Name: Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Scopri l'elettroporazione ex utero e la preparazione di emisferi cerebrali interi da embrioni di topo per studiare lo sviluppo corticale precoce. Questo metodo facilita analisi istologiche e studi farmacologici.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NINDS (NS066071) e il NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Gli autori ringraziano il Dr. Robert Quinn e il personale del Dipartimento delle Risorse Animali di laboratorio per la cura degli animali. Ringraziamo Judson Belmont per il supporto tecnico, Nicole Belletier di assistenza, come Fellow Undergraduate Research Estate (SURF). Ringraziamo anche il dottor David Cameron per i commenti e le modifiche in una versione precedente del manoscritto.

1. Elettroporazioni utero Ex con Expression Proteina Fluorescente Verde Plasmid <ol><li> Soluzioni di iniezione di DNA plasmidici sono preparati con CAG-eGFP DNA 27 diluito alla concentrazione finale di lavoro di 0,33 mg / ml in DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sono utilizzati per purificare il plasmide da batteri trasformati. Veloce colorante verde a ~ 0,02% (w / v finale) viene aggiunto alla soluzione di DNA come tracciante iniezione. </li><li> Per preparare l&#39;area chirurgica, spruzzare banco e la fase microscopio da dissezione con una soluzione di etanolo al 70% e asciugare. Spruzzare forbici chirurgiche e pinze con il 70% di etanolo prima della dissezione e asciugare. </li><li> Timed incinte svizzeri / Webster dighe sono sacrificati su E13 da trasferire in una camera riempita con CO 2 da una bombola sotto pressione e la diga è monitorato fino a quando tutto il movimento si è fermato per almeno 1 min. Dopo il sacrificio da CO 2 inalazione gli embrioni vengono rimossi dall&#39;utero e collocati inuna capsula di Petri contenente 10 centimetri ghiacciata Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS). </li><li> Attenzione sezionare ogni embrione dalle membrane che circondano extraembrionali e tenere in ghiaccio-freddo HBSS. </li><li> Trasferire ogni embrione singolarmente per un piatto secondo cm 10 Petri contenente HBSS freddo. Utilizzare una siringa Hamilton da iniettare 2-3 microlitri della miscela DNA veloce verde nel ventricolo dell&#39;emisfero cerebrale sinistro, avendo cura di iniettare in una zona corticale spazialmente separata dalla zona corticale per analisi future. </li><li> Per electroporate, tenere l&#39;embrione delicatamente con una pinza e leggermente posizionare la paletta positiva dell&#39;elettrodo pinzetta sulla linea mediana dorsale della testa e leggermente posizionare la pala negativo sotto il mento embrione. Elettroporazioni sono conseguiti con un elettroporatore BTX830 programmato per fornire cinque impulsi 30 V della durata di 50 msec, separati da 950 msec. Queste impostazioni sono per il modello BTX830. Altri sistemi possono essere utilizzati secondo INSTRUCTIO produttorens. </li></ol> 2. Tutta la Emisfero Preparazione Espianto <ol><li> Dopo elettroporazione gli embrioni sono posti di nuovo in gelide HBSS. Il cervello viene rimosso con due N ° 5 pinze gioielliere per rimuovere la pelle e il cranio cartilagineo dalla testa dell&#39;embrione. Una pinza viene quindi fatto scivolare sotto il cervello per rimuovere il cervello intatto dal cranio. L&#39;emisfero elettroporata (sinistra) viene sezionato dal cervello e allegata mesencefalo tessuto viene rimosso. In tutta la procedura di dissezione cura è presa per non danneggiare le meningi sovrastanti l&#39;emisfero sinistro corticale. </li><li> Una volta sezionato ogni embrione viene trasferito in HBSS utilizzando una pipetta con un taglio 1 punta ml pipetta. L&#39;emisfero viene espulsa cautamente su un inserto rivestito cultura collagene. Fino a sei espianti emisfero sono disposti lato mediale verso il basso ogni inserto mm 24. Una volta disposti, HBSS eccesso viene rimosso dalla inserto e l&#39;inserto viene quindi posto in uno ben 35 millimetri di un piatto 6 pozzetti. Il pozzo contiene exactly 2,7 ​​ml di media: DMEM-F12 supporti contenenti Glutamax e integrato con il 2% B-27, 1% e l&#39;1% G5 Penicillina-Strep. Alcune gocce di supporti dal pozzo può essere pipettati sopra l&#39;espianto, ma non aggiungere supporti in eccesso rispetto all&#39;originale 2,7 ml per pozzetto. </li><li> Una volta che gli espianti sono stati collocati su filtri di collagene il piatto ben 6 contenente gli espianti è collocato in una Rothenberg Billups (BR) camera (che contiene anche un piatto umidificazione di acqua). A 95% / 5% di ossigeno / CO 2 miscela di gas viene infusa nella camera per almeno 1 minuto prima di sigillare la camera di valvola e scollegamento del 95% / 5% di ossigeno / CO 2 tubo di alimentazione del gas. La camera di BR viene quindi posto in un 37 ° C di coltura tissutale incubatore per il resto del periodo di coltura, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fissazione del tessuto Espianto di Istologia <ol><li> In