Name: In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sullendotelio Attivato durante linfiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Scopri la microscopia intravitale a fluorescenza per visualizzare in tempo reale le interazioni piastrine-neutrofili sull'endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare nei topi vivi. Questo metodo consente di studiare la formazione dei trombi e valutare potenziali interventi farmacologici.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal National Institutes of Health (P30 HL101302 e RO1 HL109439 a JC) e dell&#39;American Heart Association (SDG 5.270.005 a JC). A. Barazia è stato sostenuto da una borsa di formazione T32HL007829 NIH.

1. Preparazione di Microscopio intravitale (Figura 1A) <ol><li> Preparare tampone superfusione (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, e 17 mM NaHCO 3, pH 7,4). </li><li> Attivare un bagnomaria circolatorio per mantenere la temperatura del tampone e termo-controllata coperta a 37 ° C. Aerare tampone con gas di azoto (5% di CO2 equilibrato con azoto). </li><li> Accendere il sistema di microscopio (Sutter Lambda DG-4 ad alta velocità di lunghezza d&#39;onda cambia, postazione computer, microscopio Olympus BX61W, MPC-200 multi-manipolatore, ROE-200 fase, macchina fotografica ad alta velocità, e intensificatore). </li><li> Per il modello di infiammazione vascolare, usare uno specchio dicroico 100%. Di indurre la formazione di trombi da lesioni laser, sostituire uno specchio 100% con uno specchio 50/50% ed attivare un sistema di ablazione laser Micropoint. </li></ol> 2. Preparazione di Muscle Cremaster per microscopia intravitale (Figura 1B) <ol><li> Anestetizzare untopo maschio (6-8 settimane di vita, C57BL / 6) mediante iniezione ip di ketamina (125 mg / kg di peso corporeo (BW)) e xilazina (12,5 mg / kg di peso corporeo). L&#39;Università di cura degli animali e del Comitato Istituzionale Illinois Usa ha approvato tutte le cure degli animali e procedure sperimentali. Per un modello di infiammazione vascolare, iniettare murino TNF-α (0,5 mg in 250 microlitri salina) intrascrotally in un mouse 3 ore prima di imaging (2-2,5 ore prima dell&#39;intervento). </li><li> Posizionare il mouse su una coperta termoregolata a 37 ° C su un vassoio intravitale microscopio. </li><li> Tirare verso l&#39;alto la pelle sulla superficie del collo con pinze e incidere in senso orizzontale la linea mediana della pelle del collo fino a 1 cm con le forbici. </li><li> Aprire delicatamente il muscolo cervicale con le forbici smussate e rimuovere il muscolo che circonda la trachea. </li><li> Incannulare una PE90 tubo nella trachea per eliminare difficoltà di respirazione. </li><li> Rimuovere delicatamente il lato sinistro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dai tessuti circostanti. </li><li> C annutardi un tubo PE10 nella vena giugulare sinistra per l&#39;infusione di anticorpi e anestetici aggiuntivi. </li><li> Estrarre delicatamente e incidere la pelle dello scroto in senso orizzontale. Per mantenere l&#39;integrità del tessuto durante l&#39;esperimento, tampone preriscaldato stato superfuse sul campo chirurgico. </li><li> Premere sul basso addome con una pinza ed estrarre delicatamente un testicolo con l&#39;altra pinza. </li><li> Rimuovere i tessuti circostanti connettivo di tutto il testicolo. </li><li> Incidere il muscolo cremastere verticale e appiattire il muscolo su un vetrino di vetro su un vassoio microscopio intravitale da appuntare la periferia. </li><li> Lasciare 10-20 minuti per il muscolo si stabilizzi prima della raccolta dei dati. Arteriole muscolari Cremaster (per la formazione del trombo) e venule (per infiammazione vascolare) con un diametro di 30-45 micron sono stati scelti per il nostro studio. </li><li> Per mantenere condizioni anestetiche, infondere 30-50 ml dello stesso anestetico circa ogni 30 min attraverso il cannulus giugulare. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Microscopia intravitale per TNF-α indotta infiammazione vascolare <ol><li> Dopo il posizionamento del mouse sul microscopio intravitale, aperto SlideBook software 5.0 e fare clic su &quot;Finestra di messa a fuoco&quot; nella barra dei menu per impostare l&#39;ottica adeguati e oggettivi (60X). </li><li> Infondere Dylight 488-coniugato anti-topo ratto CD42c (0,1 mcg / g BW in 100 microlitri soluzione salina) e Alexa Fluor 647-coniugati ratto anti-topo Gr-1 anticorpi (0,05 mg / g BW in 100 microlitri soluzione salina) attraverso un cannulus giugulare . </li><li> Vai alla barra dei menu, e fare clic su &quot;Cattura immagine&quot; nella barra degli strumenti. </li><li> Un nuovo menu pop-up; In &quot;Image&quot;, selezionare &quot;Bin Factor&quot; come 1x1 e selezionare &quot;640&quot; sulla larghezza e &quot;460&quot; in altezza. </li><li> In &quot;Imposta Filtro&quot;, contrassegnare la casella di controllo per i