Name: Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Scopri come coltivare batteri in protozoi per infettare cellule di mammifero. Questo metodo quantifica la crescita intracellulare di Legionella mala usando marcatori fluorescenti e citometria a flusso.

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Ringraziamo il Dott. Craig Roy e il Dr. Dario Zamboni per fornire un modello per le infezioni delle cellule protozoi. Ringraziamo il Dott. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, il Dr. Fred Heffron e Todd Wisner per le attrezzature e reagenti, il dottor Lulu Cambronne per la revisione critica del manoscritto. La citometria a flusso è stata eseguita presso l&#39;impianto di flusso di risorse OHSU Citometria condivisa. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione della Fondazione per la Ricerca Medica dell&#39;Oregon e una sovvenzione del NIH R21 AI088275 (EDC).

1. Preparazione di Legionella pneumophila Culture per le infezioni della fase di priming <ol><li> Trasforma tutti L. ceppi pneumophila usare nel saggio con le plasmide pAM239, codificante un isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) inducibile proteina fluorescente verde (GFP) 28. Streak i ceppi batterici sul ferro e cisteina integrato N-(2-acetammido)-2-acido aminoethanesulfonic (ACES) tamponata agar carbone estratto di lievito (CYEA) contenente 6,25 mg / ml di cloramfenicolo (CM) (per manutenzione plasmide) e incubare per 72 hr a 37 ° C. </li><li> Trasferire un inoculo del ceppo batterico in ACES integrate tamponato estratto di brodo di lievito (AYE) con 6,25 mg / ml CM e 1 mM IPTG e coltivare di fase stazionaria (O / N) su un agitatore orbitale a 37 ° C. </li><li> Confermare espressione GFP in colture in vitro utilizzando la microscopia a fluorescenza. Trasferire 10 microlitri di cultura su un vetrino sotto una coperturaslip e immagine utilizzando un obiettivo 60X con eccitazione GFP / cubo di emissione (AMG EVOS fl). </li><li> Diluire un&#39;aliquota di 100 ml di ciascuna coltura in vitro a 1:10 con sterile H 2 O. Fai il bianco con 100 pl AYE supporti con 1 mM IPTG e 6,25 mg / cm ml e acqua. OD600 prendere misure delle diluizioni utilizzando uno spettrofotometro (Bio-Rad intelligente Spec Plus). Calcolare il volume necessario per infettare un pozzo ad una MOI = 20 per ciascuna coltura in vitro: V = [(ameba seeded) x MOI] / [OD 600 x (fattore di diluizione) x (costante)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Concentrazione di batteri viene determinato come OD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 UFC / ml. </li></ol> 2. Adescamento infezione stage utilizzando Acanthamoeba castellanii <ol><li> Mantenere e coltivare le amebe in ATCC 712 medie PYG in 175 cm 2 flaconi a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire media in cul amebeture 24 ore prima di iniziare le colture batteriche liquidi. Lo stesso giorno liquido colture batteriche sono avviati, raccogliere e contare le cellule su un microscopio ottico utilizzando un emocitometro. </li><li> Diluire il amebe con mezzi freschi ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml. Seed 12 e piastre di coltura cellulare con aliquote da 1 ml di amebe con un pipettatore a ripetizione ed incubare a RT O / N. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare i pozzetti delle piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti 3x con 1 ml di PBS sterile utilizzando una pipetta 10 ml sierologica e un aiuto pipetta manuale. </li><li> Dopo l&#39;aspirazione di PBS, aggiungere 1 ml di infezione supporti (ATCC 712 supporti PYG meno glucosio, peptone, estratto di lievito e) con IPTG 1 mM e 6,25 mcg / ml cm a ciascun pozzetto. Incubare le piastre a RT per 1 ora. </li><li> Infettare pozzetti ad una MOI = 20. Centrifugare la piastra a 400 xg per 5 min (Eppendorf 5810R) e galleggiare in un bagno di acqua 37 ° C per 5 min. Trasferire la piastra ad un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 