una cappa aspirante preparare la soluzione di fissazione Pagano dal primo solubilizzante 8 g di paraformaldeide in 100 ml di preriscaldato (~ 80 &amp; deg; C) DDH 2 O. Aggiungere 1-3 gocce di NaOH concentrati per promuovere la solubilizzazione e mescolare delicatamente. Una volta solubilizzato miscelare la soluzione di paraformaldeide 8% 1:1 con una soluzione 500 mM di saccarosio, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl per una concentrazione finale di 4% paraformaldeide in saccarosio 250 mM Hepes 50 mM , 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Per fissare gli espianti riscaldare la soluzione correzione Pagano a 37 ° C. Rimuovere rapidamente la maggior parte dei mezzi di comunicazione DMEM/F12 da ogni cultura bene e aggiungere 5 ml di Fix Pagano in ciascun pozzetto di espianti. Assicurarsi di coprire ogni espianto completamente in correzione. Fix per 1 ora a temperatura ambiente. Non rimuovere espianti dal filtro prima di 1 ora di fissazione. </li><li> Dopo fissazione rimuovere la soluzione di fix Pagano e sostituirlo con soluzione Pagano senza correzione (250 mM saccarosio, 50 mM Hepes 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Aggiungere poche gocce di azide di sodio al 10% e conservare a 4 ° C fino incorporamento. </li></ol> 4. Embedding e Sectioning per Istologia <ol><li> Preparare una soluzione al 10% di gelatina pelle di vitello solubilizzando 10 g di gelatina pelle di vitello in 100 ml di acqua calda (55-60 ° C). Posizionare soluzione di gelatina su una piastra calda regolata a 60 ° C e agitare periodicamente fino solubilizzato. </li><li> Versare circa 10 ml di soluzione al 10% di gelatina sul fondo di una capsula Petri da 10 cm e lasciare 30 min a solidificare. Questo formerà un &quot;pad&quot; per l&#39;incorporamento degli espianti. Queste pastiglie possono essere giorni preparati in anticipo e conservati a 4 ° C. Usare un righello per disegnare una griglia sul fondo della scatola di Petri e trasferire espianti individuali in ogni casella della griglia. Rimuovere residui di soluzione di Pagano e l&#39;utilizzo di una pipetta, coprire ogni espianto con caldo soluzione al 10% di gelatina e lasciare solidificare. Riprendere lenta aggiunta di soluzione di gelatina finché ogni espianto è completamente circondato da gelatina, facendo attenzione a non fondere il pad con l&#39;aggiunta di troppo caldo gelatina in una volta. Consentire la gelatina indurire per ~ 1 ora. Una volta indurito il indivigoli espianti possono essere tagliati in piccoli blocchi di gelatina. I blocchi vengono poi post-fissati in Pagano fissare per 24-48 ore prima del sezionamento con un vibratomo. </li><li> Espianti in blocchi gelatina sono posizionati bulbo olfattivo e sezionata nel piano coronale a 100 micron di spessore. Le sezioni vengono raccolti e conservati in PBS + sodio azide 0,1% a 4 ° C fino al procedimento immunoistochimica. </li><li> Rilevamento immunoistochimico viene eseguita trasferendo sezioni in una piastra a 24 pozzetti (2-3 sezioni per pozzetto). Primo blocco anticorpo non specifico legame aggiungendo 0,5 ml + B PBST (PBS + 0,5% Triton X 100 e 2% BSA) in ogni pozzetto, incubare 1 ora agitando delicatamente. L&#39;anticorpo primario viene quindi diluito in PBST + B e 0,4 ml per pozzetto viene aggiunto incubazione per tutta la notte a RT. Il primario è lavato con PBS 3X lava per almeno 10 minuti ciascuna. L&#39;anticorpo secondario e 2 ug / ml Hoechst 33342 nucleare macchia vengono quindi diluite in PBST + B ed i campioni vengono incubati per 2 ore a RTagitando delicatamente. Tre lavaggi con PBS (10 minuti ciascuna) vengono eseguite e quindi le sezioni sono montati su vetrini con un 90% di glicerolo 50 mM Tris, pH 7,4, mezzi di montaggio. </li></ol>

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. , (2004).</li>
<li>Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neuronal+positioning+and+dendritogenesis+in+the+neocortex+after+cell-autonomous+Dab1+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression.</a> J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+neuron+origin+and+neocortical+laminar+fate%3A+relation+to+cell+cycle+of+origin+in+the+developing+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall.</a> J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+prenatal+ontogenesis+of+the+cerebral+cortex+%28neocortex%29+of+the+cat+%28Felis+domestica%29.+A+Golgi+study.+I.+The+primordial+neocortical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Anat.+Entwicklungsgesch%22%5BJournal%5D)">Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization.</a> Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).</li>
<li>Nichols, A. J., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+promotes+neuronal+orientation+and+dendritogenesis+during+preplate+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting.</a> Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).</li>
