Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)
14 marzo 2013
La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo. Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una robusta profilazione dei metaboliti non bersaglio del siero in un esperimento su larga scala. Innanzitutto, estrai i metaboliti in un formato piastra. Stabilire un campione e un metodo di controllo qualità robusti per garantire la stabilità analitica nel tempo.
Quindi acquisire dati spettrali di massa su QC e campioni di siero randomizzati in replica, procedere ai dati, alla pre-elaborazione, all'analisi statistica e all'identificazione dei metaboliti. I risultati della profilazione dei metaboliti non mirati mediante U-P-L-C-M-S possono essere utilizzati per identificare i biomarcatori di piccole molecole nel siero. Il protocollo è presentato qui per l'analisi del siero.
Tuttavia, può essere facilmente esteso all'analisi di altri fluidi biologici, come urine, tessuti ed estratti di colture cellulari. Per creare una mappa delle piastre per la preparazione dei campioni, aprire un foglio di calcolo Nella prima colonna, inserire l'elenco dei campioni in ordine di caricamento. Nella seconda colonna, inserisci le posizioni delle piastre a 96 pozzetti utilizzando la nomenclatura corretta per il software di campionamento delle auto.
Conservare un pozzetto in ogni piastra per il campione QC. Se il tuo campionatore lc autos è in grado di gestire due piastre alla volta, separa l'elenco dei campioni in lotti di 190 e salva queste informazioni in un secondo foglio di lavoro. All'interno di ciascuno di questi lotti, randomizzare l'ordine di iniezione.
Ora copia e incolla il tuo ordine di iniezione nel sistema software della coda di campioni LCMS. Riservare le prime tre righe della coda di campionamento per le iniezioni di condizionamento della colonna. Preparare un campione QC da 10 millilitri contenente un minimo di quattro composti di massa e tempo di ritenzione noti che coprono l'eluizione cromatografica dell'esperimento.
Scongelare i campioni di siero con ghiaccio e agitare delicatamente per circa cinque secondi. Pre-bagnare i puntali di un pipettatore a 12 canali con metanolo per evitare il gocciolamento del puntale durante la dispensazione del campione. Quindi aggiungere 370 microlitri di metanolo freddo a ciascun pozzetto di un trasferimento su piastra a 96 pozzetti, 100 microlitri di ciascun campione alla posizione della piastra corrispondente dalle mappe delle piastre.
Coprire le piastre e incubare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Per far precipitare le proteine, centrifugare le piastre a 3, 200 g e quattro gradi Celsius per 30 minuti. Quindi trasferire 250 microlitri di surnatante in una nuova piastra a 96 pozzetti e ripetere la fase di centrifugazione.
Ora trasferisci aliquote da 60 microlitri dello snat in 3 piastre da 96 pozzetti adatte per il campionatore UPLC o lc autos. Aggiungere 100 microlitri di miscela di campioni QC nella posizione del pozzetto riservata sulla piastra. Sigillare ogni piastra con pellicola adesiva.
Impostare il campionatore automatico a quattro gradi Celsius. Posizionare le prime due piastre nel campionatore automatico. Impostare il metodo di acquisizione utilizzando uno dei due gradienti di fase inversa alternativi.
Il gradiente A è orientato verso le molecole non polari. Mentre il gradiente B fornirà una migliore copertura di molecole moderatamente polari. Impostare lo spettrometro di massa per raccogliere i dati in modalità positiva, scansionando da 50 a 1200 rapporti di carica di massa.
Ulteriori condizioni specifiche dello strumento variano a seconda del sistema utilizzato all'inizio di ciascuna delle due. Patch di campioni su piastra Iniettare manualmente i campioni QC cinque volte. Utilizzare le iniezioni QC dalla terza alla quinta per monitorare l'area di picco inferiore al 25% del tempo di ritenzione RSD di più o meno 0,05 minuti e un'accuratezza di massa di più o meno tre parti per milione.
Potrebbe essere necessario regolare questi parametri per adattarli alle specifiche dello strumento utilizzato per l'acquisizione dei dati. Se i campioni QC vengono superati, acquisire i dati sui campioni di siero per queste due piastre quando l'acquisizione dell'intero set di dati è completa. Esegui il rilevamento delle caratteristiche, l'allineamento e la normalizzazione dei dati della spettrometria di massa per l'intero set di dati.
Quindi eseguire analisi statistiche per determinare le caratteristiche molecolari di interesse biologico. Questi passaggi sono descritti nel protocollo di testo. Il seguente flusso di lavoro è in una panoramica concettuale del processo di identificazione dei metaboliti.
Una strategia alternativa è fornita nel protocollo di testo. Utilizza il software per prevedere una formula molecolare dalla massa accurata e dalla distribuzione isotopica delle caratteristiche molecolari significative. Successivamente, cerca le misurazioni di massa accurate rispetto al metabolita interno o pubblico.
I database filtrano il metabolita candidato, le identificazioni in base alla formula molecolare prevista con errore di massa, il tempo di ritenzione, la frammentazione dell'insource e la rilevanza biologica nelle tendenze osservate rispetto al disegno sperimentale. Ciò si tradurrà in un'identificazione del metabolita putativo. L'identificazione assoluta richiede l'abbinamento accurato della ritenzione di massa, del tempo e della frammentazione del composto sperimentale con uno standard autentico del metabolita putativo.
Infine, assegnare l'affidabilità dell'identificazione a tutte le identificazioni di metaboliti riportate in base alle raccomandazioni dell'iniziativa sugli standard metabolomici. Questo flusso di lavoro indica le fasi analitiche di base dell'esecuzione di un esperimento di profilazione dei metaboliti non mirati mediante U-P-L-C-M-S. I dati grezzi possono essere visualizzati come cromatogramma di picco di base.
