Name: Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Scopri il profilo metabolomico non mirato del siero su larga scala mediante UPLC-MS. Questo metodo consente l'estrazione robusta dei metaboliti, il controllo qualità e l'identificazione di biomarcatori molecolari per la ricerca biomedica.

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Il tutorial presentato è stato eseguito e sviluppato all'interno della Proteomics and Metabolomics Facility presso la Colorado State University, che è parzialmente finanziata dalla CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects.

1. Esempio di organizzazione
<ol>
	<li>Per creare una mappa delle piastre per la preparazione dei campioni su un foglio di calcolo, nella prima colonna inserire un elenco di campioni in ordine di caricamento. In una seconda colonna, inserisci le posizioni delle piastre a 96 pozzetti utilizzando la nomenclatura corretta per il tuo software di autocampionamento.</li>
	<li>Conservare un pozzetto in ogni piastra per i campioni QC.</li>
	<li>Se l'autocampionatore LC è in grado di gestire due piastre alla volta, separare l'elenco dei campioni in lotti di 190 e salvare queste informazioni in un secondo foglio di lavoro.</li>
	<li>All'interno di ciascuno di questi batch, utilizzare la funzione randomize [nota: "=rand()"in Excel] per randomizzare l'ordine di iniezione. Ora copia e incolla il tuo ordine di iniezione nel sistema software della coda di campionamento LC-MS. La randomizzazione dovrebbe avvenire tra i lotti, all'interno dei lotti ed essere univoca tra le repliche di iniezione.</li>
</ol>
2. Procedure di preparazione del siero e del controllo qualità (QC)
<ol>
	<li>Preparare un campione CQ da 10 ml contenente almeno quattro composti di massa e tempo di ritenzione noti che coprono l'eluizione cromatografica dell'esperimento. (Nota: caffeina, reserpina, sulfadimetossina e terfenadina a una concentrazione di 2 μg/ml ciascuno).</li>
	<li>Scongelare i campioni di siero su ghiaccio e agitare delicatamente per ~5 secondi.</li>
	<li>Pre-bagnare i puntali di un pipettatore a 12 canali con metanolo per evitare il gocciolamento dei puntali durante la dispensazione del campione. Quindi aggiungere 370 μl di metanolo freddo a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.</li>
	<li>Trasferire 100 μl di ciascun campione nella posizione della piastra corrispondente dalle mappe delle piastre. Coprire le piastre e incubare a -80 °C per 30 minuti per far precipitare le proteine.</li>
	<li>Centrifugare le piastre in una centrifuga a 4 °C a 3.200 x g per 30 minuti. Trasferire 250 μl di surnatante in un nuovo pozzetto a 96 pozzetti e ripetere la centrifugazione.</li>
	<li>Trasferire ora 60 μl di aliquote del surnatante in tre piastre da 96 pozzetti adatte per l'autocampionatore UPLC o LC.</li>
	<li>Aggiungere 100 μl di miscela di campioni QC nella posizione riservata del pozzetto sulla piastra.</li>
	<li>Sigillare ogni piastra con pellicola adesiva. Il solvente può evaporare rapidamente dopo che il pozzetto è stato perforato, pertanto le iniezioni devono essere eseguite solo una volta da ciascuna piastra. Le piastre nella coda dei campioni possono essere conservate a breve termine a -20 °C.</li>
</ol>
3. Acquisizione dati UPLC-MS
<ol>
	<li>Impostare l'autocampionatore a 4 °C e posizionare le prime due piastre nell'autocampionatore.</li>
	<li>Impostare il metodo di acquisizione utilizzando uno dei due gradienti di fase inversa alternativi. Il gradiente A è orientato verso le molecole non polari, mentre il gradiente B fornirà una migliore copertura delle molecole moderatamente polari.