<li>Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+reorganization+of+preplate+neurons+and+their+associated+extracellular+matrix%3A+an+early+manifestation+of+altered+neocortical+development+in+the+reeler+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse.</a> J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).</li>
<li>Manzini, M. C., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+disorders+of+cortical+development+tell+us+about+the+cortex%3A+one+plus+one+does+not+always+make+two%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).</li>
<li>Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+alteration+of+dendritic+development+in+the+cerebral+cortex+following+prenatal+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure.</a> Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).</li>
<li>Olney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Addict.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome at the cellular level.</a> Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).</li>
<li>Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+impact+of+early+cellular+environment+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.+Med%22%5BJournal%5D)">The critical impact of early cellular environment on neuronal development.</a> Prev. Med. 27, 180-183 (1998).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+migratory+pathways+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex.</a> Science. 258, 299-302 (1992).</li>
<li>Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+adhesion+is+necessary+for+radial+migration+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex.</a> Nature. 448, 901-907 (2007).</li>
<li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+regulates+cadherin+function+via+Dab1%2FRap1+to+control+neuronal+migration+and+lamination+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li>
<li>Gotz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Cameron, R. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+membrane+proteins+that+comprise+the+plasmalemmal+junction+between+migrating+neurons+and+radial+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells.</a> J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).</li>
<li>Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Study+of+Neuronal+Morphogenesis%3A+Ex+vivo+RNAi+Electroporation+in+Embryonic+Murine+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex.</a> J. Vis. Exp. (63), e3621(2012).</li>
<li>Jossin, Y., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signals+through+phosphatidylinositol+3-kinase+and+Akt+to+control+cortical+development+and+through+mTor+to+regulate+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth.</a> Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).</li>
<li>Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SRC+family+kinases+and+non-classical+protein+kinases+C+induce+a+reeler-like+malformation+of+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development.</a> J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).</li>
<li>Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-proliferative+effects+of+lysophosphatidic+acid+enhance+cortical+growth+and+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding.</a> Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).</li>
<li>Rehen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+embryonic+culture+for+assessing+global+changes+in+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).</li>
<li>Jossin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+fragment+of+Reelin%2C+generated+by+proteolytic+processing+in+vivo%2C+is+critical+to+its+function+during+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development.</a> J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).</li>
<li>O'Dell, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortical+neurons+require+Reelin-Dab1+signaling+for+cellular+orientation%2C+Golgi+deployment%2C+and+directed+neurite+growth+into+the+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone.</a> Neural. Dev. 7, 25(2012).</li>
<li>Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+disruption+of+Golgi+apparatus+morphology%2C+primary+neurite+number+and+cellular+orientation+in+developing+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons.</a> Alcohol. , (2012).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+neocortical+neurogenesis+and+neuronal+specification%3A+a+positional+information+system+encoded+by+neurogenetic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+The+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45, 208-217 (2007).</li>
<li>Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+in+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix in early cortical development.</a> Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).</li>
<li>Milev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+expression+of+hyaluronan-binding+proteoglycans+in+developing+brain%3A+aggrecan%2C+versican%2C+neurocan%2C+and+brevican%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).</li>
