Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare la coltura e visualizzare la contrazione e la manipolazione del calcio nei cardiomiociti specchio adulti. Ciò si ottiene rimuovendo prima il cuore di muren e mettendolo a temperatura ambiente. PBS, il cuore può essere incannulato nel piatto come mostrato nel cartone animato o direttamente sull'ago attaccato al sistema di perfusione, come nel film.

Il terzo passo consiste nel lavare e digerire il cuore pompando perfusione, tampone e quindi tampone enzimatico attraverso il sistema. Il passaggio finale consiste nel tagliare i ventricoli in una capsula di tampone di trasferimento e tritare delicatamente il tessuto con una pinza. In definitiva, i risultati possono mostrare la contrazione delle singole cellule cardiomiocitarie e la manipolazione del calcio attraverso misurazioni della lunghezza dell'intera cellula e/o del sarcomero e la metrica del rapporto.

Indicatori di calcio come RO 2:00 AM con il sistema ottico ionico. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché può essere difficile appendere rapidamente il cuore attraverso l'aorta senza danneggiare il vaso o il cuore stesso. Iniettare topi adulti a circa 12 settimane di età con 150 USP di eparina sodica nello spazio addominale.

Se il topo è disidratato, iniettare un cc di soluzione salina. Anestetizzare il topo con un'iniezione di ketamina e xilazina a una dose dipendente dal peso, i topi vengono controllati per assicurarsi che siano profondamente anestetizzati attraverso la perdita del riflesso di pizzicamento delle dita degli arti posteriori e il rallentamento della frequenza respiratoria. Fissare il mouse sedato al pad operatorio, quindi asportare il cuore e metterlo in una capsula di soluzione fisiologica.

Utilizzando gli occhiali da dissezione opti vision, identificare ed esporre l'aorta. La rimozione del tessuto intorno all'aorta non è necessaria per l'isolamento cellulare. Finché la radice aortica è chiaramente visibile, adescare la pompa con un tampone di perfusione.

Iniziare a pompare ad alta velocità per riempire le linee e verificare l'assenza di bolle. Quindi pompare a bassa velocità per impostare la velocità di flusso per la perfusione cardiaca. Utilizzare un bagnomaria di ricircolo per mantenere la temperatura del tampone di perfusione a 37 gradi Celsius.

Usa una pinza da micro dissezione per posizionare l'aorta sull'ago come un calzino. Assicurarsi che l'estremità dell'ago poggi nell'aorta ascendente, idealmente nella radice aortica distale all'interno destro. Quindi, fissa il cuore all'ago legando una lunghezza di 10 centimetri di seta da sutura attorno alla parte superiore dell'aorta.

Assicurarsi che la cravatta sia a livello dell'aorta ascendente sotto l'arteria anonima destra, ma anche sopra l'estremità dell'ago e sopra la valvola aortica. Ora abbassa il cuore all'interno della conica. Questo aiuta a mantenere la temperatura ambiente.

Perfondere il cuore con un tampone di perfusione per cinque minuti a una velocità di un millilitro al minuto e cla il deflusso della camera di vetro per consentire all'otto PERFU di raccogliersi nel vetro conico e avvolgere il cuore. A questo punto, dovresti vedere aumentare il volume del cuore. Inoltre, il sangue nel tessuto cardiaco sarà sostituito dal tessuto che causa l'otto PERFU. Palor.

Arrestare la pompa per spostare il tubo dal contenitore del tampone di perfusione al contenitore del tampone enzimatico. Rilasciare la fascetta di deflusso per svuotare il PERFU eight. Riavviare la pompa per iniziare a perfondere il cuore.

Con il tampone enzimatico a un millilitro al minuto, bloccare nuovamente il deflusso per consentire al tampone enzimatico di avvolgere il cuore. Qui. Mentre l'enzima perfonde il cuore e digerisce il tessuto connettivo, il cuore diventerà pallido e l'integrità strutturale diminuirà. Per i principianti, è utile collegare la linea di perfusione con un manometro.

Il manometro può essere utilizzato anche per garantire che la posizione dell'ago sia sopra la valvola aortica e non nel ventricolo. Una bassa pressione indica che l'ago si trova nella camera ventricolare e un'alta pressione indica che l'ago tocca la valvola. Quando il cuore viene digerito, la pressione diminuirà rapidamente poiché il tessuto connettivo non mantiene la resistenza.

Per determinare quando tagliare i ventricoli dal cuore digerito, sollevare il cuore dal bicchiere conico, spremere delicatamente il cuore con una pinza e raccogliere alcune gocce di PERFU otto in una piccola capsula di Petri per controllare. Se le singole cellule cadono in 8-10 minuti, la pressione ventricolare sarà diminuita e dovresti essere in grado di vedere le singole cellule entrare nel Perfù. Otto quando uno dei due viene visto per la prima volta, tagliare i ventricoli dal cuore in un piatto pieno di transfer, tampone A per una preparazione più uniforme.

Ritaglia e rimuovi il ventricolo destro, lasciando il ventricolo sinistro a tritare e studiare. Se interessato al ventricolo destro, può essere tritato dopo la separazione. Utilizzando una pinza da dissezione micro, tritare ogni ventricolo separatamente, una digestione di successo non lascerà quasi nessun pezzo solido di tessuto dopo la macinazione con la maggior parte del tessuto che diventa amorfo dopo la dissociazione.

