Introduzione al lettore di micropiastre
Il lettore di micropiasse è uno strumento multimodale che consente di eseguire e misurare contemporaneamente una varietà di esperimenti. I lettori di…
Il lettore di micropiasche è uno strumento ampiamente utilizzato che consente di misurare contemporaneamente molti campioni, come se venissero eseguiti contemporaneamente molti minuscoli esperimenti.
Questo apparecchio viene utilizzato in combinazione con piastre multiwell, come la piastra a 96 pozzi.
Indipendentemente dal tipo di esperimento eseguito con il lettore di micropiassure, le curve standard vengono spesso utilizzate per determinare il valore dei campioni sperimentali, nonché i controlli positivi e negativi.
I lettori di micropiasche sono disponibili in diverse forme, dimensioni e configurazioni. Molti lettori di micropiasse hanno capacità multimodali che consentono di eseguire molti test diversi. Queste modalità includono la capacità di eseguire diversi tipi di misurazioni, come misure di assorbimento, fluorescenti e luminescenti.
Le piastre multiplo sono componenti integranti del lettore di micropiasche e vengono utilizzate per contenere i campioni misurati dalla macchina. Queste piastre possono essere di diverse dimensioni, hanno diversi tipi di fondi di pozzi e diversi numeri di pozzi. Il tipo di piastra utilizzata dipende dal test.
Il vassoio di carico viene utilizzato per portare la piastra a 96 pozzi nella macchina.
Un'interfaccia computer viene in genere utilizzata per azionare il lettore di piastre e controllarne le impostazioni e i parametri, come la lunghezza d'onda e la modalità. Il software di lettura delle lastre ha un'interfaccia utente grafica della piastra che consente di selezionare quali pozzetti sono caricati con campioni.
Le pipette multicanale sono spesso utilizzate per caricare piastre multi-pozzo. I serbatoi contengono le soluzioni per la pipetta multicanale.
I pozzette a volte possono essere caricati utilizzando una pipetta standard a canale singolo.
I campioni e gli standard vengono caricati in duplice copia o triplice per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio. Qui vedete una piastra caricata in triplice copia.
La curva standard utilizza campioni con concentrazioni note, che producono diversi valori di assorbanza. Questi dati vengono quindi utilizzati per creare un grafico in cui viene generata una linea di adattamento migliore.
Lo spazio vuoto viene utilizzato per determinare l'estensione della misurazione che non è rilevante dal punto di vista sperimentale ed è dovuta ai tamponi in cui il campione è diluito o ai reagenti a cui il campione è esposto. I valori ottenuti da queste misurazioni sono chiamati "sfondo". Lo spazio vuoto non contiene alcun campione.
Il controllo positivo indica se il test ha funzionato correttamente o meno. Dà un buon risultato. Il controllo negativo è una variabile di controllo in cui non si prevede di osservare alcuna misurazione/effetto. Non dovrebbe produrre alcun risultato..
Una volta impostata la piastra, è il momento di caricare i campioni. Per evitare di misurare i campioni sbagliati o di caricare la piastra nel modo sbagliato, è fondamentale orientare correttamente la piastra nel vassoio di carico. Ricordarsi di prestare attenzione quando si caricano i campioni nel vassoio, in modo da non forzare il vassoio nello strumento o catturare le estremità all'interno dello strumento.
Una volta caricato il vassoio, parametri come la modalità, la lunghezza d'onda e l'ordine di caricamento del pozzo vengono impostati nel software prima che la piastra venga letta.
Dopo aver impostato i parametri, la piastra viene letta e il lettore genera una lettura dei valori all'interno del software.
Una volta letta la piastra, utilizzare il valore medio dei campioni vuoti per sottrarre lo sfondo da tutti i campioni, inclusa la curva standard.
Dopo la lettura, i valori di concentrazione noti per gli standard vengono tracciati rispetto ai rispettivi valori misurati, in questo caso l'assorbanza.