<li>McKenna, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr1+and+Fezf2+regulate+alternate+corticofugal+neuronal+identities+during+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).</li>
<li>Powrozek, T. A., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+on+the+development+of+the+vibrissal+somatosensory+cortical+barrel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).</li>
<li>O'Dell, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Dell%2C+R+%22Society+for+Neuroscience%22">Society for Neuroscience</a>. , Washington D.C. (2011).</li>
<li>Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Golgi+picture+of+the+layer+VI+cortic-geniculate+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research.+Experimentelle+Hirnforschung.+Experimentation+Cerebrale%22%5BJournal%5D)">Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons.</a> Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).</li>
<li>Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+characterization+of+layer+VI+corticofugal+neurons+of+mouse+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).</li>
<li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+in+the+interconnected+circuitry+of+the+thalamus+and+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).</li>
<li>Kowalczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Neuronal+Progenitors+%28Basal+Progenitors%29+Produce+Pyramidal-Projection+Neurons+for+All+Layers+of+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. , (2009).</li>
<li>Konig, N., Roch, G., Marty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+synaptogenesis+in+rat+temporal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex.</a> Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Abbiamo migliorato e valutato un modello sperimentale - espianti tutto l&#39;emisfero - per lo studio delle prime fasi dello sviluppo corticale (E13-E15). Il modello si è dimostrato utile per l&#39;analisi della migrazione e differenziazione del lignaggio neurone eccitatorio che costituisce lo strato 6 della corteccia cerebrale 25,37. I principali vantaggi del sistema sono 1) la crescita organotipica per 2 DIV, 2) la semplicità di preparazione, e 3) accesso sperimentale alle neuroni per elettroporazione, mani...

Le forme di mammifero attraverso la corteccia cerebrale concertata proliferazione, migrazione e differenziazione dei neuroni successivamente generati. Ogni neurone è nato nella zona ventricolare (VZ) e migra dal VZ nella zona intermedia (IZ), formando la piastra corticale (CP) 1. Come passano attraverso diversi domini corticali, i neuroni migrano visualizzare molteplici modalità di migrazione 2,3 che dipendono dall&#39;ambiente extracellulare e altri elementi cellulari (es glia radiale) all&#39;interno del tessuto di sviluppo. Neuroni corticali quindi arrestare migrazione in alto della piastra di formatura corticale nei processi coincidenti arresto migrazione neuronale e 4 dendritogenesis. Sviluppo corticale è iniziata tra i giorni embrionali 11-13 (E11-13) 5 tramite la costituzione dello strato primordiale plessiforme 6 o preplate (PP), uno strato di neuroni pionieri che sovrasta il VZ. Potenzialestrato 6 neuroni corticali (cioè i neuroni corticali prima nati nel VZ) poi orientare la loro somata in un modello stereotipato e fondersi in uno strato distinto all&#39;interno del PP 7. Questi eventi dividere il preplate in un superficiale marginale (futuro strato corticale 1) e una zona profonda, quest&#39;ultimo composto da cellule a piastra (strato corticale transitoria 7). Questo processo, chiamato scissione preplate, è un evento fondamentale per la crescita futura della corteccia cerebrale 8. Molte mutazioni genetiche sono state identificate che inficiano vari aspetti dello sviluppo corticale 9. Sviluppo corticale possono essere influenzate negativamente da esposizione a sostanze tossiche ingerite come la cocaina 10 e alcool 11. Perché malformazioni corticali che si presentano durante lo sviluppo sono tra i probabili disturbi neurologici (autismo es. schizofrenia), indagini empiriche delle perturbazioni allo sviluppo corticale sono inerentily importante. E &#39;quindi di notevole importanza per stabilire approcci per studiare lo sviluppo corticale che consentono analisi rapide di effetti genetici o tossina, ma che conserva anche le possibili interazioni tra i neuroni di differenziazione, altri tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) durante questo primo periodo di sviluppo del cervello 12 . Espianti fetta 13 hanno fornito un tale sistema e sono stati ampiamente utilizzati per saggiare sviluppo corticale neuroni 14-16. Tuttavia, i saggi fetta possono soffrire l&#39;inconveniente che la migrazione neuronale e laminazione può essere anormale 17 forse a causa di danni alle cellule meningee che circondano il cervello in via di sviluppo e ancorare il radiali gliali patibolo. Come le fibre radiali gliali sono un importante substrato per la migrazione dei neuroni corticali 18 interruzione