Name: Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-24T18:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Impara l'isolamento di cardiomiociti da topo adulto mediante perfusione Langendorff per studi di biologia cardiovascolare. Questo metodo consente la coltura, la transfezione virale e l'analisi funzionale della contrazione e del calcio.

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<ol><li>Chlopcikova, S., Psotová, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+cardiomyocytes-a+model+for+the+study+of+morphological%2C+biochemical+and+electrophysiological+characteristics+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Papers%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart.</a> Biomedical Papers. , (2001).</li>
<li>Rosenthal, N., Brown, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+ascending%3A+perspectives+for+human-disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The mouse ascending: perspectives for human-disease models.</a> Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).</li>
<li>Ballou, L. M., Lin, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+and+mTOR+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin and mTOR kinase inhibitors.</a> J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).</li>
<li>Brette, F., Orchard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Tubule+Function+in+Mammalian+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes.</a> Circ Res. , (2003).</li>
<li>Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decompensation+of+pressure-overload+hypertrophy+in+G%3Fq-overexpressing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice.</a> Circulation. , (1998).</li>
<li>Lieu, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Transverse+Tubules+Contributes+to+Non-Uniform+Ca+2%2BWavefronts+in+Mouse+and+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).</li>
<li>Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+cardiac+hypertrophy+in+transgenic+disease+models+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).</li>
<li>Muthuchamy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+a+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+mutation+in+alpha-tropomyosin+manifests+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction.</a> Circ. Res. 85, 47-56 (1999).</li>
<li>Müller, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+the+cardiac+sodium+calcium+exchanger+promoter+in+adult+and+neonatal+cardiomyocytes+by+Nkx2.5+and+serum+response+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).</li>
<li>Epstein, F., Hunter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+for+cardiac+hypertrophy+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure.</a> New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).</li>
<li>Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+modifies+Ca+2%2B+signaling+during+excitation-contraction+coupling+in+neonate+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes.</a> Cell Calcium. , (2007).</li>
<li>Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Na%2B%2FCa2%2B-exchanger+overexpression+on+excitation-contraction+coupling+in+adult+rabbit+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).</li>
<li>Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mechanism+of+action+potential+prolongation+in+ventricular+myocytes+from+dogs+with+pacing-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure.</a> Circ. Res. 78 (2), (1996).</li>
<li>Splawski, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+of+SCN5A+sodium+channel+implicated+in+risk+of+cardiac+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia.</a> Science. 297, 1333-1336 (2002).</li>
<li>Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+adenoviral+infection+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%3A+methods+for+cellular+genetic+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).</li>
<li>Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+cardiac+hypertrophy+in+mice+by+calcineurin+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition.</a> Science. , (1998).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+diazoxide-induced+formation+of+reactive+oxygen+species+and+loss+of+cardioprotection+in+connexin+43+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice.</a> Circ. Res. 97, 583-586 (2005).</li>
<li>Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connexin+43+in+ischemic+preconditioning+does+not+involve+intercellular+communication+through+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).</li>
<li>Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+atrial-specific+and+inducible+expression+of+an+atrial+natriuretic+factor+transgene+in+an+in+vivo+murine+model+of+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).</li>
<li>Nakamura, A., Rokosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LV+systolic+performance+improves+with+development+of+hypertrophy+after+transverse+aortic+constriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).</li>
<li>Boström, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PGC1-%3F-dependent+myokine+that+drives+brown-fat-like+development+of+white+fat+and+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis.</a> Nature. 481, 463-468 (2012).</li>
<li>Liao, R., Jain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes.</a> Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).</li>
<li>Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+of+adult+ventricular+rat+heart+muscle+cells+in+serum-free+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).</li>
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<li>Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+and+Perfusion+Techniques+for+Studying+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes.</a> J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recording+of+Ion+Channels+Expressed+in+Xenopus+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes.</a> J. Vis. Exp. (20), e936(2008).</li>
<li>Arman, A. C., Sampath, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+Clamp+Recordings+from+Mouse+Retinal+Neurons+in+a+Dark-adapted+Slice+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation.</a> J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).</li>
<li>Wen, H., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+patch+clamp+recordings+from+motor-neuron+and+target+skeletal+muscle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).</li>
<li>Maier, S., Westenbroek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+role+for+brain-type+sodium+channels+in+coupling+of+cell+surface+depolarization+to+contraction+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).</li>
<li>Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+micromechanical+properties+of+cultured+rat+atrial+myocytes+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy.</a> Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).</li>
<li>Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+mechanical+pulse+of+single+cardiomyocytes+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope.</a> European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).</li>
<li>Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+Viscoelastic+Behavior+of+Cultured+Airway+Smooth+Muscle+Cells+with+Atomic+Force+Microscopy%3A+Stiffening+Induced+by+Contractile+Agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist.</a> Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo rapporto, abbiamo descritto le tecniche necessarie per l&#39;isolamento di successo e la cultura degli adulti CM dal cuore mouse. La nostra tecnica consente successivo studio della funzione CM e l&#39;eccitabilità con i metodi sopra descritti. Il parametro critico per studiare la funzionalità di adulto CMS è la salute e la qualità della isolato CM. Come descritto sopra, le nostre tecniche consentono un elevato rendimento di cellule funzionali che sono suscettibili di manipolazione dell&#39;espressione genica u...