	<ol>
		<li>Gradiente A: 
		<bordo della tabella="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Tempo (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>curva</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td>
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3.0</td>
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17,0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Pendenza B 
		<bordo della tabella="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Tempo (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>curva</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0,0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>Ore 16.05</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostare lo spettrometro di massa per raccogliere dati in modalità positiva a scansione da 50 a 1.200 m/z. Ulteriori condizioni specifiche dello strumento variano a seconda del sistema utilizzato. Di seguito sono riportate le condizioni d'uso sul nostro spettrometro di massa Waters Xevo G2 Q-TOF: Energia di collisione = 6V; Tempo di scansione = 0,2 secondi per scansione; Tensione capillare =2.200 V; Temperatura della sorgente = 150 °C Temperatura di desolvatazione = 350 °C Flusso di gas di desolvatazione (N2) = 800 L/ora).</li>
	<li>Iniettare i campioni QC cinque volte all'inizio di ogni lotto di campioni a 2 piastre. Dopo aver condizionato il sistema UPLC-MS con le prime due iniezioni, monitorare l'area del picco (<25% RSD), il tempo di ritenzione (+/- 0,05 min) e l'accuratezza della massa (+/- 3 ppm) dalla terza alla quinta iniezione. Potrebbe essere necessario regolare questi parametri per adattarli alle specifiche dello strumento utilizzato per l'acquisizione dei dati.</li>
	<li>Se i campioni QC vengono superati, acquisire i dati sui campioni di siero per queste due piastre. Se i campioni QC hanno esito negativo, i dati di esempio non vengono raccolti fino a quando il problema non viene risolto e i campioni QC non vengono superati. Nel nostro laboratorio abbiamo riscontrato che questi parametri sono costantemente stabili per tre giorni di iniezioni (cioè l'iniezione di 2 piastre da 96 pozzetti). Se il sistema risulta instabile durante questo periodo di tempo, potrebbero essere appropriate iniezioni di controllo qualità più frequenti. Il campione QC viene utilizzato non per correggere dati di scarsa qualità, ma per evitare che vengano raccolti dati di scarsa qualità.</li>
</ol>
4. Rilevamento dei picchi, integrazione, allineamento e normalizzazione
Ci sono una varietà di opzioni per eseguire questi passaggi, inclusi freeware e strumenti specifici del fornitore. Questo passaggio è stato saltato nel video tutorial, ma il nostro approccio è descritto di seguito come esempio.
Per ogni campione, i dati analitici generati da questo tipo di esperimento sono un profilo di ioni descritto da un tempo di ritenzione, un valore m/z e un'intensità spettrale. Un esperimento di profilazione dei metaboliti non mirati sarà composto da molti campioni e quindi il rilevamento dei picchi, l'allineamento del tempo di ritenzione e la normalizzazione devono essere eseguiti per consentire la successiva analisi statistica del set di dati.
<ol>
	<li>Esportazione di dati grezzi in formato .cdf utilizzando il software Waters DataBridge. Esegui il rilevamento dei picchi e l'allineamento del tempo di ritenzione utilizzando il pacchetto software XCMS 10 (freeware disponibile all'indirizzo <a href="http://metlin.scripps.edu/xcms/" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/xcms/</a>) e viene eseguito nell'ambiente statistico R11). Il sito Web contiene la documentazione su come scaricare ed eseguire il software.</li>
	<li>Utilizzare il metodo "matchedfilter" all'interno di XCMS con i seguenti parametri: larghezza completa a metà max = 8 sec, rapporto S/N = 3, massimo 100 picchi per ogni cromatogramma ionico estratto. Esegui i passaggi di raggruppamento delle funzioni, correzione del tempo di ritenzione, raggruppamento e riempimentoPicchi. L'output del software XCMS è una matrice di dati con tutte le caratteristiche rilevabili elencate come righe, ogni campione sperimentale come una colonna e le celle sono popolate con l'area di picco di ciascuna caratteristica in ogni campione. La trasposizione di questo set di dati può essere necessaria per l'incorporazione nei flussi di lavoro statistici a valle.</li>
	<li>Normalizzare la matrice di dati in R dividendo l'area del picco di ogni caratteristica in un dato campione per la somma dell'area del picco ionico estratto (indicato come corrente ionica totale o TIC per quel campione (moltiplicato per 100.000 per rendere i numeri più suscettibili per l'interpretazione visiva dei dati).</li>
	<li>Rimuovi i valori anomali. I valori anomali nei dati possono derivare da una cattiva iniezione di un campione buono o da una buona iniezione di un campione difettoso.