della lamina basale mediante tranciatura può interrompere localmente radiale architettura gliali e portare a alterata migrazione corticale. Inoltre la slisuperfici ced di espianti fornisce una regione di cellule morte che possono alterare la normale composizione della ECM in queste aree. Approcci più recenti hanno concentrato la loro analisi su cellule trova nel cuore della slice che sono circondati da adeguati tipi di cellule sane e ECM. Tuttavia, in alcuni casi, questi nuovi approcci possono richiedere che l&#39;originale fetta spessa colta essere crio-sezionato o paraffina sezionata dopo fissazione in modo che l&#39;interno relativamente normale della fetta è reso disponibile per l&#39;analisi 19-21. Sia il vibratomo originale sezionamento per preparare le fette diretta cultura nonché la successiva criosezionamento fette fissi per analisi richiede cura e sforzo per questi saggi lavorare. Per fornire un semplice, approccio complementare allo studio dei primi stadi dello sviluppo corticale, abbiamo modificato una fetta approcci esistenti da 13 a facilitare gli studi di primo sviluppo corticale. Abbiamo sviluppato un whole espianto emisfero modello simile a un modello esistente E14 emisfero che ha coinvolto le culture si stringono a 65 rotazioni al minuto e consentito la crescita organotipica per 16-18 ore 22,23. Nel nostro approccio, espianti emisfero interi sono posti sulla membrana semipermeabile 13 con in un&#39;atmosfera di cultura ossigeno 21,24 estendere organotipica crescita corticale per 48 ore. Questo approccio consente inoltre di elettroporazione coerente di sviluppo neuroni corticali. Gli embrioni vengono rimossi dall&#39;utero e elettroporate introdurre DNA plasmidico e telencefalo viene sezionato. Ogni emisfero è isolato e posizionato lato mediale su un collagene rivestita filtro. L&#39;espianto viene poi coltivata per un periodo di 48 ore, un periodo che comprende splitting preplate 8. Durante il periodo di coltura, L6 neuroni sviluppano da precursore differenziato neurone 25, correttamente posizionata all&#39;interno della piastra corticale. Durante questo periodo in via di svilupponeurone è circondato dalla ECM appropriata e tipi cellulari che confrontano la cella corrispondente in vivo. Questo sistema si è già dimostrato utile nel decifrare gli eventi cellulari che stanno alla base tossicità dell&#39;etanolo 26 strato 6 formazione e preplate scissione 7,25.

<table><tbody><tr><td>Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Integratore 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Senza siero Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Inserto di coltura rivestito di collagene </td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina per pelli bovine </td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211; chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Albumina di siero bovino</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 Elettroporatore</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi pinzette 10mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Hamilton (5uL)</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>Specificare 1" e stile 4</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini Taglio duro 9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero elettroporazione e espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Sviluppo corticale comporta complesse interazioni tra neuroni e non neuronali elementi, comprese le cellule precursori, i vasi sanguigni, le meningi e relativi matrice extracellulare. Perché offrire un ambiente appropriato organotipica, espianti fetta corticali sono spesso usati per studiare le interazioni che controllano la differenziazione neuronale e lo sviluppo. Anche se utile, il modello di espianto fetta possono soffrire di inconvenienti tra cui aberrante laminazione cellulare e la migrazione. Qui riportiamo un intero sistema cerebrale espianto emisfero per gli studi di primo sviluppo corticale che è più facile da preparare rispetto fettine corticali e spettacoli coerenti migrazione organotipica e laminazione. In questo sistema modello, laminazione precoce e modelli di migrazione procedere normalmente per un periodo di due giorni in vitro, compreso il periodo della scissione preplate, durante il quale prospettiva strato corticale sei forme. Abbiamo poi sviluppato un ex elettroporazione in utero (EUEP)approccio che ottiene un successo ~ 80% in termini di orientamento espressione GFP ai neuroni in via di sviluppo nella corteccia dorsale mediale. L&#39;intero modello di espianto emisfero corticale rende sviluppo precoce accessibili per l&#39;elettroporazione, l&#39;intervento farmacologico e approcci di imaging dal vivo. Questo metodo evita l&#39;intervento chirurgico sopravvivenza richiesto in utero elettroporazione (IUEP) approcci, migliorando sia la trasfezione e areale coerenza targeting. Questo metodo faciliterà studi sperimentali neuronale proliferazione, migrazione e differenziazione.

