Su larga scala e non mirato Profiling Metabolomica di siero da Ultra Performance Liquid Chromatography-Spettrometria di Massa (UPLC-MS)
14 marzo 2013
La profilazione dei metaboliti non mirati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con spettrometria di massa (UPLC-MS) è una tecnica potente per studiare il metabolismo. Questo articolo descrive un flusso di lavoro tipico utilizzato per la profilazione dei metaboliti non mirati del siero, tra cui l'organizzazione e la preparazione dei campioni, l'acquisizione dei dati, l'analisi dei dati, il controllo di qualità e l'identificazione dei metaboliti.
L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'analisi metabolomica non mirata robusta del siero in un esperimento su larga scala. In primo luogo, estrarre i metaboliti in formato piastra. Stabilire un campione e un metodo di controllo di qualità robusti per garantire la stabilità analitica nel tempo.
Quindi acquisire i dati spettrometrici di massa su campioni di controllo di qualità e sieri randomizzati in replicati, procedere alla pre-elaborazione dei dati, all'analisi statistica e all'identificazione dei metaboliti. I risultati del profilo metabolomico non mirato mediante U-P-L-C-M-S possono essere utilizzati per identificare biomarcatori a basso peso molecolare nel siero. Il protocollo viene qui presentato per l'analisi del siero.
Tuttavia, può essere facilmente esteso all'analisi di altri fluidi biologici, come urina, tessuti ed estratti di colture cellulari. Per creare una mappa della piastra per la preparazione dei campioni, aprire un foglio di calcolo. Nella prima colonna, inserire l'elenco dei campioni in ordine di caricamento. Nella seconda colonna, inserire le posizioni della piastra a 96 pozzetti utilizzando la nomenclatura corretta per il software del vostro campionatore automatico.
Conservare un pozzetto per ogni piastra per il campione di controllo qualità. Se il campionatore automatico LC può gestire due piastre contemporaneamente, suddividere l'elenco dei campioni in lotti da 190 e salvare queste informazioni in un secondo foglio di lavoro. All'interno di ciascuno di questi lotti, randomizzare l'ordine di iniezione.
Ora copia e incolla il tuo ordine di iniezione nel sistema software della coda di campioni per LCMS. Riserva le prime tre righe della coda di campioni per le iniezioni di condizionamento della colonna. Prepara un campione stock di 10 millilitri di controllo qualità (QC) contenente almeno quattro composti di massa e tempo di ritenzione noti che coprano l'intera eluizione cromatografica dell'esperimento.
Scongelare i campioni di siero sul ghiaccio e vorticare delicatamente per circa cinque secondi. Inumidire preventivamente le punte di una pipetta multicanale con metanolo per aiutare a prevenire perdite dalle punte durante la dispensazione dei campioni. Quindi aggiungere 370 microlitri di metanolo freddo in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e trasferire 100 microlitri di ciascun campione nella posizione corrispondente sulla piastra, seguendo le mappe della piastra.
Coprire le piastre e incubare a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti. Per precipitare le proteine, centrifugare le piastre a 3.200 G e a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, trasferire 250 microlitri del soprannatante in una nuova piastra a 96 pozzetti e ripetere il passaggio di centrifugazione.
Ora trasferire aliquote di 60 microlitri dello snat in 3 piastre a 96 pozzetti adatte al campionatore automatico UPLC o lc. Aggiungere 100 microlitri di miscela campione QC nella posizione di pozzetto riservata sulla piastra. Sigillare ogni piastra con pellicola adesiva.
Impostare il campionatore automatico a quattro gradi Celsius. Posizionare le prime due piastre nel campionatore automatico. Configurare il metodo di acquisizione utilizzando uno dei due gradienti alternativi in fase inversa.
Il gradiente A è orientato verso molecole non polari. Mentre il gradiente B fornirà una copertura migliorata di molecole moderatamente polari. Impostare lo spettrometro di massa per acquisire dati in modalità positiva, eseguendo la scansione da un rapporto massa/carica di 50 a 1200.
