TTU.

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Kv canale disfunzione è associata ad aritmie cardiache. Al fine di studiare i meccanismi molecolari che portano a tali aritmie che utilizziamo un protocollo sistematico per l'isolamento di cardiomiociti atriali e ventricolari da Kv topi knockout subunità dei canali ausiliari. Cardiomiociti isolati possono essere utilizzate immediatamente per cellulari studi elettrofisiologici, biochimici o di immunofluorescenza (IF) saggi.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

Le attuali conoscenze sulla base cellulare di malattie cardiache si basa principalmente su studi su modelli animali. Qui descriviamo e validare un nuovo metodo per ottenere singoli cardiomiociti vitali da piccoli campioni chirurgici di miocardio ventricolare umana. Miociti ventricolari umani possono essere utilizzati per studi elettrofisiologici e test della droga.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

Metodi per l&#39;isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Questo protocollo descrive la valutazione elettrofisiologica degli atrii murini che utilizza un sistema di mappatura ottico con un'alta risoluzione temporale e spaziale, tra cui registrazioni duale della tensione della membrana e Ca2 + transitoria sotto programmato stimolazione tramite un catetere elettrodo specializzato.

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Qui, descriviamo una procedura basata su Langendorff, ottimizzata per l'isolamento di singole cellule cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione. Una regolazione manuale della pressione intraluminale delle cavità cardiache è implementata per rendere funzionalmente intatto miociti adatto per studi di accoppiamento eccitazione-contrazione.

Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione

Questo protocollo viene utilizzato per isolare i cardiomiociti atriale singoli dal cuore adulto del topo utilizzando un approccio di digestione a blocchi. Questo approccio viene utilizzato per isolare i miociti atriale destro o sinistro che possono essere utilizzati per caratterizzare l'elettrofisiologia dei miociti atriale negli studi patch-clamp.

Isolamento dei miociti atriale dai topi adulti

Presentato è un protocollo per l'isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani e animali da fette miocardici tagliate con vibratome. È possibile ottenere rese elevate di cellule tolleranti al calcio (fino a 200 cellule/mg) da piccole quantità di tessuto (&lt;50 mg). Il protocollo è applicabile al miocardio esposto all'ischemia fredda fino a 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Questo protocollo descrive le modifiche del metodo Langendorff, compresa la profondità della cannulazione dell'aorta per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti.

Modifiche del metodo Langendorff per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti

Scopri l'isolamento dei miociti atriali umani per misurare simultaneamente i transitori di Ca²⁺ e le correnti di membrana. Questo metodo consente di studiare la fisiologia cardiaca e le malattie come la fibrillazione atriale.

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca

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