18 ore. </li><li> Confermare le infezioni utilizzando l&#39;imaging dal vivo cella di un microscopio a fluorescenza prima di ospitare la lisi cellulare e la raccolta di batteri. </li></ol> 3. Semina cellule THP-1 per l&#39;infezione fase cella obiettivo <ol><li> (Inizia questo processo 24 ore prima di impostare liquidi colture batteriche). Coltivare cellule THP-1 in un cm 75 due fiasche per colture a quasi confluenza in RPMI 1640 con 10% di siero siero fetale bovino (FBS). </li><li> Contare le cellule in sospensione utilizzando un emocitometro, diluire le cellule THP-1 in RPMI 1640 con 10% di FBS e 100 ng / ml forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml , e la piastra in aliquote da 1 ml su piastre di coltura cellulare da 12 pozzetti. Incubare le piastre per 48 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 4. Lavorazione dei batteri per infezione fase cella obiettivo dopo l&#39;infezione stage adescamento <ol><li> Aspirare il supporto dal amebe innescato. </li><li> Lyse l&#39;unamoebae utilizzando 500 pl di ghiaccio freddo, sterile ultra-filtrata (UF) H 2 O ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Pool I lisati secondo ceppo e prendere una misura E 512 nm per ciascuno dei lisati aggregati utilizzando un lettore di piastra di fluorescenza (Molecular Devices Spectramax Gemini EM). </li><li> Calcolare un misura 600 DO per tutti i lisati pool: calcOD 600 = 0,0008 (E 512 - sfondo lisato) + 0,0019. La formula è stata precedentemente determinate dal grafico di un confronto diretto sia la DO 600 e la E 512 nm misure di diluizioni di L. pneumophila GFP di tipo esprimendo fase stazionaria da coltura in vitro (Figura 1 *). I lisati di ameba non infetto, alle stesse condizioni sperimentali l&#39;ameba infetta, sono usati come bianco e fornito un valore di correzione (lisato es sfondo), che è stato accolto nell&#39;equazione. La t volume necessarioo infettare un pozzo ad una MOI = 20 viene calcolato per ciascun pool lisato: V = [(THP-1 seminate) x MOI] / [calcOD 600 x (costante)] = [(1 x 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20/600 calcOD. </li><li> Lavare le cellule THP-1 3x con PBS e aggiungere 1 ml fresco RPMI 1640 (10% FBS) in ciascun pozzetto. Incubare le cellule THP-1 per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Infettare le cellule THP-1 al MOI calcolato utilizzando i lisati pool. Permettono una serie di pozzi di rimanere non infetto, serve come controllo negativo per l&#39;analisi citofluorimetrica. Elaborazione dello stadio primer deve essere completato in meno di 30 minuti. I lisati sono tenuti su ghiaccio per limitare eventuali cambiamenti nell&#39;espressione genica batterica prima dell&#39;infezione. </li><li> Centrifugare la piastra, galleggiare per aumentare la temperatura, e incubare come nella fase di adescamento. </li><li> Un&#39;ora dopo l&#39;infezione, rimuovere il supporto mediante aspirazione e lavare i pozzetti 3 volte con PBS per rimuovere i batteri extracellulari. </li><li> Aggiungere 1 ml di fresh RPMI 1640 (10% FBS) ai pozzetti e restituire la piastra al incubatore. Il tempo subito dopo la sostituzione dei supporti serve come tempo zero (T 0). Incubare le cellule THP-1 per 14-16 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li></ol> 5. Analisi sperimentale 5,1 imaging cellulare in diretta Immagine i pozzetti infetti utilizzando un microscopio a fluorescenza (AMG EVOS fl) a 10X o 20X di ingrandimento (Figure 1A-D). Le immagini possono essere confrontati qualitativa o quantitativa per determinare i livelli di infezione sia in fase di innesco e di destinazione infezioni stadio cellulari. 