Le condizioni specifiche aggiuntive dello strumento varieranno in base al sistema utilizzato all'inizio di ciascuna serie. Eseguire manualmente l'iniezione dei campioni di controllo qualità (QC) cinque volte. Utilizzare le iniezioni di QC dalla terza alla quinta per monitorare l'area del picco con una RSD inferiore al 25%, un tempo di ritenzione di ± 0,05 minuti e un'accuratezza massica di ± 3 parti per milione.
Questi parametri potrebbero necessitare di essere regolati in base alle specifiche dello strumento utilizzato per l'acquisizione dei dati. Se i campioni di controllo di qualità superano i controlli, acquisire i dati sui campioni sierici per quelle due piastre al termine dell'acquisizione dell'intero set di dati. Eseguire la rilevazione delle caratteristiche, l'allineamento e la normalizzazione dei dati di spettrometria di massa per l'intero set di dati.
Quindi eseguire un'analisi statistica per determinare le caratteristiche molecolari di interesse biologico. Questi passaggi sono descritti nel protocollo testuale. Il seguente flusso di lavoro rappresenta una panoramica concettuale del processo di identificazione dei metaboliti.
Una strategia alternativa è fornita nel protocollo testuale. Utilizzare un software per prevedere una formula molecolare a partire dalla massa esatta e dalla distribuzione isotopica delle caratteristiche molecolari significative. Successivamente, cercare le misurazioni della massa esatta confrontandole con metaboliti interni o pubblici.
I database filtrano il metabolita candidato, le identificazioni in base all'errore di massa, alla formula molecolare prevista, al tempo di ritenzione, alla frammentazione in sorgente e alla rilevanza biologica nelle tendenze osservate rispetto al disegno sperimentale. Ciò porterà a un'identificazione putativa del metabolita. L'identificazione assoluta richiede la corrispondenza della massa accurata, del tempo di ritenzione e della frammentazione del composto sperimentale con uno standard autentico del metabolita putativo.
Infine, assegnare un livello di confidenza all'identificazione per tutte le identificazioni di metaboliti riportate, in base alle raccomandazioni del Metabolomic Standards Initiative. Questo flusso di lavoro illustra i passaggi analitici di base per eseguire un esperimento di profilazione metabolica non mirata mediante U-P-L-C-M-S. I dati grezzi possono essere visualizzati come cromatogramma del picco di base.
In questo esempio viene mostrato un campione di siero analizzato mediante una gradiente successivamente all'analisi statistica. Si tenta l'identificazione dei metaboliti per tutte le caratteristiche molecolari biologicamente importanti e statisticamente significative. Qui, la caffeina è stata identificata nel siero umano confrontando il tempo di ritenzione cromatografico, la massa esatta e il profilo di frammentazione tra la caratteristica molecolare sperimentale e uno standard autentico del metabolita presunto.
Questo è un esempio di identificazione di metaboliti di livello uno. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come garantire la stabilità analitica durante analisi su larga scala, non mirate, del profilo dei metaboliti nel siero mediante UPLC ms. Tuttavia, la stabilità analitica è solo uno degli aspetti importanti di un esperimento di profilazione dei metaboliti di successo. Anche la progettazione sperimentale e l'analisi e interpretazione dei dati successivi sono fondamentali.
Ma al di fuori dell'ambito di questo tutorial video, questi argomenti vengono introdotti e discussi nel protocollo testuale.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per il profilo metabolomico non mirato di sieri mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni abbinata a spettrometria di massa (UPLC-MS). Vengono descritti dettagliatamente tutti i passaggi del flusso di lavoro, dalla preparazione del campione all'analisi dei dati e all'identificazione dei metaboliti.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Metabolomica
- Spettrometria di massa
- Chimica biologica
Sfondo
- Il profilo non mirato dei metaboliti è fondamentale per comprendere i processi metabolici.
- La UPLC-MS è una tecnica ampiamente utilizzata per analizzare campioni biologici complessi.
- Il controllo qualità è essenziale per garantire l'affidabilità dei risultati analitici.
- L'identificazione di biomarcatori a molecola piccola può essere utile in varie applicazioni della ricerca biomedica.
Scopo dello studio
- Stabilire un metodo robusto per l'estrazione e l'analisi dei metaboliti.