	<ol>
		<li>Esegui il rilevamento dei valori anomali in R utilizzando il pacchetto dei valori anomali con i seguenti parametri: (1) valori TIC e (2) punteggi PC con un'affidabilità del 99,9%.</li>
		<li>Se sono presenti valori anomali, i file di dati corrispondenti vengono rimossi e vengono eseguite nuovamente le procedure di rilevamento, allineamento e normalizzazione dei picchi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcolare la media delle aree di picco normalizzate in base all'identificatore del campione (per calcolare la media di più iniezioni). Questa operazione deve essere eseguita prima di eseguire l'analisi statistica (si noti che le repliche di iniezione tengono conto della variazione analitica, ma non possono essere utilizzate come repliche biologiche reali).</li>
</ol>
5. Analisi statistica
Per gli esperimenti di metabolomica, sono necessarie sia tecniche statistiche multivariate che univariate per l'interpretazione dei dati. Due tecniche comunemente utilizzate includono l'analisi delle componenti principali e l'analisi della varianza (ANOVA). Esistono diversi modi per affrontare l'analisi statistica dei dati e sono disponibili sia strumenti software open source che commerciali. Questo passaggio è stato saltato nel video tutorial, ma il nostro approccio è descritto di seguito come esempio.
<ol>
	<li>Eseguire ANOVA applicando una funzione aov al set di dati in R.</li>
	<li>Tenere conto dei falsi positivi utilizzando un aggiustamento di Benjamini-Hochberg (funzione p.adjust in R).</li>
	<li>Conduci la PCA con il set di dati in scala Pareto (può essere applicata anche la varianza unitaria) e centrato sulla media. Sia i punteggi PC che i carichi vengono calcolati utilizzando il pacchetto pcaMethods in R.</li>
	<li>Utilizzare i valori p ANOVA, i punteggi di carico e i parametri di variazione del fold per determinare le caratteristiche molecolari che meglio descrivono la variazione associata al trattamento sperimentale.</li>
	<li>Interroga manualmente ogni caratteristica molecolare di interesse per determinare se corrisponde a uno ione molecolare, a un addotto (ad es. sodio, potassio o dimero) o a una perdita neutra.</li>
</ol>
6. Identificazione dei metaboliti
Il flusso di lavoro presentato qui è molto generale e può essere applicato ai risultati di qualsiasi piattaforma strumentale. Una strategia alternativa è presentata nella sezione Discussione.
<ol>
	<li>Per tutte le caratteristiche statisticamente significative (come determinato dall'analisi nel passaggio 6), esaminare i dati grezzi e confermare che gli ioni genitori, gli addotti di sodio, gli isotopi e i frammenti seguono tendenze simili in tutto il set di dati. Ad esempio, il valore p derivato da ANOVA per uno ione genitore dovrebbe essere simile al suo isotopo. Ciò indica che entrambe le caratteristiche molecolari corrispondono allo stesso metabolita.</li>
	<li>Cerca misurazioni accurate della massa e/o perdite neutre di caratteristiche molecolari statisticamente significative (scegli l'isotopo C12 se più isotopi sono significativi) rispetto a database di metaboliti interni (se disponibili) o disponibili al pubblico come:
	<ol class="lroman">
		<li>Database del metaboloma umano (<a href="http://www.hmdb.ca/" target="_blank">http://www.hmdb.ca/</a>)</li>
		<li>Metlin (<a href="http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php" target="_blank">http://metlin.scripps.edu/metabo_search_alt2.php</a>)</li>
		<li>Banca di massa (<a href="http://www.massbank.jp/?lang=en" target="_blank">http://www.massbank.jp/?lang=en</a>)</li>
		<li>Mappe lipidiche (<a href="http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html" target="_blank">http://www.lipidmaps.org/data/standards/index.html</a>)</li>
		<li>Istituto Nazionale di Standard e Tecnologia MS Search (<a href="http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/" target="_blank">http://chemdata.nist.gov/mass-spc/ms-search/</a>)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utilizza il software per prevedere una formula molecolare dalla massa accurata e dalla distribuzione isotopica delle tue caratteristiche molecolari significative. Nel software Waters, questa operazione viene eseguita utilizzando lo strumento Elemental Comp nel pacchetto MassLynx.</li>
	<li>Filtra le identificazioni dei metaboliti candidati in base all'errore di massa (adatto alla tua piattaforma di strumenti), alla formula molecolare prevista, alla rilevanza biologica nelle tendenze osservate rispetto al disegno sperimentale e al tempo di ritenzione (ad esempio, i lipidi e altri composti non polari avranno tempi di ritenzione più lunghi quando si impiega la cromatografia in fase inversa).</li>
	<li>Eseguire esperimenti successivi per acquisire la frammentazione MS/MS per caratteristiche molecolari statisticamente significative. Ove possibile, l'identificazione dei metaboliti dovrebbe basarsi sulla corrispondenza dei picchi sperimentali di frammentazione e del tempo di ritenzione con quelli di uno standard autentico acquisito sullo stesso strumento. In alternativa, la frammentazione sperimentale può essere abbinata a un database spettrale.</li>
	<li>L'affidabilità dell'identificazione deve essere assegnata a tutte le identificazioni di metaboliti segnalate sulla base delle raccomandazioni dell'iniziativa sugli standard di metabolomica12. 