5,2 Citometria a flusso <ol><li> I picchi di emissione di diverse infezioni possono essere confrontati mediante citometria a flusso (BD FACS Calibur). Tripsinizzare gli infetti cellule THP-1 e delicatamente di lavaggio dai pozzetti mescolando in PBS con una pipetta. </li><li> Piscina le cellule tipo versare in 15 ml Falcon tubi e pellet a 1.800 xg per 2min nella centrifuga piano del tavolo. </li><li> Sospendere il pellet in 1 ml di PBS e trasferire ai tubi microcentrifuga da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare le sospensioni a 1.800 x g (Eppendorf 5424) e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. Se le sospensioni risultanti sono altamente torbidi (OD 600 ≥ 1,0) devono essere diluiti in PBS supplementare (1:3) per impedire l&#39;intasamento delle linee del citofluorimetro. </li><li> Utilizzare sterile filtrata PBS per l&#39;equilibramento della citometria a flusso e per le fasi di lavaggio tra le iniezioni del campione. Tracciare l&#39;avanti / lato dispersione di cellule bersaglio infettate prima iniezione di campioni di cellule bersaglio di infezione. </li><li> Raccogliere 20.000 eventi totali per ogni condizione con 488 nm di eccitazione laser e il canale FL1. </li><li> Porta post-acquisizione popolazioni cellulari di escludere le cellule non infette e l&#39;intensità trama fluorescenza in un istogramma (FlowJo) (Figura 1E). </li></ol> 5,3 CFU placcatura <ol><li> Esaminare l&#39;efficienza of infezione mediante placcatura CFU delle cellule raccolte per citometria a flusso. Preparare diluizioni seriali dei campioni in ultra-filtrata H 2 O a 10 -1, 10 -2 e 10 -3. </li><li> Piastra 20 pl di ciascuna diluizione su 1/3 di una piastra CYEA con 6,25 mg / ml CM. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C per 72 ore. </li><li> Contare le colonie con uno stuzzicadenti e contatore di cellule. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Espressione genica batterico è strettamente controllata mediante una combinazione di progressione del ciclo di vita e di risposta ai segnali nel microambiente circostante. Vacuolare patogeni come L. pneumophila rispondere a una moltitudine di cellula ospite derivati ​​spunti quando compartimenti stagni in un phagosome. Come risultato collettivo di esaurimento nutrienti nella cellula ospite, il batterio compensa esprimendo fattori richiesti per diffusione successo ad una cellula ospite successivo 25. ...

Numerosi batteri patogeni si sono adattati strategie generalizzate per sfruttare cellule ospiti per la sopravvivenza e la replicazione in un compartimento intracellulare. In molti casi, i meccanismi patogenetici sono simili tra protozoi e metazoi le cellule. Tuttavia, questi due microambienti sono molto diversi e possono provocare un&#39;espressione differenziale di fattori di virulenza 1-4. Il batterio della malattia del legionario &#39;Legionella pneumophila è ubiquitariamente associati agli ambienti d&#39;acqua dolce in tutto il mondo 5. È importante sottolineare che, L. pneumophila coltivato in cellule protozoarie prima infezione dei monociti umani acquisire un vantaggio patogeno, suggerendo che globali profili di espressione genica del batterio uscita una cella protozoo sono diverse da quella del coltivati ​​in vitro dell&#39;organismo 6-8. In natura, amebe acqua dolce forniscono nutrienti confini ricchi per l&#39;amplificazione rapida di un batterio invasore. Acquisizione umana della L. pneumophila è spesso attribuita a inalazione di goccioline di acqua contaminata che contengono il batterio. È probabile che queste goccioline porto protozoi cellula batteri associati; dove cellule protozoarie sono più resistenti alle pratiche convenzionali di trattamento delle acque 9,10. Infezione di macrofagi alveolari polmonari procede in modo quasi identico al ciclo di vita del batterio intracellulare in cellule ospiti protozoi 11-13. Per sopravvivere e replicarsi in cellule eucariotiche, L. pneumophila utilizza uno speciale sistema di secrezione di tipo IV ter chiamato Dot / Icm per fornire circa 300 &quot;effettrici&quot; proteine ​​nel citosol della cellula ospite 14-16. Queste proteine ​​effettrici collettivamente funzionamento per sovvertire processi cellulari per generare un vano permissive per la replicazione del batterio 