Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

L'obiettivo generale di questo procedimento è preparare un emisfero cerebrale intero in espianto per lo studio dello sviluppo corticale precoce. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando embrioni di topo al giorno embrionale 13. Successivamente, si inietta la miscela di DNA plasmidico nel ventricolo cerebrale ed esegue un'elettroporazione ex utero.

Quindi preparare un espianato di emisfero intero dall'embrione elettroporato. L'ultimo passaggio consiste nel fissare e sezionare l'espianato di emisfero intero per analisi istologiche. Infine, la conseguenza di una mutazione o dell'esposizione a tossine sullo sviluppo dei neuroni corticali può essere valutata mediante analisi immunoistochimiche dei neuroni esprimenti GFP.

Mi chiamo Eric Olson. Sono del Dipartimento di Neuroscienze e Fisiologia qui alla SUNY Upstate Medical University di Syracuse, e oggi vi mostreremo un metodo da noi sviluppato chiamato whole Hemisphere X explan. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come lo slice explan è che gli whole hemisphere X explan sono semplici da preparare e permettono due giorni di crescita organotipica.

Il metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neurologico, come ad esempio in che modo una particolare mutazione o una tossina interrompono lo sviluppo corticale precoce. Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà, poiché la preparazione dell'espianato emisferico completo senza danneggiare le meningi può richiedere una certa pratica. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di dissezione e di trasferimento dell'espianato sono difficili da apprendere a causa della sensibilità del tessuto alle sollecitazioni meccaniche.

La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Theresa Ozzi, un'aspirante ricercatrice del mio laboratorio. Per questo protocollo, utilizzare un kit disponibile in commercio per purificare i plasmidi. Preparare il DNA plasmidico a 0,33 milligrammi per millilitro in acqua e aggiungere il colorante blu metilene come tracciante per l'iniezione a circa lo 0,02% peso in volume; disinfettare sempre gli strumenti chirurgici, l'area di lavoro e il microscopio.

Con etanolo al 70% quindi sacrifica un numero richiesto di femmine Swiss Webster al giorno E 13 mediante inalazione di anidride carbonica. Una volta rimossi gli embrioni, posizionarli in una piastra da 10 centimetri contenente HBSS freddo di ghiaccio, mantenuta a temperatura bassa. Dissezionare con attenzione ciascun embrione dalle membrane extraembrionali circostanti.

Ora trasferire singolarmente ogni embrione in una piastra pulita con HBSS ghiacciato. Utilizzando una siringa Hamilton, iniettare da due a tre microlitri del DNA preparato nel ventricolo dell'emisfero cerebrale sinistro. Non iniettare nell'area corticale destinata all'analisi futura né nelle sue immediate vicinanze.

Per elettroporare il DNA, tenere delicatamente l'embrione con una pinzetta e posizionare leggermente la paletta positiva dell'elettrodo a pinzetta sulla linea mediana dorsale della testa. Posizionare leggermente la paletta negativa sotto il mento dell'embrione. Eseguire un programma di cinque impulsi di 30 volt, ciascuno di 50 millisecondi, a intervalli di un secondo, utilizzando un elettroporatore modello BTX 830; altri sistemi possono essere impostati seguendo le istruzioni del produttore.

Riposizionare ogni embrione nell'HBSS ghiacciato e procedere con la preparazione dell'emisfero intero Explan sotto un microscopio stereoscopico utilizzando due pinzette da orefice numero cinque. Rimuovere la pelle e il cranio cartilagineo dalla testa dell'embrione. Successivamente, far scivolare le pinzette al di sotto del cervello.

Per rimuovere l'intero cervello dal cranio, dissezionare l'emisfero elettroporato, compreso il tessuto del mesencefalo ad esso collegato. Prestare attenzione a non danneggiare le meningi sovrastanti l'emisfero corticale dissezionato. Abbiamo riscontrato che il passaggio più difficile da padroneggiare è la dissezione e la rimozione dell'emisfero elettroporato senza danneggiare le meningi.

