Mouse a breve e lungo termine di attività locomotoria analizzati da Tracking Software Video

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare differenze nell'attività locomotoria a breve e/o a lungo termine tra diversi gruppi di topi trattati sperimentalmente. Questo viene ottenuto mediante registrazione video dell'attività nel box domestico dei topi in tempo reale. Come secondo passaggio, l'attività locomotoria dell'animale viene analizzata in tempo reale o a partire da una registrazione, utilizzando un software di tracciamento video.

Successivamente, i parametri locomotori misurati vengono importati in un software secondario per l'analisi statistica. Questa procedura può quindi chiarire gli effetti di trattamenti o condizioni sull'attività locomotoria a breve e a lungo termine, in base a parametri valutati come distanza percorsa, velocità del movimento e durata del movimento. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il conteggio del passaggio su linee o l'implantazione di emitter, è che consente un'esame più approfondito dell'attività locomotoria del topo senza la necessità di una procedura chirurgica invasiva e potenzialmente confondente.

Generalmente, i principianti incontrano difficoltà perché l'allestimento delle gabbie e dell'attrezzatura in modo da ottenere una qualità ottimale delle immagini per il successivo tracciamento video può essere noioso e richiede tempo per essere appreso. L'attività locomotoria a breve termine viene testata nelle gabbie di residenza di topi isolati, con lettiera ad alto contrasto rispetto al colore del codice dell'animale. Prima dell'esperimento, gli animali devono essere acclimatati alla lettiera per almeno 24 ore.

Per preparare la stanza di prova, iniziare montando una videocamera con capacità di visione notturna e almeno 120 gigabyte di memoria sopra l'area di registrazione. La stanza non deve avere rumori ambientali superiori a 70 decibel. Se rumori di fondo intermittenti sono inevitabili, utilizzare un generatore di rumore bianco per attenuare tali rumori.

È inoltre importante che le condizioni ambientali della stanza di prova siano simili a quelle dell’ambiente di allevamento normale dell’animale. Prima di preparare nuovi soggetti, pulire l’area di registrazione, quindi coprire la superficie con carta da macellaio o da banco di laboratorio di colore simile alla lettiera della gabbia. Successivamente, posizionare divisori opachi per gabbia realizzati in plastica da mezzo pollice. Sulla superficie di prova, i divisori devono avere un colore simile a quello della lettiera ed essere puliti.

Ora portare i topi nell'area di prova e posizionare le gabbie tra le partizioni. Per facilitare l'analisi, posizionare sempre le gabbie nello stesso modo. Per il test, coprire le gabbie con un plexiglas trasparente spesso un quarto di pollice.

Il plexiglass richiede almeno 11 fori da un quarto di pollice per garantire un'adeguata ventilazione. Successivamente, installare le lampade riscaldanti con bulbi rossi per illuminare le gabbie. Ora centrare l'inquadratura della telecamera sulle gabbie di prova, senza superare le capacità del sistema di tracciamento video.

Questo sistema è limitato al tracciamento di otto topi in tempo reale. Ora, osservando il display della videocamera, regolare l'angolo e la posizione delle luci per eliminare bagliori o riflessi provenienti dai coperchi in plexiglass delle gabbie. Ottenere una visione nitida dei topi, priva di artefatti visivi, è il passaggio più critico per ottenere buoni risultati.

Includere sempre sia soggetti sperimentali che di controllo in ciascun gruppo per garantire che gli effetti potenziali delle differenze temporali nel LMA siano ridotti al minimo. Poco prima del test, rimuovere qualsiasi materiale per il nido e di arricchimento dalle gabbie poiché potrebbero ostacolare la visione del topo. Nel video, avviare la registrazione con una lavagna che identifichi le informazioni sperimentali rilevanti.

Per garantire l'identificazione corretta del video, utilizzare il timer sul display della videocamera per registrare la durata del test e rimanere al di fuori del campo visivo dell'animale durante la registrazione. Al termine del test, restituire tutti i materiali in ciascuna gabbia.

Se gli animali devono essere sottoposti nuovamente a test, ripristinare loro l'accesso a cibo e acqua tra un test e l'altro. Conservare le registrazioni video della sessione di prova su un supporto di archiviazione compatibile con il sistema di tracciamento video, come un disco rigido. Nel sistema di tracciamento video, analizzare i video in tempo reale. Inizialmente, selezionare l'intero fondo della gabbia come area di interesse o ROI per il tracciamento.

Per analisi avanzate come la valutazione delle tasse di Figma, creare più ROI intra gabbia per studi ad alta produttività. Analizzare tutte le gabbie all'interno del video simultaneamente con ROI individuali per il fondo di ciascuna gabbia. Impostare il VTS per calcolare la distanza totale percorsa, la velocità dei movimenti e la durata dei movimenti; al termine dei calcoli, esportare i dati in un file di foglio elettronico per archiviazione e ulteriori analisi.