Per dissociare ulteriormente il tessuto, farlo passare attraverso una pipetta di plastica da cui è stata tagliata la punta. Con un angolo di 45 gradi, fissare un pezzo di rete quadrata a un piccolo imbuto usando dei morsetti e posizionare questo apparecchio di filtraggio in un tubo da 15 millilitri. Utilizzare la pipetta da pascolo modificata per rimuovere la soluzione cellulare dal piatto e filtrare la soluzione nella provetta da 15 millilitri.

Lascia che le cellule vive si depositino sul fondo della provetta, operazione che richiederà un paio di minuti. Dividendo il volume in due tubi si ottiene una resa più veloce. Pellettatura dopo Ali.

Citando 2,5 millilitri di ciascuna delle quattro soluzioni di calcio in quattro provette separate da 15 millilitri. Utilizzare la pipetta standard per trasferire con cura il pellet di cellule stabilizzato nella prima delle soluzioni di calcio. Lasciare che le cellule si depositino sul fondo della provetta e ripetere il processo.

Trasferimento delle cellule sedimentate attraverso ciascuna delle soluzioni di calcio. Quando le cellule vengono trasferite nella quarta soluzione di calcio, tappare la provetta e girarla su un lato. Alimentare il sistema MM SIS assicurandosi che la lampada ad arco venga avviata per prima.

Quindi adescare il sistema con tampone di calcio B.Collegare i tubi dalla pompa all'ingresso e alle uscite appropriati della camera cis MM. Fissare un vetrino di vetro di dimensioni adeguate, in genere 20 x 25 millimetri nella camera. Trasferire 500 microlitri della soluzione cellulare in una piccola provetta a forma di orph.

Aggiungere 0,5 microlitri di PHE 2:00 AM alle cellule e lasciarle incubare al buio a temperatura ambiente per cinque-sette minuti dopo aver oscurato la stanza. Ora inizia con attenzione a far fluire il tampone di calcio B attraverso la camera. Una volta che il flusso è stato avviato e non prima, iniziare ad aumentare la temperatura della camera a 37 gradi Celsius.

Utilizzare una pipetta modificata per caricare una o due gocce di soluzione cellulare sul vetrino coprioggetti, a seconda della concentrazione delle cellule, e lasciare che le cellule si depositino. La densità delle cellule nella camera. Dovrebbe essere tale che le singole celle non sovrapposte possano essere facilmente inserite nella piattaforma di acquisizione dati sys.

Assicurati che la camera sia collegata al myo Pacer tramite i cavi di collegamento e inizia a impostare la tensione e la frequenza per l'esperimento. Scegli una cella che batte alla frequenza corretta e spostala nell'apertura dell'inquadratura. Regola le dimensioni della fotocamera e dell'apertura dell'inquadratura in modo che l'intera cella sia al centro della finestra diretta orizzontalmente con gli specchi sarco evidenti.

Successivamente, posiziona la scatola in un'area della cella contenente sarcomeri ben definiti e regola la messa a fuoco per ottimizzare il picco dello spettro di potenza. Regolare anche la luminosità del microscopio per ottimizzare la finestra di levigatura del blu e le informazioni sul contrasto del nero. Attiva il moltiplicatore di foto e inizia a registrare.

Dopo aver registrato un numero sufficiente di dati, fare clic su Pausa per interrompere temporaneamente la registrazione. Non fare clic su stop. In questo modo la registrazione verrà terminata e non sarà possibile registrare lo sfondo per quella cella.

Ora, senza alterare la messa a fuoco né le dimensioni della finestra di visualizzazione, spostare il tavolino del microscopio in un'area del vetrino coprioggetti in cui non è possibile vedere cellule o materiale cellulare. Quindi fare clic su riprendi per registrare una misurazione in background. Dopo aver registrato una quantità sufficiente di sfondo, fare clic su Interrompi per terminare la registrazione.

Quindi fare clic su Salva file per salvare tutte le tracce per quella cellula In un singolo file ZPT, l'isolamento dei cardiomiociti adulti si traduce in cellule striate e quiescenti a forma di bastoncino che non battono spontaneamente la punta della freccia mostra cellule morte arrotondate senza striature. Le cellule quiescenti possono essere coltivate e trasfettate con adenovirus per manipolare l'espressione genica. Dopo 24 ore di coltura, la morfologia delle cellule vive non cambia.

Sono ancora tolleranti al calcio e possono essere stimolati dalla stimolazione del campo. È possibile ottenere una resa dell'85-90% di cellule vitali. Il sistema MM SIS è stato utilizzato per misurare la contrattilità e il transitorio del calcio dei miociti prelevati da un topo nero di tipo C 57 selvatico. Simultaneamente.

La misurazione della contrattilità e della manipolazione del calcio è stata effettuata misurando il rapporto tra le forme legate e quelle non legate di fira 2:00 AM Le misurazioni del rapporto possono variare leggermente tra le configurazioni, ma le cellule sane di solito ottengono un punteggio compreso tra 1,5 e 2,5. Al fine di analizzare i dati delle tracce di contrattilità e calcio, le tracce sono state mediate per creare una traccia caratteristica per ogni cellula. Utilizzando un algoritmo di analisi dei dati monotransitori trovato nel software sys, i parametri per la funzione sistolica e diastolica sono stati generati dalle tracce caratteristiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i singoli cardiomiociti marini adulti.