17,18. Delezioni in qualsiasi dei 26 geni che costituiscono il Dot / Icm risultato trasportatore in ceppi difettosi per mult intracellulareiplication 19-23. Storicamente, cancellazione di singoli geni codificanti effettori raramente portato in ceppi attenuati di crescita intracellulare. Questo fenomeno è stato attribuito a diverse ipotesi tra cui la funzione ridondante e copie paralogous di effettori. Alcuni fattori di virulenza sono espressi solo nel contesto della cellula ospite associata crescita intracellulare 24. Abbiamo razionalizzato che se un effettore particolare è stato espresso soltanto nel contesto di infezione protozoo, quindi il contributo del effector non può essere confrontato con un ceppo selvatico quando entrambi sono stati coltivati ​​in vitro. L. pneumophila transizioni da un replicativa a una fase trasmissivo, che entra nella fase stazionaria cultura 25. Il fenotipo di commutazione fase rappresenta l&#39;esaurimento degli elementi nutritivi incontrato durante la crescita intracellulare ed è esemplificata attraverso il montaggio di flagelli per la motilità 26. Perché L. pneumophila è più invaSIVE e virulenta quando raccolto da cellule protozoi, abbiamo cercato di sviluppare un metodo che più fedelmente rappresentato lo stato patogeno del batterio quando ha incontrato macrofagi host. A tal fine, abbiamo sviluppato un saggio di adescamento protozoo versatile in grado di ospitare qualsiasi host adatto sia per i primi (cella priming) e la seconda (cella di destinazione) infezioni stadio. Il processo di infezione è trattabile mediante uso di batteri che esprimono stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP). Il modello di infezione per il protozoo Acanthamoeba castellanii segue una metodologia ampiamente usato nel campo 27. Per la fase di caricamento, L. ceppi pneumophila sono coltivati ​​in vitro alla fase stazionaria in mezzi liquidi per produrre etichettati &#39;trasmissive&#39; batteri (Figura 1A). I batteri vengono quindi utilizzati per infettare monostrati di A. castellanii per 18 ore per ottenere una fase avanzata del ciclo di vita intracellulare. Vacuoli di grandi dimensioni contengonobatteri zione può essere visualizzata a questo punto di tempo utilizzando microscopia a fluorescenza (Figura 1A). Protozoi cellule vengono lisate e batteri recuperati dal lisato sono misurati per l&#39;emissione a 512 nm usando un lettore di fluorescenza piastra. Fluorescenza è correlata con la densità ottica per calcolare molteplicità d&#39;infezione (MOI) per l&#39;infezione di cellule bersaglio (Figura 1, Correlazione * Curve). Dopo ore invasione (T 0) e 18 post-invasione (T 18), le cellule bersaglio sono quantificati per la fluorescenza, che rappresenta i batteri intracellulari. Fluorescenza può essere monitorato mediante microscopia e citometria a flusso, e la conta può essere misurata mediante placcatura colonia. Il test di adescamento è sempre accompagnato da infezioni da wild-type L. pneumophila e un ceppo difettosa in Dot / Icm sistema secrezione di tipo IV (Δ DOTA) (Figura 1A). Ciò fornisce soprattutto controlli interni per i confronti diretti tra wild-type di unnd eventuali ceppi mutanti isogenici utilizzati nel processo di infezione. L&#39;inclusione del ceppo virulento Δ DOTA durante la fase di adescamento imposta una soglia per l&#39;osservazione della crescita attenuati fenotipi associati isogeniche ceppi mutanti che sono coltivate in vitro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma</td><td>A9758-1KG</td><td>media</td></tr><tr><td>ATCC medium: 712 PYG</td><td>ATCC</td><td></td><td>growth medium for protozoans</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td> carbone <td>salino tamponato con fosfato</td></tr> al carbone <tr><td>attivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C272-212</td><td>componente del terreno</td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>componente del terreno</td></tr><tr><td>peptone</td><td>BD