Modelli murini di malattie cardiovascolari sono serviti come strumenti efficaci per chiarire i meccanismi fondamentali di malattia 1,2 e per identificare potenziali obiettivi terapeutici 1,3. In particolare, l&#39;utilizzo di entrambi i modelli murini di malattia cardiaca acquisita (per esempio pressione sovraccarico) 4,5 e modelli di topi transgenici hanno avanzato la nostra comprensione di malattie cardiache 6-8. L&#39;uso di tecniche di coltura cellulare per studiare cascate di segnalazione 3,9,10 e alterazioni in singole proteine ​​che sono alla base eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore 11-13 a livello di singola cellula hanno integrato i modelli di topo in vivo. Tuttavia, la mancanza di linee cellulari adeguate che riflettono la struttura e la funzione adulto CM è una limitazione significativa. Gli investigatori hanno cercato di superare questo studiando singole proteine, come i canali ionici, in sistemi di espressione eterologhi <sup&gt; 14, e mentre questi studi ci hanno fornito informazioni utili in termini di biofisica dei canali ionici o traffico di proteine, la rappresentazione inadeguata del microambiente nativo di CMS è una limitazione significativa. In secondo luogo, poiché la maggior parte di queste cellule eterologhe non hanno un apparato contrattile maturo, ma non e stato possibile studiare la funzione contrattile e la complessa interazione tra l&#39;eccitabilità e la contrazione cellulare. Per questo motivo, i ricercatori si sono rivolti a colture cellulari primarie cardiaco per molti dei loro studi funzionali in vitro. Infine, gli studi cardiomiociti isolati consentono la valutazione della funzione contrattile senza i fattori di confondimento di preparazione multicellulare compreso l&#39;effetto di cicatrice o fibrosi e orientamento delle fibre. Primarie neonatali cardiomiociti di ratto ventricolari (NRVMs) sono relativamente facili da cultura, possono essere infettati con adenovirus e lentivirus per manipolare l&#39;espressione genica 15, unnd sono stati quindi utilizzati con successo 1, ma hanno dei limiti dei loro propri. Anche se offrono un microambiente fisiologico 1 e sono stati il cavallo di battaglia del campo di segnalazione, le differenze sostanziali tra la morfologia e l&#39;organizzazione subcellulare di NRVMs e cardiomyoctyes adulti li rendono un modello inadeguato per lo studio dei flussi ionici e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore adulto . In particolare NRVMs mancano di una t-tubolare sottosistema definitivo 4. Da Ca 2 + flusso e la dinamica sono criticamente dipendente matura t-tubulare e reticolo sarcoplasmatico (SR) Struttura 6, Ca 2 + dinamiche e gli studi funzionali della contrattilità cardiaca in NRVMs non sono una riflessione accurata di questi processi critici in cardiomiociti adulti. Inoltre, alcuni componenti di vie di segnalazione differiscono tra neonatale ed adulta topi 9, fornendo così un altro limite per lo studio dei processi di malattia e la loro iIMPATTO su eccitabilità cellulare e contrattilità in NRVMs. Infine, la distribuzione della macchina contrattile provoca l&#39;accorciamento cella multidirezionali e non uniforme limitando la precisione delle misure contrattili. L&#39;uso di cardiomiociti isolati adulte fornisce quindi un più accurato sistema di modellazione in vitro. La straordinaria crescita della conoscenza resa possibile dalla manipolazione genetica di topi sottolinea l&#39;importanza di ottenere cardiomiociti funzionali isolate da topi. Infatti, la caratterizzazione di CM adulte isolate da modelli murini ha fatto luce su molti eventi biologici e patologici. Isolato CMS da modelli di topi transgenici hanno permesso per studi del guadagno o la perdita della funzione delle proteine ​​sulle proprietà contrattili delle singole cellule 2,16, e la vitalità in modelli di malattia come ischemia / riperfusione 17,18, integrando in tal modo le informazioni acquisite in Studi in vivo sultopi sé. L&#39;uso di isolati adulto CMS da modelli murini di malattie cardiache acquisite 3,19,20 (come il sovraccarico trasversale aortica costrizione indotta pressione, che imita l&#39;ipertensione o stenosi valvolare aortica) o l&#39;esercizio 5,21 (per la modellazione di ipertrofia fisiologica) consente per l&#39;esame dell&#39;interazione di cascate di segnalazione implicati in questi processi con l&#39;eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione a livello di singola cellula. Inoltre, la capacità di manipolare l&#39;espressione genica usando l&#39;espressione dei geni, guidato in adulto CMs ci offre l&#39;opportunità di sezionare i componenti di vie di segnalazione complessi. Dal punto di vista elettrofisiologico, tensione whole-cell e gli esperimenti clamp attuali isolato adulto CM sono stati critici nel chiarire la natura dei flussi ionici al basale e in vari stati di malattia. A causa della complessa struttura della membrana cellulare e la prote differenzialein strutture ponteggi tra adulti CM e NRVMs o linee cellulari eterologhi, la possibilità di patchare le cellule adulte fornisce una migliore rappresentazione degli effetti di alcune proteine ​​di membrana, proteine ​​strutturali, e che interagiscono partner di canale di ioni sui componenti elettrofisiologiche del cuore adulto. Nonostante tali vantaggi importanti nello studio degli adulti cardiomiociti murini, isolamento e coltura di cardiomiociti topi adulti è stato impegnativo, sollecitando la necessità di una descrizione sistematica e accurata della metodologia per isolare cardiomiociti vitali mouse e al loro mantenimento in coltura per consentire un ulteriore manipolazione genetica utilizzando virale vettori. Precedenti studi hanno utilizzato sia acuto isolato topo adulto CMS o coltivate ratto adulto CM. Questi ultimi sono più facili da cultura di topo adulto CM, e la maggior parte degli esperimenti di manipolazione di espressione genica in vitro hanno usato ratto adulto CM. Pochi studi hanno modificato con successo e indagato functiespressione genica onale in topo adulto CM, presentando una grande limitazione nella portata di esperimenti. Pertanto, qui vi presentiamo in dettaglio tali metodologie, modificati dalle indagini precedenti, per l&#39;isolamento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infezione adenovirale 11-13,15, e analisi funzionale di cardiomyoctyes ventricolari topo adulto. Questo protocollo isolamento risultati in Ca 2 +-tolleranti, cardiomiociti eccitabili che abbiamo successo in coltura per un massimo di 72 ore e transitoriamente trasfettate con adenovirus. La funzionalità di queste cellule isolate può essere valutata utilizzando il sistema di imaging MMSYS 14,24 e patch clamp, che sarà anche discusso.

