Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare miociti atriali umani adatti per misurazioni simultanee del calcio, dei transitori e delle correnti di membrana. Il campione atriale destro viene ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca a cuore aperto e viene trasportato rapidamente per iniziare la procedura. Il primo passaggio della procedura consiste nel pulire il tessuto e tagliarlo in piccoli frammenti.

Il secondo passaggio consiste in una doppia digestione enzimatica del tessuto con enzimi proteolitici, che porta alla produzione di miociti atriali isolati. L'ultimo passaggio comprende il caricamento dei miociti con un colorante fluorescente sensibile al calcio. Infine, l'uso combinato della microscopia a fluorescenza episcopica e della tecnica del patch clamp consente di ottenere registrazioni simultanee di transitori del calcio insieme a correnti di membrana o potenziali d'azione.

Questo metodo può contribuire a comprendere la base molecolare delle alterazioni del controllo cellulare del calcio alla base di patologie cardiache come la fibrillazione atriale. A dimostrazione del metodo sarà Claudia Lira, tecnico senior del nostro laboratorio. Il tessuto atriale umano ottenuto da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca a cuore aperto per bypass coronarico o sostituzione della valvola mitrale deve essere trasportato rapidamente in laboratorio in soluzione di trasporto. Una volta in laboratorio, trasferire il campione di tessuto e la soluzione in una piastra da 10 centimetri. Successivamente, rimuovere grossolanamente il tessuto adiposo utilizzando le forbici.

Successivamente, agitare il campione di tessuto. Conservare tra 200 e 600 milligrammi per l'isolamento cellulare e congelare il resto in azoto liquido per l'analisi biochimica. Trasferire il tessuto destinato all'isolamento cellulare in una piastra contenente soluzione fredda priva di calcio e tagliare il tessuto in frammenti di un millimetro cubo per lavare il tessuto.

Trasferirlo insieme alla soluzione priva di calcio nel becher con giacca. Riscaldare a 37 gradi. Fornire ossigeno da una linea terminante con la punta di una pipetta per evitare un'eccessiva formazione di bolle.

Mescolare delicatamente il tessuto per circa tre minuti con una barretta magnetica. Lasciare quindi depositare il tessuto. Filtrare ora con attenzione il soprannatante attraverso una maglia in nylon da 200 micron.

La maggior parte del tessuto dovrebbe rimanere nel becher. Riempire nuovamente il becher con soluzione priva di calcio riscaldata a 37 gradi. Quindi, utilizzando pinze, riposizionare nel becher i frammenti di tessuto filtrati dalla maglia e ripetere la procedura di lavaggio due volte.

Iniziare questa parte della procedura preparando 20 millilitri di soluzione enzimatica E1 riscaldata a 37 gradi Celsius, contenente collaghenasi e proteasi. Filtrare attentamente la soluzione priva di calcio dopo l'ultimo passaggio di lavaggio e risospendere il tessuto lavato nella soluzione E1. Reintrodurre il tessuto raccolto sulla maglia nel becher.

Agitare delicatamente la sospensione per 10 minuti. Quindi aggiungere 40 microlitri di cloruro di calcio 10 millimolare e continuare ad agitare per 35 minuti. Successivamente, filtrare con attenzione il soprannatante attraverso una maglia di nylon.

La maggior parte del tessuto deve rimanere nel becher. Preparare 20 millilitri di soluzione enzimatica E due contenente solo collaghenasi uno e utilizzarla per riempire nuovamente il becher. Reintrodurre nel becher il tessuto raccolto sulla maglia.

Quindi aggiungere immediatamente 40 microlitri di soluzione di cloruro di calcio 10 millimolare durante la seconda digestione, utilizzando occasionalmente le forbici per tritare i coaguli di tessuto. Dopo cinque minuti, prelevare un campione della sospensione per verificare la dissociazione delle cellule al microscopio. Continuare a prelevare campioni ogni due o tre minuti finché non risultino chiaramente visibili cardiomiociti striati a forma di bastoncello.

Quindi arrestare l'agitazione, permettendo al tessuto di sedimentare. Una volta sedimentato, filtrare con attenzione il soprannatante attraverso una maglia di nylon e raccoglierlo in un tubo di plastica da 50 millilitri. Successivamente, sospendere il tessuto in 20 millilitri di soluzione di conservazione e reinserire nel becher i pezzi di tessuto filtrati dalla maglia.

Dissociare ulteriormente le cellule mediante pipettaggio meccanico delicato. Con una pipetta da 20 millilitri, cercare di evitare la formazione di bolle. Successivamente, filtrare attentamente il soprannatante attraverso una maglia di nylon dopo la centrifugazione di filtrazione, raccogliendo entrambi i soprannatanti a 90 5G per 10 minuti.