Quando i valori sono stati tracciati, la linea di adattamento migliore può essere calcolata utilizzando una regressione lineare. Questo può essere fatto facilmente utilizzando un programma di fogli di calcolo.
Il coefficiente di determinazione, una misura statistica di quanto bene la linea prevede i punti dati effettivi, dovrebbe essere compreso tra 0,90-0,99, con 0,99 considerato il valore migliore e significa che la linea si adatta perfettamente ai dati.
Usando la linea di migliore adattamento, possiamo calcolare i valori di concentrazione di campioni sperimentali o controlli in ciascun pozzo collegando il valore di assorbanza per Y e quindi risolvendo l'equazione per X. I valori di concentrazione possono anche essere stimati disegnando una linea dal valore di assorbanza sull'asse Y alla linea di adattamento migliore e quindi fino all'asse X.
Molti tipi di lettori di micropiasche misurano l'assorbanza, che è definita come il rapporto logaritmico della luce che cade su un oggetto rispetto alla luce trasmessa attraverso un oggetto.
Il saggio di Bradford è un esempio di un test del lettore di micropiassure basato sull'assorbanza, in cui i campioni proteici vengono aggiunti alla piastra con il reagente "Bradford". Questo composto si lega alle proteine nel campione e causa uno spostamento nella sua assorbanza.
Nei saggi a base fluorescente, un fluorocromo viene attivato da una certa lunghezza d'onda della luce e a sua volta provoca l'eccitazione del fluorocromo, che emette luce a una lunghezza d'onda diversa.
Quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, assicurarsi di tenerli coperti per evitare il fotosciviazione e rovinare l'esperimento.
I saggi luminescenti emettono luce attraverso una reazione chimica e spesso usano la luciferasi. Luciferasi proviene da una serie di fonti come le lucciole. In una reazione di luciferasi, la luce viene emessa quando la luciferasi incontra ossigeno, ATP e magnesio in una serie di reazioni.
I saggi luminescenti hanno molte applicazioni diverse. Un esempio di questa applicazione è la misurazione della produzione e del rilevamento di specie reattive dell'ossigeno nei tumori.
Altre applicazioni, che utilizzano lettori di micropiasche, includono saggi ad alto rendimento che utilizzano pozzi da 384 e 1536. In questi test, le piastre vengono caricate da un robot. No, non quel tipo di robot. Un robot programmabile che automatizza la gestione estremamente precisa dei campioni.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al lettore di micropiasse. In questo video, abbiamo mostrato cos'è un lettore di microlati (A), come viene utilizzato (B), come utilizzare questo strumento (C), come interpretare i dati del lettore di micropiasse e alcune applicazioni utilizzando un lettore di micropiasse (D). Grazie per aver guardato.
Il lettore di micropiasche è uno strumento ampiamente utilizzato che consente di misurare contemporaneamente molti campioni, come se venissero eseguiti contemporaneamente molti minuscoli esperimenti.
Questo apparecchio viene utilizzato in combinazione con piastre multiwell, come la piastra a 96 pozzi.
Indipendentemente dal tipo di esperimento eseguito con il lettore di micropiassure, le curve standard vengono spesso utilizzate per determinare il valore dei campioni sperimentali, nonché i controlli positivi e negativi.
I lettori di micropiasche sono disponibili in diverse forme, dimensioni e configurazioni. Molti lettori di micropiasse hanno capacità multimodali che consentono di eseguire molti test diversi. Queste modalità includono la capacità di eseguire diversi tipi di misurazioni, come misure di assorbimento, fluorescenti e luminescenti.
Le piastre multiplo sono componenti integranti del lettore di micropiasche e vengono utilizzate per contenere i campioni misurati dalla macchina. Queste piastre possono essere di diverse dimensioni, hanno diversi tipi di fondi di pozzi e diversi numeri di pozzi. Il tipo di piastra utilizzata dipende dal test.
