Rivestimenti grafene per impianti biomedici

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un metodo per rivestire il nitinolo, in lega di memoria di forma metallica, con grafene per una migliore emocompatibilità nei materiali implantari a contatto con il sangue. Ciò si ottiene coltivando prima il grafene su lamine di rame utilizzando la deposizione chimica da vapore. Il secondo passo consiste nell'incidere le lamine di rame e trasferire il grafene preparato su substrati di nitinol.

Successivamente, i substrati di nitinolo rivestiti di grafene vengono utilizzati per la coltura di cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. Per quantificare la citocompatibilità, un altro test consiste nel verificare l'emocompatibilità codificando entrambe le proteine, il fibrinogeno e l'albumina sui substrati di nitinolo rivestiti di grafene. In definitiva, la spettroscopia di micro ramina, la microscopia confocale in saggi di citotossicità in vitro e l'analisi delle proteine della pagina SDS vengono utilizzati per mostrare il successo del rivestimento del grafene, una migliore morfologia cellulare, una migliore vitalità cellulare e una migliore emocompatibilità.

Il vantaggio principale di questa tecnica o di tecniche esistenti come il rivestimento polimerico, è che i rivestimenti in grafene sono estremamente durevoli e resistenti alla corrosione. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al miglioramento dell'origine delle tecnologie degli stent perché si prevede che le proprietà intrinseche del materiale dei grafeni riducano l'assorbimento delle proteine e riducano l'attivazione dei fattori di coagulazione a causa del cambiamento di conferma delle proteine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni, gli stent in nitinol rivestiti di grafene possono essere utilizzati anche per altri sistemi, come valvole cardiache o cateteri.

Per iniziare, posizionare fogli di rame di un centimetro per un centimetro in un forno tubolare di quarzo da un pollice e riscaldare a 1000 gradi Celsius in presenza di 50 SCCM di idrogeno e 450 SCC CM di Argonne. Successivamente, introdurre uno e quattro SCCM di metano nel forno a 1000 gradi Celsius a diverse portate per 20-30 minuti. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente all'interno del forno sotto il flusso di idrogeno, argonne e metano.

Dopo aver rimosso i campioni dal forno, tagliarli in quadrati da 4,5 millimetri e utilizzare PMMA diluito con il 4% di anole per rivestire le lamine di rame a 4.000 giri/min, seguito da un trattamento termico per cinque minuti a 150 gradi Celsius. Mordenzare la lamina di rame utilizzando l'incisione CE 100 fino a quando la lamina di rame non è completamente incisa. Sciacquare in acido cloridrico al 10% per 10 minuti, quindi in acqua deionizzata per 10 minuti.

Per ottenere il campione di grafene PMMA, trasferire i campioni di grafene su substrati di nitinolo da 4,5 millimetri quadrati. Successivamente si passa a 450 gradi Celsius in 300 SCCM di Argon e 700 SCCM di idrogeno per due ore. Per rimuovere il PMMA, lavare infine i substrati di nitinolo con acetone per sciogliere il PMMA residuo per ottenere il campione di grafene nichel titanio.

Per iniziare i test di tossicità, aggiungere nitinol incontaminato, uno o quattro substrati di nitinolo di grafene SCCM a piastre a 96 pozzetti, dove l'SCCM dichiarato corrisponde al flusso di metano utilizzato nella crescita della deposizione chimica da vapore del grafene. Successivamente, seminare cellule endoteliali aortiche di ratto da 10 a 5 cellule per pozzetto in alcuni dei pozzetti contenenti nitinolo incontaminato, uno o quattro SCCM. Substrati di grafene nitinolo, semina cellule muscolari lisce aortiche di ratto in modo simile in un diverso insieme di pozzetti.

Far crescere le cellule per tre o sette giorni in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, scambiando terreni a giorni alterni. Al termine dell'ora, rimuovere il terreno dai pozzetti contenenti le cellule muscolari lisce e aggiungere a ciascuno di essi un terreno fresco contenente 0,5 milligrammi per millilitro di MTT. Incubare bene le cellule per altre tre ore.

Quindi, rimuovere delicatamente il terreno e aggiungere 100 microlitri di dimetilsolfossido a ciascun pozzetto. Dopo aver lasciato che i cristalli MTT si dissolvano per 10 minuti, trasferire la soluzione in un'altra piastra a pozzetti. Per il test MTS, rimuovere i terreni dai pozzetti contenenti cellule endoteliali al punto temporale finale.

Sostituire con 120 microlitri di soluzione MTS e incubare per tre ore. Quindi trasferire il contenuto del pozzetto in una nuova piastra. Leggere l'assorbente a 490 nanometri e determinare la percentuale di vitalità normalizzando l'assorbanza all'assorbanza media del campione di nitinolo incontaminato.

Ripetere questo passaggio almeno cinque volte per ogni campione. Per l'imaging confocale delle cellule muscolari lisce dell'aorta di ratto, posizionare i substrati in un vetrino a otto camere, lasciando una camera vuota come controllo. Successivamente, seminare le cellule in tutte le camere a 25.000 cellule per camera e incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo aver rimosso il terreno dai vetrini, far aderire le cellule sul substrato con il 4% di formaldeide in tampone PBS per 20 minuti. Lavare con PBS, quindi permeasare con 0,1% di Triton X per un minuto. Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere 100 microlitri della soluzione LOR 4 88 PHIN a 1,9 millilitri di tampone PBS.

Per visualizzare l'acton, colorare le cellule con 250 microlitri di LOR 4 88 Phin per 45 minuti, quindi lavare due volte con tampone PBS. Quindi, colorare i nuclei con un mezzo di montaggio fluorescente contenente dpi. Raccogli immagini confocali utilizzando un ti.