Il roditore embrionale corteccia presenta un gradiente trasversale neurogenetica per tutto il periodo di sviluppo, in modo tale che neocorteccia laterale è di circa 1 giorno in più maturo di dorsale mediale neocorteccia 28. Il grosso strato 6 neuroni sono così generata (cioè esporre loro finale fase S) sulla E12 in corticale laterale (anche chiamato Campo 40 5) e alla E13 nella corteccia dorsale mediale (anche chiamato Campo 1 5). Splitting Preplate inizia circa 1 giorno dopo La...

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che coinvolge<em&gt; Ex utero</em&gt; Elettroporazione, la dissezione e la cultura di interi emisferi cerebrali dal mouse embrionale. La preparazione facilita studi farmacologici e analisi della funzione del gene durante le prime fasi dello sviluppo corticale.

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è preparare un emisfero cerebrale intero in espianto per lo studio dello sviluppo corticale precoce. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando embrioni di topo al giorno embrionale 13. Successivamente, si inietta la miscela di DNA plasmidico nel ventricolo cerebrale ed esegue un'elettroporazione ex utero.Quindi preparare un espianato di emisfero intero dall'embrione elettroporato. L'ultimo passaggio consiste nel fissare e sezionare l'espianato di emisfero intero per analisi istologiche. Infine, la conseguenza di una mutazione o dell'esposizione a tossine sullo sviluppo dei neuroni corticali può essere valutata mediante analisi immunoistochimiche dei neuroni esprimenti GFP.Mi chiamo Eric Olson. Sono del Dipartimento di Neuroscienze e Fisiologia qui alla SUNY Upstate Medical University di Syracuse, e oggi vi mostreremo un metodo da noi sviluppato chiamato whole Hemisphere X explan. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come lo slice explan è che gli whole hemisphere X explan sono semplici da preparare e permettono due giorni di crescita organotipica.Il metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurologico, come ad esempio in che modo una particolare mutazione o una tossina interrompono lo sviluppo corticale precoce. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché la preparazione dell'espianato emisferico completo senza danneggiare le meningi può richiedere una certa pratica. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di dissezione e di trasferimento dell'espianato sono difficili da apprendere a causa della sensibilità del tessuto alle sollecitazioni meccaniche.La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Theresa Ozzi, un'aspirante ricercatrice del mio laboratorio. Per questo protocollo, utilizzare un kit disponibile in commercio per purificare i plasmidi. Preparare il DNA plasmidico a 0,33 milligrammi per millilitro in acqua e aggiungere il colorante blu metilene come tracciante per l'iniezione a circa lo 0,02% peso in volume; disinfettare sempre gli strumenti chirurgici, l'area di lavoro e il microscopio.Con etanolo al 70% quindi sacrifica un numero richiesto di femmine Swiss Webster al giorno E 13 mediante inalazione di anidride carbonica. Una volta rimossi gli embrioni, posizionarli in una piastra da 10 centimetri contenente HBSS freddo di ghiaccio, mantenuta a temperatura bassa. Dissezionare con attenzione ciascun embrione dalle membrane extraembrionali circostanti.Ora trasferire singolarmente ogni embrione in una piastra pulita con HBSS ghiacciato. Utilizzando una siringa Hamilton, iniettare da due a tre microlitri del DNA preparato nel ventricolo dell'emisfero cerebrale sinistro. Non iniettare nell'area corticale destinata all'analisi futura né nelle sue immediate vicinanze.Per elettroporare il DNA, tenere delicatamente l'embrione con una pinzetta e posizionare leggermente la paletta positiva dell'elettrodo a pinzetta sulla linea mediana dorsale della testa. Posizionare leggermente la paletta negativa sotto il mento dell'embrione. Eseguire un programma di cinque impulsi di 30 volt, ciascuno di 50 millisecondi, a intervalli di un secondo, utilizzando un elettroporatore modello BTX 830; altri sistemi possono essere impostati seguendo le istruzioni del produttore.Riposizionare ogni embrione nell'HBSS ghiacciato e procedere con la preparazione dell'emisfero intero Explan sotto un microscopio stereoscopico utilizzando due pinzette da orefice numero cinque. Rimuovere la pelle e il