Il vassoio di carico viene utilizzato per portare la piastra a 96 pozzi nella macchina.
Un'interfaccia computer viene in genere utilizzata per azionare il lettore di piastre e controllarne le impostazioni e i parametri, come la lunghezza d'onda e la modalità. Il software di lettura delle lastre ha un'interfaccia utente grafica della piastra che consente di selezionare quali pozzetti sono caricati con campioni.
Le pipette multicanale sono spesso utilizzate per caricare piastre multi-pozzo. I serbatoi contengono le soluzioni per la pipetta multicanale.
I pozzette a volte possono essere caricati utilizzando una pipetta standard a canale singolo.
I campioni e gli standard vengono caricati in duplice copia o triplice per tenere conto di eventuali errori di pipettaggio. Qui vedete una piastra caricata in triplice copia.
La curva standard utilizza campioni con concentrazioni note, che producono diversi valori di assorbanza. Questi dati vengono quindi utilizzati per creare un grafico in cui viene generata una linea di adattamento migliore.
Lo spazio vuoto viene utilizzato per determinare l'estensione della misurazione che non è rilevante dal punto di vista sperimentale ed è dovuta ai tamponi in cui il campione è diluito o ai reagenti a cui il campione è esposto. I valori ottenuti da queste misurazioni sono chiamati "sfondo". Lo spazio vuoto non contiene alcun campione.
Il controllo positivo indica se il test ha funzionato correttamente o meno. Dà un buon risultato. Il controllo negativo è una variabile di controllo in cui non si prevede di osservare alcuna misurazione/effetto. Non dovrebbe produrre alcun risultato..
Una volta impostata la piastra, è il momento di caricare i campioni. Per evitare di misurare i campioni sbagliati o di caricare la piastra nel modo sbagliato, è fondamentale orientare correttamente la piastra nel vassoio di carico. Ricordarsi di prestare attenzione quando si caricano i campioni nel vassoio, in modo da non forzare il vassoio nello strumento o catturare le estremità all'interno dello strumento.
Una volta caricato il vassoio, parametri come la modalità, la lunghezza d'onda e l'ordine di caricamento del pozzo vengono impostati nel software prima che la piastra venga letta.
Dopo aver impostato i parametri, la piastra viene letta e il lettore genera una lettura dei valori all'interno del software.
Una volta letta la piastra, utilizzare il valore medio dei campioni vuoti per sottrarre lo sfondo da tutti i campioni, inclusa la curva standard.
Dopo la lettura, i valori di concentrazione noti per gli standard vengono tracciati rispetto ai rispettivi valori misurati, in questo caso l'assorbanza.
Quando i valori sono stati tracciati, la linea di adattamento migliore può essere calcolata utilizzando una regressione lineare. Questo può essere fatto facilmente utilizzando un programma di fogli di calcolo.
Il coefficiente di determinazione, una misura statistica di quanto bene la linea prevede i punti dati effettivi, dovrebbe essere compreso tra 0,90-0,99, con 0,99 considerato il valore migliore e significa che la linea si adatta perfettamente ai dati.
Usando la linea di migliore adattamento, possiamo calcolare i valori di concentrazione di campioni sperimentali o controlli in ciascun pozzo collegando il valore di assorbanza per Y e quindi risolvendo l'equazione per X. I valori di concentrazione possono anche essere stimati disegnando una linea dal valore di assorbanza sull'asse Y alla linea di adattamento migliore e quindi fino all'asse X.
Molti tipi di lettori di micropiasche misurano l'assorbanza, che è definita come il rapporto logaritmico della luce che cade su un oggetto rispetto alla luce trasmessa attraverso un oggetto.
Il saggio di Bradford è un esempio di un test del lettore di micropiassure basato sull'assorbanza, in cui i campioni proteici vengono aggiunti alla piastra con il reagente "Bradford". Questo composto si lega alle proteine nel campione e causa uno spostamento nella sua assorbanza.