Diagnostics</td><td>211677</td><td>componente del terreno</td></tr><tr><td>agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina, 99%+</td><td>Acros organics</td><td>173601000</td><td>integratore di terreni</td></tr><tr><td>nitrato ferrico nonaidrato</td><td>Fisher Scientific</td><td>I110-100</td><td>media supplement<</td></tr><tr>td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EVOS fl</td><td>AMG</td><td>EVOS fl</td><td>microscopio a fluorescenza</td></tr><tr><td>Smart Spec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>spettrofotometro</td></tr><tr><td>5810 R centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22627023</td><td>centrifuga da banco</td></tr><tr><td>Repeater plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>22230201 pipetta ripetuta</td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>lettore di micropiastre</td></tr><tr><td>Softmax Pro 5.3</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td>software per lettore di micropiastre</td></tr><tr><td>5424 microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td>da tavolo microcentrifuga</td></tr><tr><td>Pompa per pipette a rilascio rapido II</td><td>Scienceware</td><td>379111010</td><td>pipetta</td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>citometro</td></tr><tr><td>a flusso FlowJo 7.6.1</td><td>FlowJo</td> software <td>per citometria a flusso</td><td>con licenza</td></tr> da <tr><td>15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>tubo conico in polipropilene tubo da</td></tr><tr><td>1,6 ml</td><td>Neptune</td><td>3745.X</td><td>Provette per microcentrifuga</td></tr></tbody></table>

trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Molti batteri patogeni intracellulari utilizzare protozoi d&#39;acqua dolce come un serbatoio naturale per la proliferazione nell&#39;ambiente. Legionella pneumophila, l&#39;agente eziologico della legionario &#39;polmonite, guadagna un vantaggio su di batteri patogeni in vitro in coltura al momento della prima raccolti da cellule protozoi prima infezione di macrofagi mammiferi. Questo suggerisce che i fattori di virulenza importanti non possono essere adeguatamente espresse in vitro. Abbiamo sviluppato un sistema per l&#39;adescamento trattabile L. pneumophila attraverso il suo naturale ospite protozoo Acanthamoeba castellanii prima dell&#39;infezione cellula di mammifero. Il contributo di ogni fattore di virulenza può essere esaminata confrontando la crescita intracellulare di un ceppo mutante di wild-type batteri dopo aver riempito protozoo. GFP che esprimono L. wild-type e mutante ceppi pneumophila sono utilizzati per infettare monostrati protozoi in fase di caricamento, e ha permesso di raggiungere ultime fasi della crescita intracellulare. Batteri fluorescenti vengono quindi raccolte da queste cellule infette e normalizzati per spettrofotometria per generare numeri comparabili di batteri per una successiva infezione in macrofagi mammiferi. Per la quantificazione, batteri vivi sono monitorati dopo l&#39;infezione usando la microscopia a fluorescenza, citometria a flusso, e mediante placcatura colonia. Questa tecnica mette in evidenza e si avvale del contributo della cellula ospite-dipendente l&#39;espressione del gene imitando l&#39;ambiente che si può incontrare in un percorso di acquisizione naturale. Questo approccio può essere modificato per ospitare qualsiasi batterio che utilizza un host intermediario come un mezzo per ottenere un vantaggio patogeno.

Un risultato tipico per l&#39;intero processo di infezione è descritto nella Figura 1. Vivo delle cellule al microscopio a fluorescenza che raffigurano monostrati di A.castellanii infettati con wild-type L. pneumophila durante la fase di adescamento è mostrato nella Figura 1A. Una misura di successo della fase di caricamento porterebbe ad una popolazione di circa il 90% delle cellule ospiti contenenti grandi vacuoli popolate con batteri GFP etichettati in questo MOI. A...