Prima di iniziare gli esperimenti di assorbimento delle proteine dell'albumina e del fibrinogeno, misurare le dimensioni del substrato con dei calibri. Effettuare tre misurazioni per ciascun lato dei campioni approssimativamente quadrati e fare la media. Per ottenere la lunghezza e la larghezza, posizionare il campione di nitinol incontaminato, l'unico campione di nitinol di grafene SCCM e i quattro campioni di nitinol di grafene SCCM in due 12.

Le piastre a pozzetti aggiungono un tampone PBS contenente un milligrammo per millilitro di albumina. Aggiungere la temperatura ambiente a una delle piastre e incubare separatamente per tre ore. Incubare i tre tipi di campioni con tampone PBS contenente un milligrammo per millilitro.

Fibrinogeno a temperatura ambiente per tre ore dopo aver lavato i campioni con PBS, combinare i campioni simili in una provetta da microcentrifuga con 200 microlitri di tampone riducente e far bollire per cinque minuti. Diluire i campioni in un rapporto volume/volume da uno a nove di tampone T glicina SDS per acqua deionizzata e passare attraverso un gel per elettroforesi di poliacrilammide tris dal 4 al 15% a 90 volt per 100 minuti. Diluire la soluzione madre di spro red in un rapporto da uno a 5.000 in acido acetico al 7,5%.

Successivamente, colorare i gel per 60 minuti con la soluzione diluita di rosso spro. Avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere lo spro rosso dai gel di immagine leggeri utilizzando un Fluor chem SP e quantificare l'intensità della fluorescenza utilizzando il software Image J. Quindi normalizzare l'intensità fluorescente di ciascun campione in base all'area totale del substrato e confrontare l'assorbimento del fibrinogeno con l'assorbimento dell'albumina.

Il metodo della deposizione chimica da vapore ha prodotto campioni di grafene policristallino che imitano i grani di cristallo di rame. La spettroscopia ramen è stata utilizzata per confermare la presenza di grafene monostrato su un SCCM e quattro campioni SCCM. L'unico campione di SCCM mostra un'intensa banda GPR che indica la natura monostrato del grafene preparato. Al contrario, i quattro campioni SCCM mostrano una banda GPR relativamente più debole, che conferma la presenza di alcuni strati di grafene Nella foto qui è un'immagine al microscopio a forza atomica del grafene trasferito su substrati di nitinolo.

Misurazioni dettagliate del campione hanno prodotto un valore di rugosità superficiale di circa cinque nanometri. Mostrato. Ecco le immagini di microscopia ottica confocale per cellule muscolari lisce coltivate su un vetrino controllato su substrati di nitinolo incontaminati su un substrato di nitinolo di grafene SCCM e su quattro substrati di nitinolo di grafene SCCM. Le cellule sono dense e sferiche su entrambe le superfici del nitinolo di grafene, il che dimostra una migliore morfologia cellulare.

I saggi MTT e MTS mostrano che uno e quattro substrati di nitinolo di grafene SCCM non mostrano una differenza significativa nella vitalità delle cellule muscolari lisce rispetto al nitinolo incontaminato. I test MTS mostrano che la vitalità cellulare di tre giorni per le cellule endoteliali non era significativamente diversa da quella dei controlli. Le immagini al microscopio elettronico a scansione mostrano che le cellule endoteliali cresciute su substrati incontaminati di nitinolo sono rade e allungate, mentre sono ellissoidali e dense su uno e quattro substrati di nitinolo di grafene SCCM.

Questi risultati dimostrano che i rivestimenti in grafene portano a una migliore morfologia cellulare sferica delle cellule endoteliali, l'uno SCCM e i quattro campioni di nitinolo di grafene SCCM mostrano un basso rapporto fibrinogeno albumina rispetto al campione di nitinolo incontaminato, suggerendo una migliore compatibilità emografica derivante dal grafene. L'equilibrio del livello di Fermi è mostrato dal diagramma del livello di energia per il fibrinogeno e dalla densità degli stati elettronici per il grafene. Un trasferimento di elettroni dal fibrinogeno al nitinolo di grafene è possibile solo dagli stati elettronici occupati della molecola di fibrinogeno agli stati elettronici vuoti del nitinolo di grafene allo stesso livello di energia.

Sia il grafene mono che quello a pochi strati sono semimetalli a temperatura ambiente con una bassa densità di elettroni a livello di furia, che si traduce in un debole trasferimento di carica dal fibrinogeno al grafene. Il grafene non mostra alcun cambiamento nella forma o nella frequenza della linea di banda GB, indicando un debole trasferimento di carica dalle proteine plasmatiche. I picchi contorti D ottenuti dall'adattamento della curva sono mostrati in nero per dimostrare l'utilità e la fattibilità del grafene come rivestimento implantare.

Un penny di rame rivestito di grafene è stato esposto al 5% di perossido di idrogeno. La parte rivestita di grafene del penny è rimasta invariata mentre la parte scoperta è stata scolorita dalla soluzione di perossido di idrogeno. Inoltre, il nitinolo di grafene immerso in acido nitrico al 70% non ha mostrato alcun cambiamento nella frequenza della banda GB, confermando che il rivestimento in grafene è estremamente resistente.

Inoltre, il rivestimento di grafene in nitinolo di grafene si è ridotto al tasso X del rame sottostante indicando l'impermeabilità delle membrane di grafene. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come trasferire grafene e impianti biomedici per migliorarne la biocompatibilità.