RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

L'obiettivo generale di questa procedura è la previsione della struttura secondaria dell'RNA con risoluzione a singolo nucleotide. Ciò si ottiene modificando prima chimicamente l'RNA ripiegato con un reagente elettrofilo che isola S le regioni a singolo filamento o flessibili dell'RNA. Il secondo passo consiste nell'utilizzare la trascrizione inversa per rilevare i siti dell'RNA che sono stati modificati chimicamente.

Successivamente, i prodotti CD NA della trascrizione inversa vengono frazionati mediante elettroforesi capillare. Il passaggio finale è l'elaborazione e la normalizzazione dei dati. In definitiva, il software per la struttura dell'RNA viene utilizzato per prevedere la struttura secondaria dell'RNA utilizzando i vincoli di energia pseudo libera derivati dall'analisi della forma.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare, come ad esempio come la struttura dell'RNA governa le funzioni degli RNA catalitici e non correnti e come i genomi dell'RNA virale regolano la multifunzionalità dei loro genomi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla nostra terapia e diagnosi di malattie virali o cancro perché ottenere la comprensione della struttura secondaria dell'RNA potrebbe aiutare la progettazione di farmaci basati sulla struttura. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulla struttura degli RNA prodotti dalla trascrizione in vitro, può essere applicato anche in vivo poiché i reagenti di forma sono permeabili alle cellule.

Prima di iniziare questa procedura, preparare l'RNA mediante trascrizione in vitro. Utilizzando un kit di trascrizione commerciale. Gli RNA devono essere conservati in tampone TE tra meno 20 e meno 80 gradi Celsius in una provetta da microcentrifuga da 0,5 microlitri.

Diluire 12 moli di pico di RNA a 18 microlitri con acqua e aggiungere due microlitri di 10 x miscela di tampone di rinaturazione picchiettando la provetta, quindi con una breve centrifuga scaldare la miscela nella provetta a 85 gradi Celsius per un minuto, quindi raffreddare a quattro gradi Celsius a una velocità di 0,1 gradi Celsius al secondo. Aggiungere 100 microlitri di acqua e 30 microlitri di tampone pieghevole cinque x alla provetta della microcentrifuga. Successivamente, incubare il contenuto della provetta a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti a seconda dell'RNA da piegare.

In generale, il ripiegamento dipendente dal magnesio di RNA più lunghi e strutturati richiede tempi di incubazione più lunghi Trasferire un'aliquota da 72 microlitri in ciascuna delle due provette per microcentrifuga da 0,5 millilitri, che devono essere etichettate rispettivamente come modificate e di controllo. Il passo successivo consiste nell'aggiungere otto microlitri di dimetilsolfossido anidro alla miscela di controllo e mettere da parte. Quindi aggiungere otto microlitri di 10 x e MIA alla miscela modificata.

Incubare la miscela modificata e di controllo a 37 gradi Celsius per 50 minuti. Aggiungere otto microlitri di tre acetato di sodio, pH 5,28 microlitri, EDTA da 100 millimolari, 240 microlitri di etanolo freddo e un microlitro di 10 milligrammi per millilitro. Versare il glicogeno nella provetta miscelata modificata per far precipitare l'RNA modificato, refrigerare il contenuto della provetta per due ore a meno 20 gradi Celsius, quindi centrifugare a 14.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi lavare il pellet due volte con centrifugazione fredda di etanolo al 70% per cinque minuti. Dopo ogni lavaggio, rimuovere il surnatante con la micropipetta e asciugare il pellet all'aria per cinque minuti. A temperatura ambiente, preparare i campioni modificati e di controllo per la trascrizione inversa in provette da microcentrifuga da 0,5 millilitri.

Per la reazione modificata, mescolare cinque microlitri di RNA modificato, sei microlitri di acqua e un microlitro di una soluzione di primer marcata con sci five da 10 micromolari. Per la reazione di controllo, mescolare cinque microlitri di RNA di controllo, sei microlitri di acqua e un microlitro di una soluzione di primer marcata con 10 micromolari sci 5.5. Posizionare le provette in un termociclatore e inginocchiare l'innesco sull'RNA.

Durante un inginocchiamento preparare 2,5 x RT mix. Per ogni reazione RT, mescolare bene e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti prima di aggiungere alle reazioni in ginocchio. Una volta che la temperatura delle reazioni in ginocchio raggiunge i 50 gradi Celsius, aggiungere otto microlitri di 2,5 XRT.

Mescolare e incubare per 50 minuti a 50 gradi Celsius. Successivamente, idrolizzato l'RNA aggiungendo un microlitro di idrossido di sodio a quattro molari e riscaldandolo a 90 gradi Celsius per tre minuti. Raffreddare le reazioni sul ghiaccio e poi neutralizzarle aggiungendo due microlitri di acido cloridrico molare a due molari.

