Name: RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Scopri la tecnica SHAPE per prevedere la struttura secondaria dell'RNA con risoluzione a singolo nucleotide. Questo metodo combina modifiche chimiche, trascrizione inversa ed elettroforesi capillare per analizzare molecole di RNA complesse.

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S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch e SFJ Le Grice sono supportate dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Presentiamo qui un protocollo dettagliato per la forma ad alta velocità, una tecnica che permette la determinazione della struttura secondaria a risoluzione singolo nucleotide di RNA di qualsiasi dimensione. Inoltre, abbinando i dati di forme sperimentali con secondari algoritmi di predizione di struttura facilita la generazione di modelli di RNA in 2D con un maggior grado di precisione di quanto sia possibile con uno dei due metodi da solo. La combinazione di primer fluorescenza marcata e automatizzato CE offre signifi...

Per capire le funzioni di RNA catalitici e non codificanti coinvolti nella regolazione dello splicing, la traduzione, la replicazione del virus e il cancro, una conoscenza dettagliata della struttura dell&#39;RNA è richiesto 1,2. Purtroppo, la previsione accurata di RNA folding rappresenta una sfida formidabile. Agenti di sondaggio classici soffrono molti svantaggi come la tossicità, incompleta copertura dei nucleotidi e / o velocità limitata a 100-150 nucleotidi per esperimento. Senza aiuto secondarie algoritmi di predizione di struttura sono allo stesso modo svantaggioso, a causa di imprecisioni derivanti dalla loro incapacità di distinguere efficacemente tra strutture energeticamente simili. Grandi RNA in particolare sono spesso refrattari ai metodi di determinazione della struttura 3D come cristallografia a raggi X e risonanza magnetica nucleare (NMR), grazie alla loro flessibilità conformazionale e grandi quantità di campioni altamente puri richiesti per queste tecniche. High-capacità SHAPE risolve molti di questi problemi fornendo un efficace, semplice approccio per sondare le strutture di grandi RNA a singolo nucleotide risoluzione. Inoltre, i reagenti utilizzati per la forma sono sicuro, facile da maneggiare e, a differenza della maggior parte dei reagenti chimici probing, reagiscono con tutti e quattro i ribonucleotidi. Questi reagenti possono anche penetrare le membrane cellulari, rendendo possibile sondare RNA nel loro contesto in vivo (s) 3. Originariamente sviluppato nel laboratorio 4 settimane, SHAPE è stato utilizzato per analizzare una grande varietà di RNA, l&#39;esempio più notevole è determinazione della struttura secondaria completa del ~ 9 kb HIV-1 RNA genoma 5. Altri risultati di rilievo utilizzando FORMA includono delucidazione delle strutture di viroidi infettive 6, RNA umani lunghi non codificanti 7, ribosomi lievito 8 e riboswitches 9, nonché per identificare i siti di legame delle proteine ​​nel virione-associata HIV-1 RNA 3. While le varianti originali e high-throughput del protocollo SHAPE sono stati pubblicati altrove 10-12, il presente lavoro fornisce una descrizione dettagliata della determinazione della struttura secondaria dell&#39;RNA da SHAPE high-throughput utilizzando oligonucleotidi fluorescenti, la Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analyzer, e (v5.3) software SHAPEfinder e RNAStructure. Sono inclusi anche inediti dettagli tecnici e consigli sulla risoluzione dei problemi. Variazioni di forma L&#39;essenza di SHAPE e sue variazioni è l&#39;esposizione di RNA in soluzione acquosa a anidridi elettrofili che acilato selettivamente 2&#39;-idrossile (2&#39;-OH) gruppi ribosio, producendo addotti ingombranti nei siti di modificazione. Questa reazione chimica serve come mezzo di interrogare dinamica strutturale RNA locali, come nucleotidi a singolo filamento sono più inclini ad adottare conformazioni favoriscano attacco elettrofilo da questi reagenti, mentre la base accoppiato o architettonico fabbrnucleotidi ained sono meno o non reattivo 10. Siti di formazione di addotti vengono rilevati mediante trascrizione inversa avviando da fluorescente o radioattivo primer ibridati ad un sito specifico sulla RNA modificato (il &quot;(+)&quot; reazione di innesco di estensione). Quando trascrittasi inversa (RT) non riesce ad attraversare i ribonucleotidi acil derivati, un pool di cDNA prodotti viene prodotto il cui lunghezze coincidono con i siti di modificazione. Un controllo, &quot;(-)&quot; primer estensione reazione utilizzando RNA che non è stato esposto a reagente viene eseguita anche in modo che la chiusura prematura della sintesi del DNA (vale a dire &quot;stop&quot;) a causa di RNA struttura, non specifico filamento di RNA rotture, ecc, maggio. essere distinta da facendo una pausa prodotto mediante modificazione chimica. Infine, due reazioni di sequenziamento dideossi-avvio dagli stessi primer sono utilizzati come marcatori per correlare nucleotidi reattivi con la sequenza primaria di RNA dopo elettroforesi. In applicazione originale di SHAPE, lo stesso 32 P-end-marcato primer viene utilizzato per il (+), (-), e due reazioni di sequenziamento. Prodotti di queste reazioni sono caricati in pozzetti adiacenti in un gel di poliacrilammide lastra 5-8%, e frazionato mediante elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide (PAGE; Figura 1). Analisi quantitativa delle immagini gel prodotte da SHAPE convenzionale può essere eseguita utilizzando SAFA, un software semi-automatico di analisi footprinting 13. In contrasto, la forma ad alta velocità impiega primer fluorescente ed