Analisi del ciclo cellulare dal vivo di

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la fase relativa del ciclo cellulare e le dimensioni cellulari di tessuti con popolazioni cellulari geneticamente manipolate e marcate con GFP o RFP in Drosophila. In primo luogo, impostare incroci genetici per generare progenie contenente cellule marcate con le proteine fluorescenti desiderate e con le manipolazioni genetiche desiderate in un tessuto o popolazione di cellule specifica. In fase di studio, isolare in modo pulito il tessuto desiderato dalla progenie del corretto stadio di sviluppo, quindi dissociare il tessuto in una singola sospensione cellulare e colorare con un colorante di DNA vitale per misurare il contenuto di DNA.

Analizzare i campioni dissociati colorati mediante citometria a flusso. In definitiva, i risultati in vivo misurano i cambiamenti nelle dimensioni delle cellule e nella fase del ciclo cellulare causati dalle manipolazioni genetiche in studio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente di citometria a flusso su tessuti vivi di drosofila utilizzando coloranti ultravioletti è che il colorante viola del ciclo del colorante è compatibile con citometri da banco meno costosi contenenti un laser viola 4 0 5, che può essere acquistato con un budget ridotto e mantenuto su una singola scala di laboratorio.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del ciclo cellulare, fornendo informazioni sulla fase del ciclo cellulare e sulle dimensioni delle cellule che sono più dettagliate rispetto alla semplice misurazione delle dimensioni complessive dei tessuti e del tasso di proliferazione. A dimostrare la procedura saranno Kagel e Dan Sun, studenti laureati del mio laboratorio e Olga Guko. Il nostro tecnico Raccoglie le larve mature al terzo stadio larvale a circa 110-120 ore dopo la deposizione delle uova per le dissezioni delle larve.

Un'accurata stadiazione della pupilla è essenziale per gli studi durante la metamorfosi per questo raccolto bianco pre pupa all'inizio della metamorfosi, se necessario, ho mesa sigillato la capsula di Petri di pupi o una fiala di larve in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius Per attivare il calore. Base flip Chuck per cloni di tracciamento del lignaggio. Dopo aver aperto la capsula di Petri, metterla in un'incubatrice per l'invecchiamento fino allo stadio di sviluppo desiderato per la dissezione della pupilla.

Afferrare delicatamente una pupa per la punta anteriore della custodia pupillare dove c'è una bolla d'aria per evitare di danneggiare la pupa all'interno, posizionare la pupa galleggiante per una corretta presa. Quindi con micro forbici tagliare in modo netto la punta posteriore della pupa con una leggera angolazione verso la parte dorsale dell'animale per rilasciare la pressione interna senza forzare il grasso hist nei tessuti desiderati nel torace e la testa tagliare con cura lungo la mediana dorsale, evitando di danneggiare le ali e il lavaggio del complesso cerebrale dell'occhio anteriore per rimuovere il grasso. Quindi rimuovere la pupilla dal case della pupilla afferrando il bordo posteriore dell'epidermide della pupilla con una pinza ed estraendola dal case della pupilla.

Trasferire la pupa sezionata in una capsula di dissezione pulita. Fai un piccolo foro nella cuticola anteriore al complesso cerebrale dell'occhio con una pinza. Utilizzando una pipetta di vetro per pasti con bulbo di gomma.

Lavare delicatamente la soluzione di dissezione PBS attraverso la pupa parzialmente sezionata per rimuovere il grasso residuo e il tessuto intestinale. Per ottenere le ali della pupilla, tenere la pupa per la testa con una pinza usando una seconda pinza. Afferrare la punta più posteriore della cuticola dell'ala, tirarla e rimuoverla dal lato della carcassa.

Quindi taglia o tira via l'ala alla cerniera per rimuoverla dal corpo e mettila in un mucchio lontano dalle carcasse e da altro materiale per ottenere la pupilla, gli occhi o il cervello. Lavare la pupa fino a quando il complesso occhio-encefalico non si stacca e si libera dalla pupa. Usando una pinza, allontanare delicatamente l'occhio pupillare dal cervello e salvare il tessuto desiderato Utilizzando una pipetta lubrificata, trasferire con cura i tessuti sezionati.

Incubare le provette agitandole a 23 gradi Celsius a 500 giri/min per 70 minuti. Quindi agitare delicatamente per cinque secondi a velocità media e rimettere i campioni nell'agitatore per altri 15-20 minuti. Vortex campiona ancora una volta per cinque secondi a velocità media per il cervello e gli occhi delle pupille.

Più vecchio di 36 ore. Un PF dissocia i tessuti in una soluzione di colorazione del DNA a 23 gradi Celsius a 500 giri/min per 45-60 minuti. Quindi, uno per uno, dissociare manualmente grandi pezzi di tessuto trasferendoli in un piatto di dissezione insieme a circa 50 microlitri di soluzione di colorante di DNA.

Pipettare rapidamente su e giù con un'apertura di circa 100-150 micrometri oltre la pipetta. Raggruppare i campioni dissociati in un tubo da cinque millilitri. Incubare altri 30 minuti a 23 gradi Celsius agitando a 500 giri/min.

Verificare visivamente che i campioni siano completamente dissociati. Consapevole che la cuticola acellulare trasparente dell'ala pupillare non si assocerà. Iniziare l'analisi via fax caricando il campione sul citometro.