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e quantificare batteri fluorescenti tracciabili da un ospite intermedio, al fine di infettare successivamente cellule di ospiti mammiferi. In questo caso, Legionella mala esprimente GFP viene utilizzata per infettare il protozoo ospite naturale Acanthamoeba castellani in colture monolayer. I batteri vengono quindi raccolti mediante lisi selettiva e la concentrazione batterica viene calcolata usando una formula basata sulla diluizione dell'emissione fluorescente del protozoo.I batteri precondizionati vengono quindi utilizzati per infettare monocapate di cellule mammifere. Infine, il numero di batteri infettivi all'interno delle cellule mammifere viene determinato mediante una combinazione di microscopia a fluorescenza, citometria a flusso e piastatura di lisati per recuperare le unità formanti colonie. I dati ottenuti dimostrano un vantaggio patogenico acquisito dai batteri coltivati nelle cellule protozoarie nella fase di precondizionamento, rispetto allo stesso ceppo coltivato in mezzo artificiale.Abbiamo sviluppato questa tecnica osservando che l'espressione di particolari fattori di virulenza nei batteri non poteva essere indotta esclusivamente mediante coltura in vitro. I modelli di infezione tipici basati su monocapati cellulari coltivati utilizzano batteri coltivati in vitro per legionella e diversi altri batteri. I proteasomi costituiscono una riserva naturale per la proliferazione, all'interno della quale i batteri acquisiscono un vantaggio patogenico.La tecnica che descriveremo permette la quantificazione di batteri proteasoma prime al fine di misurare con precisione il contributo di un fattore di virulenza prodotto esclusivamente nel contesto della crescita intracellulare. A illustrare il procedimento sarà Bendon, assistente di ricerca, Sam Renan, anch'egli assistente di ricerca, e Amri Lama, ricercatore post-dottorato. Iniziare la procedura utilizzando l'elettroporazione per trasformare tutte le ceppi di L. pneumophila impiegati nel saggio con il plasmide PAM 2 39, che codifica per la GFP inducibile da IPTG. Incubare i batteri per tre ore in agitazione a 37 gradi. Utilizzando un’applicatore, seminare i batteri provenienti da ciascuna trasformazione su una singola piastra e incubare per 72 ore a 37 gradi Celsius.Dopo tre giorni, trasferire una singola colonia del ceppo batterico in tre millilitri di terreno contenente un millimolare di IPTG e coltivare per tutta la notte fino alla fase stazionaria su un agitatore orbitale a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire 10 microlitri della coltura su un vetrino e applicare un coprioggetti. Quindi osservare il vetrino al microscopio per confermare l'espressione di GFP.Utilizzando un obiettivo 60x con i filtri di eccitazione ed emissione appropriati, dovrebbero essere visibili numerosi bacilli batterici che appaiono di un verde fluorescente puro quando osservati attraverso il canale GFP del microscopio. Se tutti i batteri sono fluorescenti, procedere all'infezione dell'amoebo diluendo un'aliquote di 100 microlitri di ciascun cultivo in vitro in un rapporto da uno a dieci in H2O sterile. Preparare un bianco utilizzando 100 microlitri di mezzo A YE contenente un millimolare di IPTG, 6,25 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e 900 microlitri di acqua. Successivamente, effettuare le misurazioni dell'OD a 600 nm della diluizione mediante spettrofotometro, utilizzando la formula fornita nel documento allegato.Calcolare il volume necessario per infettare una pozzetta a una molteplicità di infezione o MOI di 20 per ciascuna coltura in vitro. 