elettroforesi capillare automatizzata. Specificamente, per ogni regione di RNA in esame, una serie di quattro primer DNA avente una sequenza comune ma diverso 5 &#39;etichette fluorescenti devono essere sintetizzati o acquistati. Questi oligonucleotidi diversamente etichettati servono a primi due reazioni forma e le due reazioni di sequenziamento, i cui prodotti sono raggruppati e frazionato / rilevati mediante elettroforesi capillare automatizzato (CE). Whereas il profilo di reattività 100-150 nt di RNA può essere ottenuto da una serie di quattro reazioni usando l&#39;approccio originale, SHAPE alta produttività consente risoluzione del 300-600 nt da un singolo campione riunito 3. Fino a 8 serie di reazioni può essere frazionata simultaneamente, mentre ben 96 campioni possono preparato per frazionamento nel corso di 12 consecutivi piste CE (Figura 2). Inoltre, il software SHAPEfinder, sviluppato per elaborare e analizzare i dati che emergono dal QVC e altri analizzatori genetici, è più automatizzato e richiede meno interventi da parte dell&#39;utente di SAFA 13 o altri pacchetti di gel di analisi. Metodologie high-throughput più avanzati hanno recentemente emerso come PARS (analisi in parallelo di struttura RNA) 14 e Frag-Seq (frammento-sequencing) 15, che utilizzano enzimi struttura-specifiche, piuttosto che reattivi alchilazione in combinazione con tecniche di sequenziamento di nuova generazione per ottenere information su la struttura dell&#39;RNA. Nonostante l&#39;attrattiva di queste tecniche, le molte limitazioni inerenti alla nucleasi tastatura rimangono ancora 16. Questi problemi possono essere aggirate nel sequenziamento SHAPE (SHAPE-Seq) protocollo 17, dove sequenziamento di nuova generazione è preceduta dalla modificazione chimica e trascrizione inversa di RNA in una maniera simile a quella effettuata per SHAPE convenzionale. Mentre questi metodi possono rappresentare il futuro della determinazione della struttura dell&#39;RNA, è importante ricordare che sequenziamento di nuova generazione è molto costoso, e rimane non disponibile per molti laboratori. FORMA Data Analysis Dati prodotti nell&#39;analizzatore genetico è presentato nella forma di un elettroferogramma, in cui l&#39;intensità di fluorescenza del campione (s) che fluisce attraverso il rivelatore capillare è tracciata contro un indice di tempo di migrazione. Questa trama prende la forma di tracce sovrapposte corrispondenti ai quattro canali di fluorescenzas utilizzato per rilevare i diversi fluorofori, e dove ogni traccia è composta da picchi corrispondenti ai singoli prodotti di cDNA o sequenziamento. Dati elettroferogramma vengono esportati dalla analizzatore genetico come file di testo delimitato da tabulazioni e importati in trasformazione ShapeFinder e software di analisi 18. ShapeFinder è inizialmente utilizzato per eseguire una serie di trasformazioni matematiche sui dati per garantire che i tempi di migrazione e di volumi di picco rispecchiano fedelmente le identità e le quantità dei prodotti di reazione, rispettivamente. Picchi sono poi allineati e integrati, ed i risultati tabulati insieme alla sequenza di RNA primario. Un &quot;profilo reattività&quot; per il segmento pertinente del RNA è ottenuto sottraendo i valori di controllo della (+) valori associati a ogni RNA nucleotide, e normalizzare i dati come descritto di seguito. Questo profilo viene importato in RNAstructure (v5.3) 19,20 software che converte la reattività val normalizzatoUES in vincoli pseudo-energia che sono incorporati nella algoritmo pieghevole struttura secondaria dell&#39;RNA. Combinando chemical probing e piegatura algoritmi in questo modo migliora significativamente l&#39;accuratezza di previsione strutturale rispetto a uno metodo da solo 12,21. L&#39;uscita di RNAstructure (v5.3) comprende le immagini di più bassa energia RNA strutture secondarie con codice colore Con il profilo SHAPE reattività (s), così come le stesse strutture in testuale notazione dot-staffa. Questi ultimi possono essere successivamente esportati in software dedicato alla visualizzazione grafica di RNA struttura secondaria come Varna 22 e PseudoViewer 23. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.8in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso della determinazione della struttura dell&#39;RNA tramite SHAPE 4,10. (A) RNA may essere ottenuto da campioni biologici o di trascrizione in vitro. (B) A seconda della sorgente, l&#39;RNA è piegato o altrimenti elaborati e modificati con il reattivo di SHAPE. (C) trascrizione inversa utilizzando fluorescente o radioattiva primer marcati. (d) i prodotti di cDNA sono frazionato sia tramite elettroforesi su gel a base capillare o lastra. (E) Analisi Fragment. (F) previsione della struttura dell&#39;RNA. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50243/50243fig2.jpg" /> Figura 2. Il carattere high-throughput di SHAPE CE-based permette una rapida analisi di molteplici RNA, e / o più segmenti dello stesso RNA. (A) </strong&gt; Rappresenta come un RNA può essere diviso in sezioni 300-600 nt (codice colore in verde, blu e rosso) (B) Sezioni di RNA vengono sondati in modo indipendente utilizzando diversi set di primer fluorescenti (frecce nere) (C) imposta di Le reazioni sono raggruppati e caricati nei pozzetti A1, B1, C1, ecc, rispettivamente, fornisce una copertura completa per il ~ 3 kb RNA1. Prodotti di reazione di RNA 2, 3, 4, ecc possono essere preparati in modo simile per frazionamento in corse elettroforetiche consecutivi. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50243/50243fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura.</a>