Quindi selezionare i canali per rilevare la dispersione diretta e laterale che indica le dimensioni delle cellule e la complessità della membrana. Per rilevare la colorazione viola del ciclo D del DNA, sarà necessario misurare l'altezza, la larghezza e l'area di VL uno dall'eccitazione laser viola. Selezionare anche l'area del canale laser blu per misurare la fluorescenza GFP.

Per l'analisi RFP, utilizziamo il canale tre del laser blu. Questo canale sulla sintonizzazione è ottimizzato per il rilevamento RFP. Impostare i cancelli in modo da limitare l'analisi alla popolazione selezionata e limitare i detriti e vendere i grumi dall'analisi che genera i grafici di arresto con il cancello uno, escludere detriti e grumi nel grafico di SSC rispetto a FSC nel grafico di VL un'area rispetto a VL uno con l'uso di GA due per escludere le cellule non colorate sotto G uno le cellule apoptotiche e i grumi cellulari in base all'identificazione dei singoletti.

GA tre comprende le cellule all'interno dei cancelli uno e due che sono GFP negative sul grafico della fluorescenza rispetto al contenuto di DNA basato sull'altezza VE L uno. La prossima andatura quattro comprende le cellule all'interno delle porte uno e due che sono GFP positive sul grafico della fluorescenza rispetto al contenuto di DNA. Si possono anche generare i gate cinque e sei da grafici a punti della dimensione delle celle misurata dalla GFP rispetto alla dispersione diretta.

Per esaminare la fase del ciclo cellulare, utilizzare i due istogrammi che tracciano il contenuto di DNA sull'asse x e la conta cellulare sull'Y ais per le popolazioni definite dalla porta tre e dalla porta quattro. Per quanto riguarda le dimensioni delle celle, gli istogrammi impostano le popolazioni sulle porte cinque e sei e tracciano FSC sull'asse x e i conteggi sull'asse Y quando l'esecuzione dei campioni imposta la registrazione in modo che si fermi a 10.000. Gli eventi positivi di GFP hanno anche fissato il volume di acquisizione a 300 microlitri.

Le impostazioni di soglia e tensione appropriate sono contenute nei modelli forniti. Eseguire i campioni a sensibilità standard o alta 100 microlitri al minuto e registrare. I file di dati registrati generati dal software Attune sono in formato FCS, compatibile con la maggior parte dei software di modellazione del ciclo cellulare.

Questo spazio di lavoro rappresentativo contenente quattro grafici a punti e due istogrammi mostra un campione di ala larvale che esprime GFP e Ciclina D nell'ala posteriore, guidato da un transgene Grailed gal four. Il primo grafico a punti della dimensione delle celle con andatura uno esclude detriti e grumi. Il secondo dot plot discrimina i singoletti con andatura due per escludere le cellule non colorate al di sotto del contenuto di NA 1D G e i grumi nel grafico del GFP rispetto al contenuto di DNA.

Le celle GFP negative e positive possono essere distinte e il contenuto di due N e quattro NDNA è evidente in base alla posizione lungo l'asse x. Questo grafico della dimensione delle celle misurata dalla GFP rispetto alla dispersione diretta viene utilizzato per generare le porte cinque e sei. Le analisi risultanti portano a istogrammi del contenuto di DNA rispetto alla conta per la popolazione GFP o RFP negativa, nonché per le cellule GFP o RFP positive.

Utilizzando il modello RFP fornito. Risultati simili si ottengono con lo stesso tipo di tessuto e modello di espressione. Per la RFP, i modelli e le tensioni forniti sono adatti per l'analisi di occhi, cervelli e ali larvali, nonché di occhi, cervelli e ali delle pupille.

Nel software sintonizzato. L'uso della funzione di scalabilità automatica per il ciclo cellulare o gli istogrammi delle dimensioni delle celle consente di determinare il massimo globale per ogni popolazione. Questi profili del ciclo cellulare rappresentano le cellule GFP positive e negative negli occhi della larva che esprimono GFP nella parte posteriore.

Utilizzando i quattro transgeni GAL U-A-S-G-F-P, la sovrapposizione rivela le differenze nella fase del ciclo cellulare delle cellule che esprimono GFP posteriori. È inoltre possibile tracciare la variazione relativa delle dimensioni delle celle tra le celle positive e negative per GFP. Questo profilo del ciclo cellulare è stato derivato dal cervello della pupilla a 46 ore A PF. Le cellule GFP positive sono cloni che tracciano il lignaggio che esprimono il regolatore G one S, la ciclina D ed E due F, che interrompono la quiescenza e portano all'ingresso della fase S.

Ciò è in contrasto con le cellule GFP negative che non esprimono, che in questa fase sono normalmente arrestate. In G one, il software di sintonizzazione genera regioni definite dall'utente sugli istogrammi, delineando le fasi G uno s e G due. Una tabella delle statistiche per ogni esecuzione determina i conteggi assoluti delle celle all'interno delle regioni e delle percentuali definite dall'utente.

In alternativa, è possibile utilizzare software di modellazione come mod fit per stimare le percentuali in ciascuna fase e le celle apoptotiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare ed etichettare diversi tessuti da Drosophila per l'analisi del ciclo cellulare.