cranio cartilagineo dalla testa dell'embrione. Successivamente, far scivolare le pinzette al di sotto del cervello.Per rimuovere l'intero cervello dal cranio, dissezionare l'emisfero elettroporato, compreso il tessuto del mesencefalo ad esso collegato. Prestare attenzione a non danneggiare le meningi sovrastanti l'emisfero corticale dissezionato. Abbiamo riscontrato che il passaggio più difficile da padroneggiare è la dissezione e la rimozione dell'emisfero elettroporato senza danneggiare le meningi.Dopo la dissezione, trasferire ogni emisfero in cinque millilitri di HBSS freddo di ghiaccio utilizzando una punta di pipetta allargata da un millilitro. Se necessario, gli embrioni possono essere mantenuti in pozzetti separati di una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti. Successivamente, trasferire delicatamente fino a sei emisferi su una cultura in collagene da 24 millimetri.Inserire e posizionare con il lato mediale verso il basso. Riempire ora una pozzetta da 35 millimetri di una piastra a sei pozzetti con 2,7 millilitri di mezzo integrato. Rimuovere qualsiasi eccesso di HBSS dall'inserto e posizionare l'inserto nella pozzetta; con una pipetta, aggiungere alcune gocce di mezzo dalla pozzetta sulla superficie superiore di ogni x explan.Non aumentare il volume del mezzo. Abbiamo scoperto che è fondamentale posizionare alcune gocce di mezzo di coltura sopra l'espianto X, in modo che gli espianti X non siano completamente ricoperti dal mezzo. Questo può significare aggiungere fino a 400 microlitri ai 2,7 mil di mezzo presenti sopra l'espianto X.Spostare la piastra in una camera di Billups-Rothenberg che contiene un piatto umidificante con acqua ed è stata saturata con ossigeno al 95% per almeno un minuto. Sigillare ermeticamente la camera e scollegare il tubo di alimentazione del gas. Collocare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per due giorni, entro i quali sarà avvenuta la suddivisione delle prepl.In preparazione. Preparare tamponi per l'inclusione del campione. Preparare una soluzione al 10% di gelatina di pelle di vitello a 60 gradi Celsius.Una volta solubilizzato, versare circa 10 millilitri della soluzione in una piastra da 10 centimetri. Mantenere la soluzione rimanente a 60 gradi Celsius per un uso successivo. Lasciare solidificare le matrici per mezz'ora, se necessario.Possono essere conservati a quattro gradi Celsius per diversi giorni, ma devono essere riscaldati a temperatura ambiente prima dell'uso. Il giorno della fissazione in cappa, preparare la soluzione Pagano con fissativo e la soluzione Pagano senza fissativo. Riscaldare la soluzione di fissazione a 37 gradi Celsius.Estrarre con attenzione e rapidamente gli espianti dall'incubatore senza disturbare i tessuti. Rimuovere la maggior parte del mezzo e sostituirlo con cinque millilitri di fissativo riscaldato. Assicurarsi che ogni espianto sia completamente immerso.Fissare i tessuti per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il fissativo e sostituirlo con soluzione di Pagano. Senza fissativo.Aggiungere alcune gocce di azide di sodio al 10% in ogni pozzetto. I tessuti possono ora essere conservati a quattro gradi Celsius fino al loro inserimento su un supporto di inclusione. Disegnare una griglia sul fondo della piastra avvalendosi di un righello.Preparare quadrati di due o tre centimetri. Trasferire i singoli espianti sul cuscinetto di inclusione. Aspirare qualsiasi soluzione residua e ricoprire ciascun espianto con soluzione calda di gelatina al 10%.Lasciarlo solidificare. Una volta solidificato lentamente, aggiungere ulteriore soluzione di gelatina fino a quando ciascun espianto è completamente circondato. Evitare di sciogliere il pad, cosa che può verificarsi se si aggiunge troppa gelatina contemporaneamente.Ora, lasciare indurire la gelatina per circa un'ora. Una volta indurita, il singolo esplan può essere tagliato in piccoli blocchi di gelatina prima della sezionatura. È importante fissare ulteriormente i blocchi nel fissativo di Pagano per uno o due giorni.Durante il sezionamento, posizionare gli espianti con il bulbo olfattivo rivolto verso l'alto e praticare sezioni nel piano coronale con uno spessore di 100 micrometri. Raccogliere le sezioni in PBS freddo contenente azide sodica 0,1%.Conservare le sezioni a quattro gradi Celsius fino a quando non possono essere colorate