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>N-methylisatoic anidride (NMIA)</td><td>Life technologies</td><td>M25</td><td>Dissolve in DMSO anidro</td></tr><tr><td>anidride 1-metil-t-nitroisatoica (1M7)</td><td>vedi ref. 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Reverse Transcriptase</td><td>Life technologies</td><td>18080044</td><td>10.000 unità</td></tr><tr><td>Kit di sequenziamento del ciclo della termosequenziasi</td><td>Affymetrix</td><td>78500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiali forniti dall'utente</td></tr><tr><td>RNA di interesse</td><td></td><td></td><td>6 pmol per reazione (il limite di rilevabilità sarà determinato dallo strumento)</td></tr><tr><td>Set di quattro primer marcati da 5' (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 e WellRed D1/Licor IR800)</td><td></td><td></td><td>I primer sono complementari all'RNA e vengono utilizzati nelle reazioni di trascrizione inversa e sequenziamento. I fluorofori elencati sono ottimali per il Beckman Coulter 8000 CEQ. I primer possono essere acquistati o sintetizzati in casa.</td></tr><tr><td>Il DNA stampo</td><td></td><td></td><td>viene utilizzato per le reazioni di sequenziamento e deve contenere la sequenza dell'RNA oggetto di studio, compresa l'eventuale estensione 3'terminale, se presente. Ove applicabile, è spesso conveniente utilizzare il modello di trascrizione dell'RNA.</td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>10x Tampone</td><td></td><td></td> di rinaturazione dell'RNA <td>100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5X Tampone</td><td></td><td></td> di ripiegamento dell'RNA <td>200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Questo tampone potrebbe essere modificato a seconda del caso (es. pH, EDTA, Mg, inibitore della RNasi)</td></tr><tr><td>2,5X RT miscela</td><td></td><td></td><td>4 &mu; l 5X buffer, 1 &mu; l 100 mM DTT, 1,5 &mu; l. acqua,1 &mu; l 10 mM dNTP, 0,5 &mu; l Apice III. Si noti che il buffer 5X e 100 mM DTT vengono forniti con l'acquisto di SuperScript III (Invitrogen).</td></tr><tr><td>Soluzione di caricamento dei campioni GenomeLab (Beckman Coulter)</td><td></td><td></td><td>Attenzione: Evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Elettroforesi capillare</td><td>Beckman</td><td>CEQ8000</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>varia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rna secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Comprendere la funzione di RNA coinvolti in processi biologici richiede una conoscenza approfondita della struttura dell&#39;RNA. A questo fine, la metodologia denominata &quot;2 selettivo high-throughput &#39;acilazione idrossile analizzato da primer extension&quot;, o la forma, permette la previsione di RNA struttura secondaria con risoluzione singolo nucleotide. Questo approccio utilizza agenti chimici che probing acilato preferenzialmente singole regioni o flessibile filamento di RNA in soluzione acquosa. Siti di modificazione chimica vengono rilevati mediante trascrizione inversa del RNA modificati, ed i prodotti di questa reazione sono frazionati mediante elettroforesi capillare automatizzato (CE). Dal momento che la transcriptasi inversa si ferma a quei nucleotidi di RNA modificati dai reagenti SHAPE, la libreria di cDNA risultante indirettamente associa quei ribonucleotidi che sono a singolo filamento nel contesto delle RNA piegati. Utilizzando il software ShapeFinder, i elettroferogrammi prodotti dalla automatizzato CE vengono elaborati e convertiti in nutavoli reattività cleotide che sono a loro volta convertiti in vincoli pseudo-energetiche utilizzate nel RNAStructure (V5.3) algoritmo di predizione. Le strutture di RNA bidimensionali ottenute combinando SHAPE sondando con in silico RNA predizione della struttura secondaria sono stati trovati per essere molto più preciso di strutture ottenute utilizzando il metodo da solo.