Nei saggi a base fluorescente, un fluorocromo viene attivato da una certa lunghezza d'onda della luce e a sua volta provoca l'eccitazione del fluorocromo, che emette luce a una lunghezza d'onda diversa.
Quando si lavora con reagenti sensibili alla luce, assicurarsi di tenerli coperti per evitare il fotosciviazione e rovinare l'esperimento.
I saggi luminescenti emettono luce attraverso una reazione chimica e spesso usano la luciferasi. Luciferasi proviene da una serie di fonti come le lucciole. In una reazione di luciferasi, la luce viene emessa quando la luciferasi incontra ossigeno, ATP e magnesio in una serie di reazioni.
I saggi luminescenti hanno molte applicazioni diverse. Un esempio di questa applicazione è la misurazione della produzione e del rilevamento di specie reattive dell'ossigeno nei tumori.
Altre applicazioni, che utilizzano lettori di micropiasche, includono saggi ad alto rendimento che utilizzano pozzi da 384 e 1536. In questi test, le piastre vengono caricate da un robot. No, non quel tipo di robot. Un robot programmabile che automatizza la gestione estremamente precisa dei campioni.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al lettore di micropiasse. In questo video, abbiamo mostrato cos'è un lettore di microlati (A), come viene utilizzato (B), come utilizzare questo strumento (C), come interpretare i dati del lettore di micropiasse e alcune applicazioni utilizzando un lettore di micropiasse (D). Grazie per aver guardato.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a microplate reader and how does it work?
A microplate reader is an instrument that simultaneously measures many samples using multiwell plates, such as 96-well plates. It performs multiple miniature experiments at once by detecting different types of measurements including absorbance, fluorescence, and luminescence. The computer interface controls settings like wavelength and mode to automate sample analysis across all wells.
Q2: Why are standard curves used in microplate reader assays?
Standard curves determine experimental sample values by using samples with known concentrations that yield different absorbance values. A line of best fit is generated from this data, allowing unknown sample concentrations to be calculated or estimated. The coefficient of determination should be between 0.90-0.99 to ensure the line accurately predicts actual data points.
Q3: What role do controls play in microplate reader experiments?
Blanks determine background measurement not related to the experiment, using buffers or reagents without samples. Positive controls confirm the assay worked properly by yielding expected results. Negative controls show no measurement or effect should occur. Together, these controls validate assay accuracy and identify any experimental errors or contamination.
Q4: How should samples be loaded into a microplate for accurate results?
Samples and standards are loaded in duplicate or triplicate to account for pipetting errors. Multichannel pipettes are often used for efficient loading, though single-channel pipettes work for individual wells. Proper plate orientation in the loading tray is critical to prevent measuring wrong samples. Exercise caution when loading to avoid forcing the tray or catching extremities in the instrument.
Q5: What are the different measurement types available on multimodal microplate readers?
Multimodal microplate readers can perform absorbance measurements, which detect light transmitted through samples; fluorescence measurements, where a fluorochrome is excited by light and emits at a different wavelength; and luminescence measurements, which detect light from chemical reactions like luciferase. Light-sensitive reagents must be kept covered to prevent photobleaching and preserve experiment integrity.
Q6: How is background subtraction performed after reading a microplate?
After the plate is read, the average value of blank samples is calculated and subtracted from all sample measurements, including the standard curve. This removes background noise caused by buffers or reagents not related to the experiment. Background subtraction ensures that measured values reflect only the experimental signal of interest.
Q7: What are common applications of microplate readers in research?
Microplate readers quantify protein levels, measure gene expression, and detect metabolic processes such as reactive oxygen species production in cancer research and calcium flux. High-throughput assays using 384- and 1536-well plates employ programmable robots for automated, precise sample handling. These applications enable rapid analysis of thousands of samples simultaneously.