	Livello 1: identificazione molecolare sicura basata su parametri analitici ortogonali (massa accurata, tempo di ritenzione e frammentazione MS/MS) relativa a un composto autentico. 
	Il livello 2 si riferisce a una presunta base di identificazione sulle proprietà fisico-chimiche e/o sulla somiglianza spettrale con la letteratura o le librerie spettrali. 
	Il livello 3 si riferisce all'identificazione putativa di una classe di composti basata su proprietà fisico-chimiche o somiglianza spettrale. 
	Il livello 4 si riferisce a un composto sconosciuto.</li>
</ol>

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
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<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
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<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo tutorial vuole servire come punto di partenza per condurre la profilazione dei metaboliti non bersaglio su larga scala mediante UPLC-MS. Il flusso di lavoro è focalizzato sui metaboliti che possono essere estratti con un solvente acquoso di metanolo, trattenuti su una colonna UPLC C8 o C18 e rilevati come ioni positivi. Nella situazione in cui non esiste un pregiudizio predeterminato verso una specifica classe di metaboliti e si desidera un'ipotesi che generi un profilo globale, questo protocollo è prezioso in qua...

Il termine "metabolomica" può comprendere molte cose. Ad esempio, un esperimento di metabolomica può essere eseguito utilizzando una varietà di piattaforme analitiche come la risonanza magnetica nucleare e la cromatografia gassosa e/o liquida abbinata alla spettrometria di massa. Inoltre, gli esperimenti di metabolomica possono essere eseguiti in modo mirato o non mirato, o in una combinazione di entrambi. Un esperimento di metabolomica mirata comporterà l'analisi diretta di un pannello di molecole importanti per la questione biologica in questione (ad esempio, piccole molecole coinvolte nel ciclo TCA consentiranno una quantificazione accurata di tale via). In questa situazione, l'ipotesi biologica sta dettando la scelta dei metaboliti da mirare nell'analisi e le fasi analitiche sono ottimizzate per la rilevazione di queste molecole. In alternativa, si sta generando un'ipotesi di esperimento di metabolomica non mirata. In questo caso, l'esperimento viene eseguito in modo ampio e imparziale per consentire il rilevamento del maggior numero possibile di metaboliti. I risultati di un esperimento non mirato guideranno la fase successiva della ricerca (che in molti casi può comportare un flusso di lavoro metabolomico mirato). È anche possibile combinare i due approcci, nel qual caso un esperimento viene eseguito in modo non mirato mentre contemporaneamente un pannello di molecole note viene monitorato all'interno dei dati. 
Il tutorial presentato qui si concentra specificamente sulla profilazione dei metaboliti non mirati del siero. Come descritto in precedenza, l'approccio non mirato fornisce una visione imparziale dei metaboliti rilevabili, può generare grandi quantità di informazioni e, in ultima analisi, consentire nuove scoperte. L'uso di questo approccio, che impiega specificamente la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa (UPLC-MS), sta diventando sempre più diffuso e prevede le seguenti fasi: (1) disegno sperimentale (2) raccolta del campione (3) preparazione del campione (4) acquisizione dei dati mediante UPLC-MS (5) pre-elaborazione dei dati (rilevamento, integrazione, allineamento e normalizzazione dei picchi) (6) analisi statistica dei dati (sia uni- che multivariata) (7) identificazione dei metaboliti e (8) interpretazione. 