RNA contenente il virus HIV-1 rev risposta elemento (RRE) ea 3 &#39;terminale cassetta struttura 4 è stato preparato da un plasmide linearizzato mediante trascrizione in vitro, dopo di che è stato piegato da riscaldamento, raffreddamento e incubazione a 37 ° C in presenza di MgCl 2. RNA è stato esposto a NMIA e poi invertire trascritto da un primer di DNA 5&#39;-end-marcato ibridato a cassetta struttura terminale 3 &#39;. La libreria di cDNA risultante SHAPE, insieme a reazioni di controll...

High-throughput selettivo 2 &#39;acilazione idrossile analizzato da primer extension (SHAPE) utilizza un romanzo chemical probing tecnologia, la trascrizione inversa, elettroforesi capillare e software di predizione della struttura secondaria per determinare le strutture di RNA da diverse centinaia a diverse migliaia di nucleotidi a singolo nucleotide risoluzione.

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

L'obiettivo generale di questa procedura è la previsione della struttura secondaria dell'RNA con risoluzione a livello di singolo nucleotide. Questo risultato si ottiene innanzitutto modificando chimicamente l'RNA ripiegato mediante un reagente elettrofilo che identifica le regioni a singolo filamento o flessibili dell'RNA. Il secondo passaggio consiste nell'utilizzare la trascrizione inversa per rilevare i siti dell'RNA che sono stati modificati chimicamente.Successivamente, i prodotti di CD NA della trascrizione inversa vengono frazionati mediante elettroforesi capillare. L'ultimo passaggio consiste nell'elaborazione e nella normalizzazione dei dati. Infine, un software per la struttura dell'RNA viene utilizzato per prevedere la struttura secondaria dell'RNA sfruttando i vincoli derivati dall'energia libera pseudo ottenuti dall'analisi di forma.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia molecolare, come il modo in cui la struttura dell'RNA regola le funzioni degli RNA catalitici e non codificanti, e come i genomi virali a RNA controllano la multifunzionalità dei loro genomi. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapi

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Linee guida per computer basato su caratterizzazione strutturale e funzionale di proteine ​​utilizzando l'I-Tasser pipeline è descritto. Partendo dalla sequenza della proteina query, i modelli 3D sono generate utilizzando più allineamenti threading e iterativo simulazioni di assemblaggio strutturale. Inferenze funzionali sono successivamente redatto in base alle corrispondenze di proteine ​​con struttura nota e funzioni.