Il test a lungo termine viene eseguito esattamente come il test a breve termine. Tuttavia, richiede una gabbia modificata con un nuovo punto di accesso per cibo e acqua. Per prima cosa, praticare un foro del diametro di 5,5 centimetri nella parete corta di una gabbia standard.

Successivamente, praticare aperture di mezzo pollice nella rete in acciaio zincato da un quarto di pollice e arrotondare i bordi taglienti della rete utilizzando la stessa rete, costruendo un imbuto esterno per i pellet alimentari che possa collegarsi alla rete sopra l'apertura. Successivamente, aggiungere fori per i rivetti. Quindi coprire il foro nella gabbia con la rete e l'imbuto fissato utilizzando rivetti in alluminio e rondelle in acciaio inossidabile.

Per fornire idratazione, costruire una bottiglia dell'acqua utilizzando un conico standard da 50 millilitri e un tappo di gomma con un foro, ulteriormente allargato, per permettere l'inserimento di un tubo bevitore antigoccia. Fissare questa bottiglia dell'acqua alla gabbia.

Utilizzando nastro in velcro, il tubo erogatore deve essere inserito attraverso l'apertura coperta da rete. Ora, mentre la gabbia è coperta dal coperchio in plexiglass, i topi mantengono l'accesso a cibo e acqua seguendo le stesse procedure descritte per il saggio di locomozione a breve termine. Il saggio a lungo termine di solito dura 12 ore o per tutta la durata della fase corrente del ciclo luce-buio.

Il test dell'attività locomotoria a lungo termine viene generalmente analizzato in tempo reale senza effettuare una registrazione video. Tuttavia, è possibile effettuare una registrazione utilizzando una telecamera secondaria o un registratore DVD collegato alla telecamera principale. I topi possono essere sottoposti a test per tutto il tempo consentito dalle capacità del sistema di tracciamento video e, come nei test a breve termine, dall'acquario viene rimosso soltanto il materiale arricchente illuminato dal nido, non la lettiera di pannocchia o segatura.

Nel VTS, configurare il sistema di video tracciamento per l'analisi in tempo reale. Impostare l'area di interesse (ROI) di tracciamento in modo da comprendere l'intero pavimento per ciascuna gabbia registrata. Come nel saggio a breve termine, impostare il sistema per calcolare la distanza totale percorsa, la velocità di movimento e la durata del movimento.

Successivamente all'analisi, esportare i dati in un foglio di calcolo per l'archiviazione e l'analisi mediante saggi ripetuti di locomozione a breve termine. È stato osservato che, dopo l'iniezione di lipopolisaccaride, i topi allevati in gabbie ventilate individualmente o IVC si riprendono dalla perdita di attività locomotoria a breve termine indotta dall'iniezione più rapidamente rispetto ai topi allevati in gabbie con ambiente atmosferico normale o EC. Sebbene la perdita iniziale di attività locomotoria sia simile tra i gruppi trattati con LPS, il recupero dell'attività locomotoria basale è più rapido nei topi allevati in IVC, così come la velocità e la durata dei movimenti.

In questo esame, il rilevamento di un movimento di due centimetri al secondo ha avviato il tracciamento, mentre un movimento di 1,75 centimetri al secondo ha interrotto il tracciamento, utilizzando le variabili di rilevamento. È stato effettuato un breve test della locomozione su due cicli consecutivi di attività di 12 ore. Nei topi normali, non si osserva alcuna differenza significativa nella distanza percorsa, nella velocità dei movimenti né nella durata dei movimenti.

Se la tendenza all'assenza di una differenza misurabile dovesse confermarsi ripetendo l'esperimento con un campione di dimensioni maggiori, i dati suggerirebbero che il saggio potrebbe essere utilizzato per sostituire i trasmettitori impiantati impiegati nei saggi locomotori a lungo termine. Quando si esegue questa procedura, è fondamentale prestare particolare attenzione alle condizioni di allevamento degli animali prima dell'esperimento. Tutti gli animali sperimentali e di controllo devono essere mantenuti in condizioni ambientali simili, in particolare per quanto riguarda il ciclo luce/buio, la temperatura ambiente e l'umidità relativa.

Inoltre, durante questa procedura, va ridotta al minimo l'esposizione a stimoli di rumore e odore. Altri metodi, come il test del nuoto forzato, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se il trattamento in un determinato esperimento provoca comportamenti simili alla depressione senza influenzare l'attività locomotoria generale.