Attualmente, non esistono metodi standard stabiliti per la profilazione dei metaboliti non mirati basata su UPLC-MS e le successive fasi di pre-elaborazione dei dati. Questa mancanza di standardizzazione è dovuta in parte a una delle principali sfide analitiche della profilazione dei metaboliti; la diversità chimica del metaboloma. A causa di questa diversità, è impossibile per un singolo metodo di estrazione o di acquisizione con spettrometria di massa fornire una copertura completa di tutti i metaboliti in un'unica analisi. In teoria, la copertura dei metaboliti può essere massimizzata utilizzando estrazioni multiple (ad es. acquosa, metanolo, cloroformio: metanolo, ecc.) abbinate a varie condizioni cromatografiche (ad es. fase inversa, HILIC, ecc.) e varie modalità di ionizzazione (ad es. ione positivo, ione negativo, ionizzazione chimica, ecc.).). Spesso, tuttavia, i ricercatori non hanno una predilezione predeterminata per una specifica classe chimica e quindi la spesa per l'esecuzione di estrazioni multiple e l'acquisizione di strumenti non è giustificata, soprattutto per esperimenti su larga scala. Pertanto, il video tutorial qui presentato è stato progettato per fornire una procedura generale per la profilazione del siero di metaboliti non mirati su larga scala mediante UPLC-MS. Consentirà ai laboratori nuovi e consolidati di eseguire questi tipi di esperimenti e gli elementi costitutivi su cui possono espandere l'approccio per vari tipi di campioni, classi chimiche specifiche o analisi mirate. In particolare, questo protocollo includerà le fasi di: preparazione del campione di siero, organizzazione del campione per studi su larga scala, acquisizione dei dati UPLC-MS, procedure di controllo qualità (QC) e identificazione dei metaboliti. Vengono inoltre presentate strategie per la pre-elaborazione dei dati e l'analisi statistica.
Il protocollo non si concentrerà sulle fasi della progettazione sperimentale, della raccolta dei campioni o dell'interpretazione dei dati biologici poiché esula dall'ambito di questo tutorial. Tuttavia, esistono molte risorse in letteratura per questi argomenti e gli autori incoraggiano i ricercatori nuovi alla metabolomica ad esplorarli a fondo 4, 5, 6, 7, 8, 9. In particolare, la progettazione sperimentale è estremamente importante ed è fondamentale per il successo di un esperimento di metabolomica non mirata. Fattori quali l'appropriata replicazione biologica e la coerenza della procedura di raccolta dei campioni (ad esempio tempo al banco, temperatura di conservazione, tempo di conservazione, congelamento-disgelo, ecc.) devono essere presi in considerazione per garantire uno studio valido e facilitare un'adeguata interpretazione biologica dei dati.

<table><tbody><tr><td>Piastre a 96 pozzetti - 500 &mu; pozzetti</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Questi sono utilizzati per la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Tappetini per piastre a 96 pozzetti</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Questi sono utilizzati per la preparazione del campione</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti - 350 &mu; l pozzi</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Questi sono utilizzati per l'iniezione di campioni</td></tr><tr><td>Tappetini per piastre a 96 pozzetti</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Questi sono utilizzati per l'iniezione di campioni</td></tr><tr><td>Termosigillature per piastre a 96 pozzetti</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Questi possono essere utilizzati per l'iniezione di campioni o per la conservazione a lungo termine</td></tr><tr><td>Termosigillatrice per piastre a 96 pozzetti </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo di grado LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile di grado LC-MS</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr> Acido formico di <tr><td>grado LC-MS</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico di grado LC-MS</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore elettronico multicanale</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Puntali Pipett</td><td>Eclipse (acquistati tramite Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - contatto Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC)</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - contatto Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Colonna UPLC C8 (opzione gradiente a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>colonna UplC T3 (opzione gradiente b) </td><td>Waters Corporation Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa Xevo G2 Q-TOF</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - contattare Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

su larga scala e non mirato profiling metabolomica di siero da ultra performance liquid chromatography-spettrometria di massa (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo. L'approccio offre un'analisi imparziale e approfondita che può consentire lo sviluppo di test diagnostici, nuove terapie e approfondire la nostra comprensione dei processi patologici. La diversità chimica intrinseca del metaboloma crea sfide analitiche significative e non esiste un unico approccio sperimentale in grado di rilevare tutti i metaboliti. Inoltre, la variazione biologica nel metabolismo individuale e la dipendenza del metabolismo da fattori ambientali richiedono un numero elevato di campioni per raggiungere la potenza statistica appropriata necessaria per un'interpretazione biologica significativa. Per affrontare queste sfide, questo tutorial delinea un flusso di lavoro analitico per la profilazione di metaboliti non mirati su larga scala del siero mediante UPLC-MS. La procedura include linee guida per l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti e consentirà un'acquisizione affidabile dei dati per esperimenti di grandi dimensioni e fornirà un punto di partenza per i laboratori che non conoscono la profilazione dei metaboliti non mirati mediante UPLC-MS.