- Garantire la stabilità analitica attraverso misure di controllo qualità.
- Facilitare l'identificazione di biomarcatori in campioni di siero.
Metodi Utilizzati
- Estrazione dei metaboliti in formato piastra.
- Preparazione di un campione di controllo della qualità.
- Acquisizione dei dati spettrali di massa da campioni di controllo della qualità e sieri randomizzati.
- Pre-elaborazione dei dati e analisi statistica per l'identificazione dei metaboliti.
Risultati principali
- Profilazione riuscita di metaboliti in campioni di siero.
- Identificazione di potenziali biomarcatori a molecola piccola.
- Dimostrazione della robustezza del metodo UPLC-MS.
- Informazioni sulle variazioni metaboliche nel siero.
Conclusioni
- Il protocollo fornisce un quadro affidabile per il profilo metabolomico non mirato.
- Misure di controllo qualità migliorano la riproducibilità dei risultati.
- La UPLC-MS è efficace per l'identificazione di biomarcatori nel siero.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il profilo metabolomico non mirato del siero mediante UPLC-MS consente un rilevamento imparziale di biomarcatori a molecola piccola, supportando la validazione precoce dei bersagli e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci. Il metodo fornisce dati quantitativi e riproducibili, essenziali per la potenza statistica in studi su larga scala, facilitando decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla modulazione delle vie metaboliche. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici collegando gli esiti fenotipici a firme metaboliche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione imparziale di metaboliti nel siero.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico identificando le perturbazioni metaboliche associate alla modulazione del bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio fornendo biomarcatori basati su metaboliti per la conferma del meccanismo d'azione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo profili di base dei metaboliti.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio mediante un rigoroso monitoraggio dei campioni di controllo della qualità e l'acquisizione randomizzata dei campioni.
- Scalabilità: Permette una valutazione affidabile dei composti attraverso il rilevamento, l'allineamento e la normalizzazione delle caratteristiche nei dati di spettrometria di massa su ampi insiemi di campioni.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega i risultati metabolomici della fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso flussi di lavoro per l'identificazione di biomarcatori.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta le decisioni sul proseguimento dello sviluppo del composto correlando le variazioni dei metaboliti con gli esiti fenotipici.
- De-risking Meccanicistico: Si concentra sul valore predittivo richiedendo l'assegnazione del livello di confidenza nell'identificazione dei metaboliti secondo le raccomandazioni MSI.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi all'identificazione del composto attivo fino alla validazione preclinica, fornendo dati sui metaboliti che informano sull'interazione con il bersaglio e sull'analisi dei percorsi metabolici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il rilevamento di caratteristiche molecolari statisticamente significative nel siero.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e risultati quantitativi attraverso l'acquisizione ripetuta di campioni di controllo di qualità e di sieri randomizzati.
- Analisi: Permette il confronto tra condizioni mediante analisi statistica per determinare le caratteristiche molecolari di interesse biologico.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'identificazione dei metaboliti e l'assegnazione di livelli di confidenza basati sulla massa esatta, sul tempo di ritenzione e sulla frammentazione.
- Riutilizzo aziendale: Configura il flusso di lavoro come una capacità riutilizzabile per la scoperta su larga scala di biomarcatori in diversi ambiti terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva grazie a un profilo metabolomico imparziale e all'identificazione di biomarcatori.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante preparazione dei campioni su piastre e monitoraggio del controllo qualità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie a informazioni metaboliche precoci.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su pannelli di biomarcatori metabolomici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in metabolomica, spettrometria di massa e analisi dei dati per l'identificazione dei metaboliti.
- Necessita di strumentazione UPLC-MS con capacità di eseguire analisi in lotti di grandi dimensioni e di gestione automatizzata dei campioni.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni, la randomizzazione e i protocolli di controllo qualità, al fine di garantire la riproducibilità.
- Comporta considerazioni di adattamento per estendere il metodo a estratti di urina, tessuti o colture cellulari, come indicato nel protocollo.
- Presenta limitazioni pratiche, come la necessità di un elevato numero di campioni per ottenere potenza statistica a causa della variabilità metabolica biologica e ambientale.
