1.2: Introduzione al lettore di micropiastre

Il lettore di micropiastre è uno strumento ampiamente utilizzato che consente di misurare contemporaneamente molti campioni, come se venissero eseguiti molti minuscoli esperimenti contemporaneamente.

Questo apparecchio viene utilizzato in combinazione con piastre multipozzetto, come la piastra a 96 pozzetti.

Indipendentemente dal tipo di esperimento eseguito con il lettore di micropiastre, le curve standard vengono spesso utilizzate per determinare il valore dei campioni sperimentali, così come i controlli positivi e negativi.

I lettori di micropiastre sono disponibili in diverse forme, dimensioni e configurazioni. Molti lettori di micropiastre sono dotati di funzionalità multimodali che consentono di eseguire molti saggi diversi. Queste modalità includono la capacità di eseguire diversi tipi di misurazioni, come misure di assorbimento, fluorescenza e luminescenza.

Le piastre multipozzetto sono componenti integranti del lettore di micropiastre e vengono utilizzate per contenere i campioni misurati dalla macchina. Queste piastre possono essere di diverse dimensioni, avere diversi tipi di fondi di pozzetti e diversi numeri di pozzetti. Il tipo di piastra utilizzata dipende dal saggio.

Il vassoio di caricamento viene utilizzato per portare la piastra a 96 pozzetti all'interno della macchina.

Un'interfaccia computer viene in genere utilizzata per azionare il lettore di piastre e controllarne le impostazioni e i parametri, come la lunghezza d'onda e la modalità. Il software di lettura delle piastre dispone di un'interfaccia utente grafica della piastra che consente di selezionare quali pozzetti vengono caricati con i campioni.

Le pipette multicanale sono spesso utilizzate per caricare piastre multipozzetto. I serbatoi contengono le soluzioni per la pipetta multicanale.

A volte i pozzetti possono essere caricati utilizzando una pipetta standard a canale singolo.

I campioni e gli standard vengono caricati in doppio o triplicato per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio. Qui si vede una targa caricata in triplice copia.

La curva standard utilizza campioni con concentrazioni note, che producono valori di assorbanza diversi. Questi dati vengono quindi utilizzati per creare un grafico in cui viene generata una linea di best fit.

Il bianco viene utilizzato per determinare l'entità della misurazione che non è rilevante dal punto di vista sperimentale ed è dovuta ai tamponi in cui il campione è diluito o ai reagenti a cui è esposto il campione. I valori ottenuti da queste misurazioni sono chiamati "fondo". Il grezzo non contiene alcun campione.

Il controllo positivo indica se il test ha funzionato correttamente o meno. Dà un buon risultato. Il controllo negativo è una variabile di controllo in cui non si prevede di osservare alcuna misurazione/effetto. Non dovrebbe produrre alcun risultato.

Una volta che la piastra è impostata, è il momento di caricare i campioni. Per evitare di misurare campioni errati o di caricare la piastra nel modo sbagliato, è fondamentale orientare correttamente la piastra nel vassoio di caricamento. Ricordarsi di prestare attenzione quando si caricano i campioni nel vassoio, in modo da non forzare il vassoio nello strumento o impigliare le estremità all'interno dello strumento.

Una volta caricato il vassoio, parametri come la modalità, la lunghezza d'onda e l'ordine di caricamento dei pozzetti vengono impostati nel software prima della lettura della piastra.

Dopo aver impostato i parametri, la lastra viene letta e il lettore genera una lettura dei valori all'interno del software.

Una volta letta la lastra, utilizzare il valore medio dei campioni bianchi per sottrarre lo sfondo da tutti i campioni, inclusa la curva standard.

Dopo la lettura, i valori di concentrazione noti per gli standard vengono confrontati con i rispettivi valori misurati, in questo caso l'assorbanza.

Una volta tracciati i valori, la linea di adattamento migliore può essere calcolata utilizzando una regressione lineare. Questo può essere fatto facilmente utilizzando un programma per fogli di calcolo.

Il coefficiente di determinazione, una misura statistica di quanto bene la linea preveda i punti dati effettivi, dovrebbe essere compreso tra 0,90 e 0,99, dove 0,99 è considerato il valore migliore e significa che la linea si adatta perfettamente ai dati.

Utilizzando la linea di best fit, possiamo calcolare i valori di concentrazione dei campioni sperimentali o dei controlli in ciascun pozzetto inserendo il valore di assorbanza per Y e quindi risolvendo l'equazione per X. I valori di concentrazione possono anche essere stimati tracciando una linea dal valore di assorbanza sull'asse Y alla linea di best fit e poi giù fino all'asse X.

Molti tipi di lettori di micropiastre misurano l'assorbanza, che è definita come il rapporto logaritmico tra la luce che cade su un oggetto e la luce trasmessa attraverso un oggetto.

Il test Bradford è un esempio di test per lettore di micropiastre basato sull'assorbanza, in cui i campioni proteici vengono aggiunti alla piastra con il ? Bradford? Reagente. Questo composto si lega alle proteine nel campione e provoca uno spostamento della sua assorbanza.

Nei saggi basati sulla fluorescenza, un fluorocromo viene attivato da una certa lunghezza d'onda della luce e a sua volta provoca l'eccitazione del fluorocromo, che emette luce a una lunghezza d'onda diversa.

Quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, assicurarsi di tenerli coperti per evitare il fotosbiancamento e rovinare l'esperimento.

I saggi luminescenti emettono luce attraverso una reazione chimica e spesso utilizzano la luciferasi. La luciferasi proviene da una serie di fonti come le lucciole. In una reazione con luciferasi, la luce viene emessa quando la luciferasi incontra ossigeno, ATP e magnesio in una serie di reazioni.

I saggi luminescenti hanno molte applicazioni diverse. Un esempio di questa applicazione è la misurazione della produzione e del rilevamento di specie reattive dell'ossigeno nei tumori.

Altre applicazioni, che utilizzano lettori di micropiastre, includono saggi ad alta produttività che utilizzano 384 e 1536 pozzetti. In questi saggi, le piastre vengono caricate da un robot. No, non quel tipo di robot. Un robot programmabile che automatizza la manipolazione dei campioni in modo estremamente preciso.

Avete appena visto l'introduzione di JoVE al lettore di micropiastre. In questo video, abbiamo mostrato cos'è un lettore di microlati(A), come viene utilizzato(B), come utilizzare questo strumento(C), come interpretare i dati del lettore di micropiastre e alcune applicazioni che utilizzano un lettore di micropiastre(D). Grazie per aver guardato.