Dopo la dissezione, trasferire ogni emisfero in cinque millilitri di HBSS freddo di ghiaccio utilizzando una punta di pipetta allargata da un millilitro. Se necessario, gli embrioni possono essere mantenuti in pozzetti separati di una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti. Successivamente, trasferire delicatamente fino a sei emisferi su una cultura in collagene da 24 millimetri.

Inserire e posizionare con il lato mediale verso il basso. Riempire ora una pozzetta da 35 millimetri di una piastra a sei pozzetti con 2,7 millilitri di mezzo integrato. Rimuovere qualsiasi eccesso di HBSS dall'inserto e posizionare l'inserto nella pozzetta; con una pipetta, aggiungere alcune gocce di mezzo dalla pozzetta sulla superficie superiore di ogni x explan.

Non aumentare il volume del mezzo. Abbiamo scoperto che è fondamentale posizionare alcune gocce di mezzo di coltura sopra l'espianto X, in modo che gli espianti X non siano completamente ricoperti dal mezzo. Questo può significare aggiungere fino a 400 microlitri ai 2,7 mil di mezzo presenti sopra l'espianto X.

Spostare la piastra in una camera di Billups-Rothenberg che contiene un piatto umidificante con acqua ed è stata saturata con ossigeno al 95% per almeno un minuto. Sigillare ermeticamente la camera e scollegare il tubo di alimentazione del gas. Collocare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per due giorni, entro i quali sarà avvenuta la suddivisione delle prepl.

In preparazione. Preparare tamponi per l'inclusione del campione. Preparare una soluzione al 10% di gelatina di pelle di vitello a 60 gradi Celsius.

Una volta solubilizzato, versare circa 10 millilitri della soluzione in una piastra da 10 centimetri. Mantenere la soluzione rimanente a 60 gradi Celsius per un uso successivo. Lasciare solidificare le matrici per mezz'ora, se necessario.

Possono essere conservati a quattro gradi Celsius per diversi giorni, ma devono essere riscaldati a temperatura ambiente prima dell'uso. Il giorno della fissazione in cappa, preparare la soluzione Pagano con fissativo e la soluzione Pagano senza fissativo. Riscaldare la soluzione di fissazione a 37 gradi Celsius.

Estrarre con attenzione e rapidamente gli espianti dall'incubatore senza disturbare i tessuti. Rimuovere la maggior parte del mezzo e sostituirlo con cinque millilitri di fissativo riscaldato. Assicurarsi che ogni espianto sia completamente immerso.

Fissare i tessuti per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il fissativo e sostituirlo con soluzione di Pagano. Senza fissativo.

Aggiungere alcune gocce di azide di sodio al 10% in ogni pozzetto. I tessuti possono ora essere conservati a quattro gradi Celsius fino al loro inserimento su un supporto di inclusione. Disegnare una griglia sul fondo della piastra avvalendosi di un righello.

Preparare quadrati di due o tre centimetri. Trasferire i singoli espianti sul cuscinetto di inclusione. Aspirare qualsiasi soluzione residua e ricoprire ciascun espianto con soluzione calda di gelatina al 10%.

Lasciarlo solidificare. Una volta solidificato lentamente, aggiungere ulteriore soluzione di gelatina fino a quando ciascun espianto è completamente circondato. Evitare di sciogliere il pad, cosa che può verificarsi se si aggiunge troppa gelatina contemporaneamente.

Ora, lasciare indurire la gelatina per circa un'ora. Una volta indurita, il singolo esplan può essere tagliato in piccoli blocchi di gelatina prima della sezionatura. È importante fissare ulteriormente i blocchi nel fissativo di Pagano per uno o due giorni.

Durante il sezionamento, posizionare gli espianti con il bulbo olfattivo rivolto verso l'alto e praticare sezioni nel piano coronale con uno spessore di 100 micrometri. Raccogliere le sezioni in PBS freddo contenente azide sodica 0,1%.