Per formare il pellet delle cellule, rimuovere i soprannatanti per aspirazione senza disturbare il pellet. Sospendere ciascun pellet in 1,5 millilitri di soluzione di conservazione a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri di soluzione di cloruro di calcio 10 millimolare a ciascun tubo e attendere 10 minuti.

Quindi aggiungere altri 7,5 microlitri di cloruro di calcio e attendere altri 10 minuti. Trascorso questo tempo, aggiungere un terzo volume di 15 microlitri di cloruro di calcio 10 millimolare per portare la concentrazione finale di cloruro di calcio in soluzione a 0,2 millimolare. Lo scopo di questa isolazione è ottenere cellule adatte alle misurazioni del calcio intracellulare.

Pertanto, è un requisito fondamentale omettere eventuali tamponi calcici come EGGA dalla soluzione di conservazione. Trasferire 1,5 millilitri della sospensione cellulare in una provetta microcentrifuga da due millilitri. I seguenti passaggi devono essere eseguiti tenendo conto della sensibilità alla luce dell'indicatore fluorescente del calcio.

Flu O tre. Preparare innanzitutto una soluzione madre di flu OH 3 a una concentrazione di un millimolare. Questa soluzione può essere conservata a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di una settimana.

Successivamente, aggiungere 15 microlitri della soluzione madre di flu oh 3:00 AM alla sospensione cellulare da 1,5 millilitri. Agitare attentamente la miscela e incubare la sospensione per 10 minuti a temperatura ambiente in una scatola opaca. Al termine dell'incubazione, centrifugare brevemente il tessuto a circa 6.000 giri al minuto.

Quindi eliminare il soprannatante e risospendere il pellet in 1,5 millilitri di soluzione fisiologica. Lasciare la sospensione cellulare per circa 30 minuti per la desesterificazione prima di iniziare gli esperimenti. Procedere quindi con misurazioni simultanee di patch clamp e di calcio in fluorescenza epi utilizzando il protocollo descritto.

I miociti sono stati isolati da tessuto atriale e quantificati su un vetrino per microscopio con contatore cellulare. I rendimenti cellulari medi indicano chiaramente una tendenza a rendimenti cellulari più bassi nei campioni provenienti da pazienti con fibrillazione atriale cronica. I miociti carichi di flu oh tre sono stati stimolati a 0,5 hertz in configurazione di blocco della corrente per indurre potenziali d'azione; circa il 90% delle cellule analizzate ha mostrato contrazioni regolari.

In risposta a questa stimolazione, il passaggio alla microscopia a fluorescenza permette di visualizzare il rilascio di calcio indotto dal potenziale d'azione dal reticolo sarcoplasmatico, che inizia la contrazione cellulare. Registrazioni rappresentative di pazienti con ritmo sinusale e fibrillazione atriale mostrano che i potenziali d'azione atriali presentano tipicamente una forma a picco e cupola, mentre la triangolazione e l'accorciamento del potenziale d'azione sono caratteristiche tipiche del rimodellamento atriale.

In pazienti con fibrillazione atriale, i transitori intracellulari del calcio registrati simultaneamente hanno rivelato livelli di calcio diastolico aumentati e un'ampiezza ridotta del transitorio del calcio nei miociti provenienti da pazienti con fibrillazione atriale, al fine di registrare le correnti calciche di tipo L. Le correnti del potassio sono state bloccate utilizzando tetraamminopiridina e cloruro di bario. Le cellule sono state stimolate a 0,5 hertz in configurazione di blocco del voltaggio, con un potenziale di clamping di -80 millivolt, una rampa di 100 millisecondi fino a -40 millivolt e un impulso di prova di 100 millisecondi a 10 millivolt.

Le registrazioni rappresentative mostrano che la fibrillazione atriale è associata a una riduzione della corrente calcica di tipo L. Ancora una volta, il livello di calcio diastolico era aumentato, mentre l'ampiezza del transitorio del calcio era più bassa. Nella fibrillazione atriale.

L'applicazione dell'agonista non selettivo dei recettori adrenergici beta, isopreno, ha aumentato l'ampiezza delle correnti calciche di tipo L e del transitorio citosolico del calcio. In entrambi i gruppi, ciò suggerisce che le cellule possiedono una cascata di trasduzione del segnale beta-adrenergica integra. I risultati mostrano che questo metodo fornisce miociti di alta qualità tolleranti al calcio, adatti a misurazioni simultanee mediante patch clamp e del transitorio del calcio.

Inoltre, i miociti ottenuti possono essere utili per misurazioni dell'accorciamento cellulare, colorazioni immunoistochimiche o colorazioni per la TTU.