<table><tbody><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio minimo</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Butandione monoxime</td><td>Sigma</td><td>B0752</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi B</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088807001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi XIV da Streptomyces griseus</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo</td><td>Sigma</td><td>51411C</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di albumina da siero bovino</td><td>Sigma</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di selenito di sodio supplemento</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/289329?lang=en&amp; region=US" target="_blank">289329</a></td><td></td></tr><tr><td>Glutammato</td><td>Sigma</td><td>G3291</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-ammina&#8211; acido tetraacetico</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di cesio</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di tetraetilammonio</td><td>Sigma</td><td>86643</td><td></td></tr><tr><td>Visiera binoculare in vetro ottico OptiVisor</td><td>Dohegan Optical Company Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti, 5,5", 1x2 denti</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Moloney - 4,5" (11,5 cm) di lunghezza, seghettate </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Pinze, Dumostar, dimensioni della punta 0,17 x 0,10 mm</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-4966</td><td></td></tr><tr><td>Packer Mosquito Pinze 5" Dritte Piatte</td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-7114</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione 4.5" Curvo Affilato/Affilato </td><td>Roboz Scientific</td><td>RS-5917</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione 3.5" Dritto Affilato/Affilato20mm</td><td>Roboz</td><td>Scientific RS-5907</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto cardiomyoctyes