Un protocollo per la Computer-Based Protein Structure Prediction e Funzione

Il database ITS2 è un banco di lavoro per la sequenza di inferenza filogenetica simultaneamente e considerando la struttura secondaria del spaziatore interno trascritto 2. Ciò include la raccolta di dati con annotazioni accurate, predizione della struttura, di sequenze multiple-struttura di allineamento e di calcolo albero veloce. In poche parole, questo banco di lavoro semplifica analisi filogenetiche primi pochi click.

Il ITS2 Database

Il pacchetto software 3DNA è un popolare e versatile strumento di bioinformatica con capacità di analizzare, costruire, e visualizzare le strutture di acidi nucleici tridimensionali. Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per un sottoinsieme di nuove e popolari funzionalità disponibili in 3DNA, applicabili ad entrambe le singole strutture e insiemi di strutture correlate.

Analisi e costruzione di strutture acidi nucleici con 3DNA

Abbiamo sviluppato metodi computazionali di progettazione di proteine de novo in grado di affrontare diverse importanti aree della progettazione di proteine. Per diffondere questi metodi presentiamo Protein WISDOM, uno strumento online per la progettazione di proteine (http://www.proteinwisdom.org). Partendo da un modello strutturale, è possibile eseguire la progettazione di proteine monomeriche per una maggiore stabilità e di complessi per una maggiore affinità di legame.

Proteine ​​saggezza: un banco di lavoro per<em&gt; In silico</em&gt;<em&gt; De novo</em&gt; Progettazione di biomolecole

Questo documento descrive la formazione di strutture a base di peptidi altamente ordinati dal processo spontaneo di auto-assemblaggio. Il metodo utilizza peptidi disponibili sul mercato e le apparecchiature di laboratorio comune. Questa tecnica può essere applicata a una grande varietà di peptidi e può portare alla scoperta di nuovi assemblaggi a base di peptidi.

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

Il tassellamento del DNA è un approccio efficace per realizzare nanostrutture programmabili. Descriviamo i protocolli per costruire forme bidimensionali complesse mediante l'autoassemblaggio di tessere di DNA a filamento singolo.

Auto-assemblaggio di forme complesse bidimensionali da Campagna DNA a singolo filamento

Descriviamo un framework che incorpora un'analisi biochimica e computazionale diretta per guidare la caratterizzazione e la cristallizzazione di grandi domini coiled-coil. Questo framework può essere adattato per le proteine globulari o esteso per incorporare una varietà di tecniche ad alto rendimento.

La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

Strutture di assiemi di proteina supramolecolari a risoluzione atomica sono di grande rilevanza a causa della loro un ruolo cruciale in una varietà di fenomeni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire studi strutturali ad alta risoluzione su assiemi di proteina insolubile e non cristallini macromolecolari di magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR MAS).

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Protocolli dettagliati per entrambi in vitro e nelle celle selettivo 2'-idrossile acilazione analizzati dagli esperimenti di estensione (forma) di primer per determinare la struttura secondaria delle sequenze di pre-mRNA di interesse in presenza di una piccola molecola di RNA-targeting sono presentato in questo articolo.

Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

Il protocollo fornisce istruzioni per modificare l'RNA con dimetilsolfato per esperimenti di profilazione mutazionale. Include il sondaggio in vitro e in vivo con due metodi alternativi di preparazione della libreria.

Sondare la struttura dell'RNA con profilo mutazionale del dimetilsolfato con sequenziamento in vitro e nelle cellule

La progettazione delle proteine comporta la costruzione di sequenze di amminoacidi e l'incorporazione di motivi specifici per creare varianti funzionali. Questo approccio è fondamentale per lo sviluppo di peptidi antimicrobici (AMP) per combattere i patogeni resistenti agli antibiotici. Questo articolo presenta una procedura per la costruzione di proteine utilizzando vari strumenti bioinformatici.

Applicazione di I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK server e HEX loria per la progettazione De Novo e In Silico di proteine

Scopri la tecnica SHAPE per prevedere la struttura secondaria dell'RNA con risoluzione a singolo nucleotide. Questo metodo combina modifiche chimiche, trascrizione inversa ed elettroforesi capillare per analizzare molecole di RNA complesse.

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