Ora combina le reazioni modificate e di controllo e aggiungi 0,1 volume, o un decimo del volume totale di reazione di tre molari di acetato di sodio e 100 millimolari EDTA, 1,5 volumi di etanolo freddo e un microlitro di 10 milligrammi per millilitro. Glicogeno. Ciò provoca la precipitazione del CDNA fuori dalla soluzione. Refrigerare la soluzione per due ore, quindi centrifugare a 14.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Lavare il pellet due volte con una risospensione fredda di etanolo al 70%, il CD NA pellettato in 40 microlitri di ammide in forma deionizzata riscaldando a 65 gradi Celsius per 10 minuti, seguito da un vigoroso vortice per almeno 30 minuti per la preparazione della reazione di sequenziamento in una miscela di provette per microcentrifuga da 0,5 millilitri 40 microlitri della miscela di terminazione DDA. Cinque moli PICA del modello di DNA, 4,6 microlitri di tampone 10 x sease e 10 microlitri di primer marcato D two ben letto. A questa miscela, aggiungere 4,6 microlitri di QUIN A e diluire con acqua per portare il volume totale a 82 microlitri.

Preparare una seconda reazione di sequenziamento allo stesso modo utilizzando invece il primer marcato con DDT e lycor IR 800. Successivamente, procedere all'amplificazione PCR utilizzando le condizioni consigliate dall'USB fornite. Aggiungere 16 microlitri di acetato di sodio a tre molari, pH 5,2, 16 microlitri di EDTA a 100 millimolari, un microlitro di glicogeno a 10 milligrammi per millilitro e 480 microlitri di etanolo al 95% per precipitare il DNA, quindi incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti e centrifugare a 14.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Risospendere il CD NA pellettato in 100 microlitri di ammide in forma deionizzata riscaldando a 65 gradi Celsius per 10 minuti, seguito da un vigoroso vortice per almeno 30 minuti. Successivamente, mescolare 40 microlitri di campioni di forma aggregata con 10 microlitri di scale di sequenziamento raggruppate e pipettare il volume totale del campione in piastre campione a 96 pozzetti, programmare e preparare lo strumento di elettroforesi capillare e avviare una corsa secondo le istruzioni del produttore. Le quattro tracce sovrapposte con codice colore sono prodotte dalla migrazione dei quattro set di prodotti di reazione attraverso il capillare come segue, la traccia blu mostra i prodotti di trascrizione inversa generati dalla trascrizione inversa di RNA modificati NMIA.

La traccia verde mostra i prodotti di trascrizione inversa da RNA ripiegati ma altrimenti non modificati. La Traccia Nera mostra la scala di sequenziamento D-N-A-D-D-G e la Traccia Rossa mostra la scala di sequenziamento DDT. Le tracce grezze dell'elettroforesi capillare vengono separate, elaborate, allineate e integrate utilizzando il software di ricerca della forma.

L'analisi dei dati inizia con l'importazione degli elettroferogrammi dal sistema di elettroforesi capillare nel cercatore di forme. La finestra centrale di visualizzazione dei dati fornisce un feedback grafico su ogni fase di elaborazione dei dati. La finestra di ispezione degli strumenti situata in basso a sinistra dello schermo mostra i parametri per gli strumenti selezionati nell'ispettore di scripting.

L'ispettore di scripting nella parte superiore dello schermo visualizza gli strumenti che sono stati applicati ai dati, regola gli elettroferogrammi per correggere lo sfondo fluorescente, la sovrapposizione spettrale tra i canali fluorescenti, gli spostamenti di mobilità, impartiti da primer etichettati in modo diverso, il decadimento del segnale derivante dalla terminazione prematura della trascrizione inversa e le differenze nell'intensità della fluorescenza dei prodotti comuni etichettati con diversi fluorofori nello strumento di ricerca della forma, si allinea e integra. Utilizzare la funzione di configurazione per assegnare automaticamente le identità ai singoli picchi e correlare queste informazioni alla sequenza di RNA definita dall'input dell'utente e alle due scale di sequenziamento per incorporare i profili di reattività nucleotidica nell'algoritmo di struttura secondaria utilizzato dal software RNA structure 5.3 e/o per confrontare i profili di RNA strettamente correlati. Normalizzare i dati della forma in modo standardizzato.

A tale scopo, escludere i valori anomali dai calcoli successivi. Determinare la reattività massima effettiva e normalizzare dividendo tutti i valori di reattività per il massimo effettivo. Il software per la struttura dell'RNA viene utilizzato per prevedere le strutture secondarie dell'RNA supportate sperimentalmente utilizzando i vincoli di energia pseudo libera dall'analisi della forma.

Il software fornisce rappresentazioni grafiche dell'energia più bassa alle strutture DRNA, nonché una rappresentazione testuale di queste strutture. Nella notazione a parentesi graffe, la sequenza e l'annotazione a parentesi graffe devono essere importate nel visualizzatore della struttura dell'RNA mostrata qui è la struttura 2D dell'elemento di risposta all'HIV rev stem loop due regione generata nella struttura dell'RNA 5.3 utilizzando i profili di reattività derivati dalla forma e visualizzata utilizzando un'applet leggera Java. I nucleotidi colorati in blu hanno una bassa reattività, mentre i nucleotidi colorati in rosso hanno una reattività maggiore Una volta padroneggiata, la tecnica può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il modello di RNA risultante deve essere attentamente interpretato prima di giungere a conclusioni finali sulla struttura secondaria dell'RNA Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'uso del sondaggio dei radicali idrossilati attraverso metodi di scissione spaziale, possono essere eseguiti per chiarire complesse interazioni terziarie e, infine, consentire ai ricercatori di determinare le strutture di questi RNA in tre dimensioni.