Questo esempio mostra un campione di siero che è stato analizzato per gradiente a seguito dell'analisi statistica. L'identificazione dei metaboliti viene tentata per tutte le caratteristiche molecolari biologicamente importanti e statisticamente significative. Qui. La caffeina è stata identificata nel siero umano confrontando il tempo di ritenzione cromatografica, la massa accurata e il modello di frammentazione tra la caratteristica molecolare sperimentale e uno standard autentico del metabolita putativo.
Questo è un esempio di identificazione di un metabolita di primo livello Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come garantire la stabilità analitica durante la profilazione dei metaboliti su larga scala e non mirati del siero utilizzando la ms UPLC. Tuttavia, la stabilità analitica è solo un aspetto importante di un esperimento di profilazione dei metaboliti di successo. Anche la progettazione sperimentale e l'analisi e l'interpretazione dei dati a valle sono fondamentali.
Tuttavia, al di fuori dell'ambito di questa esercitazione video, questi argomenti vengono introdotti e discussi nel protocollo di testo.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per il profilo metabolomico non mirato di sieri mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata a spettrometria di massa (UPLC-MS). Vengono descritti dettagliatamente tutti i passaggi del flusso di lavoro, dalla preparazione del campione all'analisi dei dati e all'identificazione dei metaboliti.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Metabolomica
- Spettrometria di massa
- Chimica biologica
Sfondo
- Il profilo non mirato dei metaboliti è fondamentale per comprendere i processi metabolici.
- La UPLC-MS è una tecnica ampiamente utilizzata per analizzare campioni biologici complessi.
- Il controllo qualità è essenziale per garantire l'affidabilità dei risultati analitici.
- L'identificazione di biomarcatori a molecola piccola può essere utile in varie applicazioni della ricerca biomedica.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo robusto per l'estrazione e l'analisi dei metaboliti.
- Garantire la stabilità analitica attraverso misure di controllo qualità.
- Facilitare l'identificazione di biomarcatori in campioni di siero.
Metodi Utilizzati
- Estrazione dei metaboliti in formato piastra.
- Preparazione di un campione di controllo della qualità.
- Acquisizione dei dati spettrali di massa da campioni di controllo della qualità e sieri randomizzati.
- Pre-elaborazione dei dati e analisi statistica per l'identificazione dei metaboliti.
Risultati principali
- Profilazione riuscita di metaboliti in campioni di siero.
- Identificazione di potenziali biomarcatori a molecola piccola.
- Dimostrazione della robustezza del metodo UPLC-MS.
- Informazioni sulle variazioni metaboliche nel siero.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un quadro affidabile per il profilo metabolomico non mirato.
- Misure di controllo qualità migliorano la riproducibilità dei risultati.
- La UPLC-MS è efficace per l'identificazione di biomarcatori nel siero.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profilo metabolomico non mirato del siero mediante UPLC-MS consente un rilevamento imparziale di biomarcatori a molecola piccola, supportando la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci. Il metodo fornisce dati quantitativi e riproducibili, essenziali per la potenza statistica in studi su larga scala, facilitando decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla modulazione delle vie metaboliche. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici collegando gli esiti fenotipici a firme metaboliche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione imparziale di metaboliti nel siero.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico identificando le perturbazioni metaboliche associate alla modulazione del bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio fornendo biomarcatori basati su metaboliti per la conferma del meccanismo d'azione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo profili di base dei metaboliti.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio mediante un rigoroso monitoraggio dei campioni di controllo della qualità e l'acquisizione randomizzata dei campioni.
- Scalabilità: Permette una valutazione affidabile dei composti attraverso il rilevamento, l'allineamento e la normalizzazione delle caratteristiche nei dati di spettrometria di massa su ampi insiemi di campioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i risultati metabolomici della fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso flussi di lavoro per l'identificazione di biomarcatori.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta le decisioni sul proseguimento dello sviluppo del composto correlando le variazioni dei metaboliti con gli esiti fenotipici.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo richiedendo l'assegnazione del livello di confidenza nell'identificazione dei metaboliti secondo le raccomandazioni MSI.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi all'identificazione del composto attivo fino alla validazione preclinica, fornendo dati sui metaboliti che informano sull'interazione con il bersaglio e sull'analisi dei percorsi metabolici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il rilevamento di caratteristiche molecolari statisticamente significative nel siero.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e risultati quantitativi attraverso l'acquisizione ripetuta di campioni di controllo di qualità e di sieri randomizzati.
- Analisi: Permette il confronto tra condizioni mediante analisi statistica per determinare le caratteristiche molecolari di interesse biologico.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'identificazione dei metaboliti e l'assegnazione di livelli di confidenza basati sulla massa esatta, sul tempo di ritenzione e sulla frammentazione.
- Riutilizzo aziendale: Configura il flusso di lavoro come una capacità riutilizzabile per la scoperta su larga scala di biomarcatori in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie a un profilo metabolomico imparziale e all'identificazione di biomarcatori.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante preparazione dei campioni su piastre e monitoraggio del controllo qualità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie a informazioni metaboliche precoci.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su pannelli di biomarcatori metabolomici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in metabolomica, spettrometria di massa e analisi dei dati per l'identificazione dei metaboliti.
- Necessita di strumentazione UPLC-MS con capacità di eseguire analisi in lotti di grandi dimensioni e di gestione automatizzata dei campioni.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni, la randomizzazione e i protocolli di controllo qualità, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento per estendere il metodo a estratti di urina, tessuti o colture cellulari, come indicato nel protocollo.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di un elevato numero di campioni per ottenere potenza statistica a causa della variabilità metabolica biologica e ambientale.