utilizzando la tecnica descritta. Gli espianti di emisfero intero sono stati preparati all'E 13 prima della separazione prelativa. Nel neocorteccio dorsale.Il tessuto ospitava un transgene che segnala i neuroni immaturi della linea corticale eccitatoria. Espianti corticali provenienti dalla stessa nidiata sono stati fissati goccia a goccia in modo sequenziale nell'arco di due giorni in coltura e successivamente sottoposti ad analisi istologica. Al tempo iniziale di analisi, al giorno zero in vitro (DIV), la suddivisione prepl non si è ancora verificata nel campo uno per uno.DIV.Il CP diventa evidente e continua a crescere fino al 2° giorno in vitro. Pertanto, gli espianti emisferici interi coltivati inizialmente al giorno embrionale 13 hanno sostenuto per due giorni la maturazione della corteccia cerebrale, catturando la scissione del precursore nella neocorteccia dorsale per confermare lo sviluppo istologico normale nella neocorteccia dorsale. Gli espianti al 2° giorno in vitro sono stati sottoposti a colorazione immunoistochimica per solfato di condroitina, proteoglicani e componente della matrice extracellulare. Due bande di immunoreattività nella corteccia dorsale hanno indicato una corretta suddivisione del PPP in zona marginale (MZ) e strato prepiramidale (SP) durante il periodo di coltura in vitro.Il PP è stato suddiviso da sei neuroni corticali esprimenti CTIP due e TBR R uno. Il pattern di immunomarcatura di questi marcatori conferma l'espressione appropriata di questi fattori di trascrizione nel cp appena formato. Nel complesso, queste analisi confermano lo sviluppo corticale precoce di tipo organotipico nell'intero emisfero explantato, utilizzando l'intero protocollo descritto; sono stati iniettati nel ventricolo sinistro di embrioni E 13 integri.Espressione di GFP elettroporata e processata osservabile a partire dai precursori neuronali nella vz. Mentre cellule intensamente positive per GFP sono state osservate nell'IZ e nel cp, in modo significativo numerosi neuroni positivi per GFP, indicati dalle frecce, sono stati osservati nella parte superiore del cp in formazione, con dendriti e assoni emergenti. Lo strato distinto all'interfaccia tra il cp e la MZ indica un corretto processo di migrazione, arresto e laminazione.I dendriti si estendevano nella ZM mentre gli assoni corticougal si estendevano al di sotto della PC e nella ZI. Le cellule in differenziamento erano cellule GFP positive in vari stadi di maturità, inclusi neuroni con una morfologia bipolare adiacente alle fibre radio gliali e, al di sotto di queste, neuroni multipolari nella ZI. I dendriti si estendevano anche nella ZM, dove la proteina della matrice extracellulare (ECM) readina è correttamente localizzata mediante immunolocalizzazione.Pertanto, le condizioni di elettroporazione e di coltura di espianti permettono uno sviluppo normale dei neuroni corticali. Come previsto, neuroni positivi per GFP post-mitotici hanno colonizzato il cp in formazione. Pertanto, il protocollo può indirizzare in modo affidabile i neuroni corticali di tipo L6 per studi sul loro processo migratorio e sulla maturazione.L'uso esteso di questo procedimento ha portato a un tasso di successo del 79%. 195 tentativi su 248 si sono rivelati adatti all'acquisizione di immagini e all'analisi. Metà degli insuccessi è dovuta alla mancata espressione di GFP o al mancato raggiungimento del GFP target. Una volta acquisita padronanza, il metodo risulta efficace.Questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti se svolta correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esercitarsi nelle dissezioni in modo che gli emisferi elettroporati possano essere coltivati con le meningi integre dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a tempo-lampo, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo le mutazioni di interesse interrompono la migrazione neuronale o l'agenesi dendritica.

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Scopri l'elettroporazione ex utero e la preparazione di emisferi cerebrali interi da embrioni di topo per studiare lo sviluppo corticale precoce. Questo metodo facilita analisi istologiche e studi farmacologici.

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale (Video) | JoVE Journal

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

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