24 ore prima di iniziare le colture batteriche liquide, sostituire il mezzo nelle colture di acan MEbA castellani ABI. Il giorno successivo, raccogliere e contare le cellule utilizzando un emocitometro.Per fare ciò, staccare le cellule battendo sul flask e trasferire un campione in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, mescolare un’aliquota con il colorante trian blu e caricarla sulla lamellina del citometro ematico. Dopo aver contato le cellule al microscopio ottico, diluire l’ambiente con mezzo fresco fino a una concentrazione finale di uno per dieci alla sesta cellule per millilitro, utilizzando una pipetta ripetibile per la semina.Piastre per coltura cellulare da 12 pozzetti con aliquote da un millilitro di ABI incubate a temperatura ambiente durante la notte. L'aspetto più difficile di questa procedura è l'infezione robusta durante il passaggio di priming. Per facilitare questo passaggio, utilizziamo una pipetta manuale durante il lavaggio delle amebe per prevenire perdite.Gli amebo non sono particolarmente aderenti e possono essere facilmente persi o rimossi durante i passaggi di lavaggio o di sostituzione del mezzo. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta siringa da 10 millilitri e un ausilio manuale per pipetta per lavare tre volte le pozzette delle piastre per colture cellulari a 12 pozzette con un millilitro di PBS sterile. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere un millilitro di mezzo di infezione a ciascuna pozzetta.Quindi incubare le piastre a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, infettare ciascun pozzetto con un MOI di 20 aggiungendo la sospensione batterica al mezzo di infezione in ogni pozzetto; centrifugare la piastra a 400 × g per cinque minuti. Al termine della centrifugazione, porre la piastra in un bagno termico a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C con 5% di anidride carbonica per 18 ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare un microscopio a fluorescenza per confermare l'infezione dopo un passaggio di priming riuscito. Il 90% delle cellule ospiti dovrebbe contenere grandi VAE popolate da batteri esprimenti GFP, che appaiono come mezze lune verdi, come mostrato in queste immagini sovrapposte di contrasto di fase e fluorescenza.In questo momento, la maggior parte delle cellule a castin contiene il carico massimo di batteri, ma la lisi della popolazione è minima. All'esame microscopico con luce visibile, gli amobi devono apparire arrotondati e staccati. Una mutante priva della capacità di sostenere il trasloco mediato dal complesso ICM di effettori non dovrebbe svilupparsi in a castin.Pertanto, dovrebbe essere rilevata una fluorescenza minima. Gli amobi appariranno piatti e il monostrato dovrebbe essere integro. Le cellule di leucemia monocitica acuta umana o cellule THP-1, che fungono da cellule bersaglio, devono essere state preparate su una piastra a 12 pozzetti come descritto nel documento allegato.Lavare le cellule THP-1 tre volte con PBS. Quindi aggiungere un millilitro di RPMI 1640 fresco con FBS al 10% in ogni pozzetto e incubare le cellule THP-1 per un'ora a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Per preparare il lisato batterico, aspirare il mezzo da prime a Tobi.Successivamente, per lisare i campioni, aggiungere 500 microlitri di acqua sterile, ultrafiltrata e fredda di ghiaccio e mettere in ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, prelevare i lisati in base al ceppo. Versare in provette coniche da 15 millilitri per determinare la fluorescenza totale.Misurare l'emissione a 512 nanometri per ciascun lisato raccolto. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti in un lettore di piastre a fluorescenza, calcolare una misura di OD 600 per i lisati raccolti in base alla formula. Nel documento allegato, utilizzare i lisati di ameba non infette sottoposte alle stesse condizioni sperimentali di quelle infette per determinare il fondo del lisato.Quindi, per ogni pool di lisati, calcolare il volume necessario per infettare una pozzetta di cellule bersaglio a un MOI di 20. Mantenere i lisati sul ghiaccio per limitare eventuali variazioni nell'espressione genica batterica. Prima dell'infezione, entro 30 minuti dalla lisi, infettare tre pozzette di cellule TP una per ogni condizione al MOI calcolato.L'utilizzo dei lisati combinati permette di mantenere un set di pozzetti non infetti, che fungono da controllo negativo. Per l'analisi citofluorimetrica, centrifugare la piastra a 400 ×g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, lasciare il piatto galleggiare in un bagno termostatico a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Trasferire il piatto in un incubatore con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora, un'ora