Conservare le sezioni a quattro gradi Celsius fino a quando non possono essere colorate utilizzando la tecnica descritta. Gli espianti di emisfero intero sono stati preparati all'E 13 prima della separazione prelativa. Nel neocorteccio dorsale.

Il tessuto ospitava un transgene che segnala i neuroni immaturi della linea corticale eccitatoria. Espianti corticali provenienti dalla stessa nidiata sono stati fissati goccia a goccia in modo sequenziale nell'arco di due giorni in coltura e successivamente sottoposti ad analisi istologica. Al tempo iniziale di analisi, al giorno zero in vitro (DIV), la suddivisione prepl non si è ancora verificata nel campo uno per uno.DIV.

Il CP diventa evidente e continua a crescere fino al 2° giorno in vitro. Pertanto, gli espianti emisferici interi coltivati inizialmente al giorno embrionale 13 hanno sostenuto per due giorni la maturazione della corteccia cerebrale, catturando la scissione del precursore nella neocorteccia dorsale per confermare lo sviluppo istologico normale nella neocorteccia dorsale. Gli espianti al 2° giorno in vitro sono stati sottoposti a colorazione immunoistochimica per solfato di condroitina, proteoglicani e componente della matrice extracellulare. Due bande di immunoreattività nella corteccia dorsale hanno indicato una corretta suddivisione del PPP in zona marginale (MZ) e strato prepiramidale (SP) durante il periodo di coltura in vitro.

Il PP è stato suddiviso da sei neuroni corticali esprimenti CTIP due e TBR R uno. Il pattern di immunomarcatura di questi marcatori conferma l'espressione appropriata di questi fattori di trascrizione nel cp appena formato. Nel complesso, queste analisi confermano lo sviluppo corticale precoce di tipo organotipico nell'intero emisfero explantato, utilizzando l'intero protocollo descritto; sono stati iniettati nel ventricolo sinistro di embrioni E 13 integri.

Espressione di GFP elettroporata e processata osservabile a partire dai precursori neuronali nella vz. Mentre cellule intensamente positive per GFP sono state osservate nell'IZ e nel cp, in modo significativo numerosi neuroni positivi per GFP, indicati dalle frecce, sono stati osservati nella parte superiore del cp in formazione, con dendriti e assoni emergenti. Lo strato distinto all'interfaccia tra il cp e la MZ indica un corretto processo di migrazione, arresto e laminazione.

I dendriti si estendevano nella ZM mentre gli assoni corticougal si estendevano al di sotto della PC e nella ZI. Le cellule in differenziamento erano cellule GFP positive in vari stadi di maturità, inclusi neuroni con una morfologia bipolare adiacente alle fibre radio gliali e, al di sotto di queste, neuroni multipolari nella ZI. I dendriti si estendevano anche nella ZM, dove la proteina della matrice extracellulare (ECM) readina è correttamente localizzata mediante immunolocalizzazione.

Pertanto, le condizioni di elettroporazione e di coltura di espianti permettono uno sviluppo normale dei neuroni corticali. Come previsto, neuroni positivi per GFP post-mitotici hanno colonizzato il cp in formazione. Pertanto, il protocollo può indirizzare in modo affidabile i neuroni corticali di tipo L6 per studi sul loro processo migratorio e sulla maturazione.

L'uso esteso di questo procedimento ha portato a un tasso di successo del 79%. 195 tentativi su 248 si sono rivelati adatti all'acquisizione di immagini e all'analisi. Metà degli insuccessi è dovuta alla mancata espressione di GFP o al mancato raggiungimento del GFP target. Una volta acquisita padronanza, il metodo risulta efficace.

Questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti se svolta correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esercitarsi nelle dissezioni in modo che gli emisferi elettroporati possano essere coltivati con le meningi integre dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a tempo-lampo, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo le mutazioni di interesse interrompono la migrazione neuronale o l'agenesi dendritica.