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

L&#39;uso di cardiomiociti primari (CMS) in cultura ha fornito un potente complemento modelli murini di malattie cardiache nelle avanzare la nostra comprensione di malattie cardiache. In particolare, la capacità di studiare l&#39;omeostasi di ioni, la funzione del canale ionico, eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione e loro alterazioni in condizioni malate e da mutazioni patogenetiche hanno portato a intuizioni significative sulle malattie cardiache. Inoltre, la mancanza di una linea cellulare adeguata immortalato per imitare adulti CM, e le limitazioni della neonatale CM (che mancano molti dei biomeccanica caratteristica strutturale e funzionale degli adulti CMS) in coltura hanno ostacolato la nostra comprensione della complessa interazione tra le vie di segnalazione, canali ionici e le proprietà contrattili del cuore adulto rafforzare l&#39;importanza di studiare adulte isolate cardiomiociti. Qui vi presentiamo i metodi per l&#39;isolamento, la cultura, la manipolazione dell&#39;espressione genica da adenovirus-espresproteine ​​ssed, e la successiva analisi funzionale dei cardiomiociti dal topo adulto. L&#39;uso di queste tecniche vi aiuterà a sviluppare la comprensione meccanicistica in vie di segnalazione che regolano l&#39;eccitabilità cellulare, Ca 2 + dinamiche e contrattilità e di fornire una caratterizzazione molto più fisiologicamente rilevanti di malattie cardiovascolari.

L&#39;isolamento di adulti cardiomyoctyes risultati nelle cellule a forma di bastoncello, striati, e quiescenti (non spontaneamente battere) (Figura 5A). Le cellule morte guarderanno arrotondate e senza striature saranno presenti. Cellule quiescenti possono essere coltivate e trasfettate con adenovirus per manipolare l&#39;espressione genica (figure 5B e 5C). Dopo 24 ore di coltura, la morfologia delle cellule vive non cambia, sono ancora Ca 2 +-tolerant, e p...

Qui si descrive l&#39;isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l&#39;espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, coltivare e visualizzare la contrazione e la gestione del calcio nei cardiomiociti adulti. Questo viene ottenuto rimuovendo innanzitutto il cuore del muretto e posizionandolo a temperatura ambiente in PBS. Il cuore può essere cannullato nella piastra come mostrato nel disegno schematico oppure direttamente sull'ago collegato al sistema di perfusione, come mostrato nel filmato.Il terzo passaggio consiste nel lavare e digerire il cuore mediante perfusione pompatrice, tampone e successivamente tampone enzimatico attraverso il sistema. L'ultimo passaggio prevede il taglio dei ventricoli in una capsula contenente tampone di trasferimento e la tritatura delicata del tessuto con pinzette. In definitiva, i risultati possono mostrare la contrazione cellulare dei singoli cardiomiociti e la gestione del calcio mediante misurazioni dell'intera cellula e/o della lunghezza del sarcomero e analisi ratiometrica.Indicatori del calcio come RO 2:00 AM con il sistema ottico a ioni. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà perché può essere complesso appendere rapidamente il cuore attraverso l'aorta senza danneggiare il v

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Biologia

Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Descriviamo un metodo affidabile per l'isolamento di cardiomiociti di topo adulto. Questo protocollo produce un risultato coerente per la cultura di cardiomiociti adulti funzionali da una varietà di topi geneticamente modificati.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per l'isolamento riproducibile e la coltura a lungo termine di cardiomiociti di topo adulto con alta resa, purezza e vitalità.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

Metodi per l&#39;isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

L'obiettivo generale di questo articolo è quello di standardizzare il protocollo per l'isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache (CSCs) dal cuore di topo adulto. Qui, descriviamo un metodo di centrifugazione su gradiente di densità per isolare murino CSCs e metodi elaborati per la cultura, la proliferazione e la differenziazione in cardiomiociti di CSC.

Isolamento, caratterizzazione e differenziamento di cellule staminali cardiache dal cuore di topo adulto

Questo protocollo viene utilizzato per isolare i cardiomiociti atriale singoli dal cuore adulto del topo utilizzando un approccio di digestione a blocchi. Questo approccio viene utilizzato per isolare i miociti atriale destro o sinistro che possono essere utilizzati per caratterizzare l'elettrofisiologia dei miociti atriale negli studi patch-clamp.

Isolamento dei miociti atriale dai topi adulti

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento, la trasfezione e la cultura a lungo termine dei cardiomiociti adulti di topi e ratti.

Isolamento, trasfezione e cultura a lungo termine di cardiomiociti per topi e ratti adulti

Un metodo è descritto per l'isolamento simultaneo di miociti e non miociti sia dagli atri che dai ventricoli di un singolo cuore adulto di topo. Questo protocollo si traduce in rese costanti di miociti cardiaci altamente vitali e non miociti e descrive in dettaglio le condizioni ottimali di coltura specifica delle cellule per la fenotipizzazione e l'analisi in vitro.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

Impara l'isolamento di cardiomiociti da topo adulto mediante perfusione Langendorff per studi di biologia cardiovascolare. Questo metodo consente la coltura, la transfezione virale e l'analisi funzionale della contrazione e del calcio.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

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