I passaggi analitici di base di un esperimento di profilazione metabolica non mirata mediante UPLC-MS sono illustrati nella Figura 1. I dati grezzi per ogni campione possono essere visualizzati come un cromatogramma del picco di base. La Figura 2 mostra un esempio di cromatogramma del picco di base di un campione di siero analizzato mediante l'opzione di gradiente (a) riportata nel tutorial. Dopo l'analisi statistica descritta in precedenza, si tenta l'identificazione dei metaboliti per ...

La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo. Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi metabolomica non mirata robusta del siero in un esperimento su larga scala. In primo luogo, estrarre i metaboliti in formato piastra. Stabilire un campione e un metodo di controllo di qualità robusti per garantire la stabilità analitica nel tempo.Quindi acquisire i dati spettrometrici di massa su campioni di controllo di qualità e sieri randomizzati in replicati, procedere alla pre-elaborazione dei dati, all'analisi statistica e all'identificazione dei metaboliti. I risultati del profilo metabolomico non mirato mediante U-P-L-C-M-S possono essere utilizzati per identificare biomarcatori a basso peso molecolare nel siero. Il protocollo viene qui presentato per l'analisi del siero.Tuttavia, può essere facilmente esteso all'analisi di altri fluidi biologici, come urina, tessuti ed estratti di colture cellulari. Per creare una mappa della piastra per la preparazione dei campioni, aprire un foglio di calcolo. Nella prima colonna, inserire l'elenco dei campioni in ordine di caricamento. Nella seconda colonna, inserire le posizioni della piastra a 96 pozzetti utilizzando la nomenclatura corretta per il software del vostro campionatore automatico.Conservare un pozzetto per ogni piastra per il campione di controllo qualità. Se il campionatore automatico LC può gestire due piastre contemporaneamente, suddividere l'elenco dei campioni in lotti da 190 e salvare queste informazioni in un secondo foglio di lavoro. All'interno di ciascuno di questi lotti, randomizzare l'ordine di iniezione.Ora copia e incolla il tuo ordine di iniezione nel sistema software della coda di campioni per LCMS. Riserva le prime tre righe della coda di campioni per le iniezioni di condizionamento della colonna. Prepara un campione stock di 10 millilitri di controllo qualità (QC) contenente almeno quattro composti di massa e tempo di ritenzione noti che coprano l'intera eluizione cromatografica dell'esperimento.Scongelare i campioni di siero sul ghiaccio e vorticare delicatamente per circa cinque secondi. Inumidire preventivamente le punte di una pipetta multicanale con metanolo per aiutare a prevenire perdite dalle punte durante la dispensazione dei campioni. Quindi aggiungere 370 microlitri di metanolo freddo in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e trasferire 100 microlitri di ciascun campione nella posizione corrispondente sulla piastra, seguendo le mappe della piastra.Coprire le piastre e incubare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Per precipitare le proteine, centrifugare le piastre a 3.200 G e a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, trasferire 250 microlitri del soprannatante in una nuova piastra a 96 pozzetti e ripetere il passaggio di centrifugazione.Ora trasferire aliquote di 60 microlitri dello snat in 3 piastre a 96 pozzetti adatte al campionatore automatico UPLC o lc. Aggiungere 100 microlitri di miscela campione QC nella posizione di pozzetto riservata sulla piastra. Sigillare ogni piastra con pellicola adesiva.Impostare il campionatore automatico a quattro gradi Celsius. Posizionare le prime due piastre nel campionatore automatico. Configurare il metodo di acquisizione utilizzando uno dei due gradienti alternativi in fase inversa.Il gradiente A è orientato verso molecole non polari. Mentre il gradiente B fornirà una copertura migliorata di molecole