dopo l'infezione. Aspirare il mezzo e lavare le pozzette tre volte.Con PBS, aggiungere un millilitro di RPMI 1640 fresco contenente il 10% di FBS nei pozzetti e reinserire la piastra nell'incubatore. Incubare le cellule TP one per 14-16 ore per determinare i livelli di infezione sia nelle fasi di priming che di infezione delle cellule bersaglio. Acquisire le immagini dei pozzetti infetti mediante microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 10 x o 20 x.Quindi, per quantificare l'infezione delle cellule bersaglio mediante citometria a flusso, trattare gli occhi con tripsina, raccogliere le cellule THP-1 infette e lavarle delicatamente dai pozzetti mediante aggiunta di PBS. Con una pipetta, raccogliere le cellule in provette microcentrifuga da 1,5 millilitro e quindi centrifugare a 1.800 ×g per due minuti. Dopo la centrifugazione, risospendere i pellet in un millilitro di PBS e centrifugare nuovamente a 1.800 ×g. Se, dopo aver risospeso i pellet in PBS, le sospensioni risultanti sono altamente torbide.Devono essere diluiti da uno a tre in PBS aggiuntivo per prevenire l'occlusione delle linee nel citometro a flusso utilizzando cellule bersaglio non infette; una volta impostato, raccogliere 20.000 eventi totali per ogni campione di infezione cellulare bersaglio mediante eccitazione laser a 488 nanometri e il canale FL1. Dopo aver trasferito i dati su un computer separato per l'analisi con Gait, selezionare le popolazioni cellulari post acquisizione per escludere le cellule non infette e rappresentare l'intensità della fluorescenza in un istogramma come mostrato qui. Esaminare l'efficienza dell'infezione mediante piastratura di UFC delle cellule raccolte per la citometria a flusso. Preparare diluizioni seriali dei campioni in acqua ultrafiltrata da 10 alla meno uno, 10 alla meno due e 10 alla meno tre; piastrare 20 microlitri di ciascuna diluizione su un terzo di una piastra A-C-Y-E-A contenente 6,25 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo.Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 72 ore dopo l'incubazione. Contare le colonie utilizzando uno stuzzicadenti e un contatore cellulare per ottenere una popolazione di batteri sensibilizzati a protozoi. Ceppi wild type di L phis indotti ad esprimere GFP.Sono stati utilizzati per infettare monocapati di castellani per 18 ore a un MOI di 20. I batteri esprimenti GFP sono stati quindi utilizzati per reinfettare amobi in un'infezione allo stadio di cellula bersaglio, al fine di confrontare batteri pre-sensibilizzati da protozoi con batteri coltivati in vitro. I monocapati di castella sono stati incubati.18 ore a un MOI di 10, come si può osservare in queste microfotografie, i batteri potenziati da protozoi presentano un significativo vantaggio patogenico rispetto ai batteri coltivati in vitro allo stesso MOI, al fine di quantificare l'infezione dei macrofagi bersaglio utilizzando batteri provenienti dal proteasoma e batteri potenziati. I macrofagi THP-1 differenziati con PMA sono stati infettati per 14 ore con L. pneumophila di tipo selvaggio, raccolti nella fase di infezione dal proteasoma e di potenziamento. Successivamente è stata eseguita la citometria a flusso per quantificare l'infezione, come mostrato qui.Lo spostamento verso destra della fluorescenza misura il numero totale di cellule infette nella popolazione. L'aumento dell'intensità del segnale fluorescente può essere correlato al numero di batteri per macrofago; la fluorescenza dei macrofagi TP non infetti è mostrata in rosso, mentre la fluorescenza delle cellule infette è mostrata in verde. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa due settimane in totale, se tutto viene eseguito con precisione.Ricordare che, durante questa procedura, è importante non disturbare il proteasoma e il monostrato. L'uso di una pipetta manuale durante i passaggi di lavaggio aiuterà ad aumentare il rendimento delle infezioni sensibilizzate. Non dimenticare che lavorare con Legionella può essere pericoloso.Pertanto, adottare precauzioni come prevenire la produzione di aerosol durante l'esecuzione di questa procedura.

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