moderatamente polari. Impostare lo spettrometro di massa per acquisire dati in modalità positiva, eseguendo la scansione da un rapporto massa/carica di 50 a 1200.Le condizioni specifiche aggiuntive dello strumento varieranno in base al sistema utilizzato all'inizio di ciascuna serie. Eseguire manualmente l'iniezione dei campioni di controllo qualità (QC) cinque volte. Utilizzare le iniezioni di QC dalla terza alla quinta per monitorare l'area del picco con una RSD inferiore al 25%, un tempo di ritenzione di ± 0,05 minuti e un'accuratezza massica di ± 3 parti per milione.Questi parametri potrebbero necessitare di essere regolati in base alle specifiche dello strumento utilizzato per l'acquisizione dei dati. Se i campioni di controllo di qualità superano i controlli, acquisire i dati sui campioni sierici per quelle due piastre al termine dell'acquisizione dell'intero set di dati. Eseguire la rilevazione delle caratteristiche, l'allineamento e la normalizzazione dei dati di spettrometria di massa per l'intero set di dati.Quindi eseguire un'analisi statistica per determinare le caratteristiche molecolari di interesse biologico. Questi passaggi sono descritti nel protocollo testuale. Il seguente flusso di lavoro rappresenta una panoramica concettuale del processo di identificazione dei metaboliti.Una strategia alternativa è fornita nel protocollo testuale. Utilizzare un software per prevedere una formula molecolare a partire dalla massa esatta e dalla distribuzione isotopica delle caratteristiche molecolari significative. Successivamente, cercare le misurazioni della massa esatta confrontandole con metaboliti interni o pubblici.I database filtrano il metabolita candidato, le identificazioni in base all'errore di massa, alla formula molecolare prevista, al tempo di ritenzione, alla frammentazione in sorgente e alla rilevanza biologica nelle tendenze osservate rispetto al disegno sperimentale. Ciò porterà a un'identificazione putativa del metabolita. L'identificazione assoluta richiede la corrispondenza della massa accurata, del tempo di ritenzione e della frammentazione del composto sperimentale con uno standard autentico del metabolita putativo.Infine, assegnare un livello di confidenza all'identificazione per tutte le identificazioni di metaboliti riportate, in base alle raccomandazioni del Metabolomic Standards Initiative. Questo flusso di lavoro illustra i passaggi analitici di base per eseguire un esperimento di profilazione metabolica non mirata mediante U-P-L-C-M-S. I dati grezzi possono essere visualizzati come cromatogramma del picco di base.In questo esempio viene mostrato un campione di siero analizzato mediante una gradiente successivamente all'analisi statistica. Si tenta l'identificazione dei metaboliti per tutte le caratteristiche molecolari biologicamente importanti e statisticamente significative. Qui, la caffeina è stata identificata nel siero umano confrontando il tempo di ritenzione cromatografico, la massa esatta e il profilo di frammentazione tra la caratteristica molecolare sperimentale e uno standard autentico del metabolita presunto.Questo è un esempio di identificazione di metaboliti di livello uno. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come garantire la stabilità analitica durante analisi su larga scala, non mirate, del profilo dei metaboliti nel siero mediante UPLC ms. Tuttavia, la stabilità analitica è solo uno degli aspetti importanti di un esperimento di profilazione dei metaboliti di successo. Anche la progettazione sperimentale e l'analisi e interpretazione dei dati successivi sono fondamentali.Ma al di fuori dell'ambito di questo tutorial video, questi argomenti vengono introdotti e discussi nel protocollo testuale.

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Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal

Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)

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