canali che si desidera esporre e impostare il tempo di esposizione per ogni. Ad esempio, canale aperto: 10 msec, FITC canale: 50 msec, e Cy5 canale: 50 msec. </li><li> Selezionare &quot;Time-Lapse Capture&quot; per regolare il numero di punti di tempo e l&#39;intervallo. For il modello di infiammazione, il numero di punti temporali è impostata 1000-1500 con un intervallo di 200 msec (Tempo totale: 5 min). </li><li> Fare clic su &quot;Test&quot; per vedere un singolo piano dell&#39;immagine al tempo di esposizione specificato per quel canale. Regolare il tempo di esposizione e / o la luce del microscopio fino a quando l&#39;istogramma mostra una distribuzione adeguata intensità (per multi-canale di acquisizione, ripetere questo processo per ogni canale). </li><li> Una volta che tutti i parametri sono impostati (canali, tempi di esposizione, e così via) in &quot;Cattura immagine&quot;, selezionare &quot;Start&quot; per avviare l&#39;acquisizione. </li><li> Monitorare piastrine di laminazione e aderente e neutrofili per 5 minuti nella metà superiore di un venule cremastere infiammata nel modello di infiammazione vascolare. Da otto a dieci venule sono registrati in un topo. </li><li> Le immagini sono state scattate con un ingrandimento totale di 60X (1,0 obiettivo NA acqua ad immersione), dando una dimensione della finestra di 157 micron x 118 micron. </li><li> Al termine dell&#39;esperimento, i topi sono stati sacrificati tramite cervicale dislocation. </li></ol> 4. Analisi dei dati per il modello Infiammazione venulare <ol><li> Aprire SlideBook software 5.0 e fare clic su &quot;Cartella&quot; nella barra dei menu per aprire un file. </li><li> Fare clic sul menu a discesa e selezionate &quot;Apri, FITC, Cy5, ecc&quot; </li><li> Fare clic su &quot;Renormalize (barre rosse e verdi)&quot; e selezionare il canale. Trascinare le barre rosse e verdi a sinistra oa destra per ottimizzare o meno il segnale di fluorescenza. </li><li> Fare clic su &quot;Applica&quot; e &quot;OK&quot; per aggiornare l&#39;immagine. </li><li> Fare clic su &quot;Pulsante Miniatura&quot; per selezionare la visualizzazione corrente come predefinito. </li><li> Gioca immagine Timelapse catturata, e contare neutrofili laminazione e aderente durante il periodo di 5 minuti. </li><li> Per analizzare piastrine formazione di trombi, andare a &quot;Mask&quot; e selezionare &quot;Crea&quot;. </li><li> Il nome di una maschera e marchio &quot;Nell&#39;immagine corrente&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;icona grande matita&quot; in &quot;Tool Marquee&quot; nella vista principale. </li><li> Il colore di una regione al di fuori della nave nella vista principale per impostare una maschera di sfondo. </li><li> Vai to &quot;Maschera&quot;, fare clic su &quot;Copia This Plane&quot;, fare clic su &quot;Copia in maschera timepoint corrente&quot; e selezionare &quot;Tutti i riferimenti temporali&quot;, e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Per calcolare segnale di fondo, andare su &quot;Statistiche&quot; e fare clic su &quot;Statistiche Mask&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Current Time lapse 2D o 4D Image (s)&quot; in Scope, e selezionare &quot;intera maschera&quot; in ambito Mask. In Funzioni, selezionare &quot;Tempo trascorso (hh: mm: ms)&quot; sotto data di cattura, selezionare &quot;Area (pixel)&quot; sotto morfometria, selezionare &quot;Potenza massima&quot; sotto intensità, e fare clic su &quot;Esporta&quot; (Questo metodo ci permette di statistica calcolo automatico intensità di fluorescenza (segnale di fondo)). </li><li> Aprire il file di testo in MS Office Excel e calcolare il valore medio del segnale di fondo per tutto il periodo di registrazione. Questo è l&#39;intensità di fluorescenza di sfondo. </li><li> Per determinare l&#39;intensità del trombo, fare clic su &quot;icona grande matita&quot; di nuovo in &quot;strumento Marquee&quot; nella vista principale. </li><li> Colore all&#39;interno della nave nella vista principale per impostare il segnale delle piastrine. </li><li> Vai su &quot;Mask&quot;, fare clic su &quot;Copia This Plane&quot;, fare clic su &quot;Copia in maschera timepoint corrente&quot;, selezionare &quot;tutte le visite&quot;, e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Vai su &quot;Statistiche&quot; e fare clic su &quot;Statistiche Mask&quot;. </li><li> Fare clic su &quot;Current Time lapse 2D o 4D Image (s)&quot; in Scope, e selezionare &quot;intera maschera&quot; in ambito Mask. In Funzioni, selezionare &quot;Tempo trascorso (hh: mm: ms)&quot; sotto data di cattura, selezionare &quot;Area (pixel)&quot; sotto morfometria, selezionare &quot;Potenza Sum&quot; sotto intensità, e fare clic su &quot;Esporta&quot; (Questo metodo ci permette di statistica calcolare l&#39;intensità di fluorescenza all&#39;interno del recipiente). </li><li> Aprire il file di testo in Microsoft Office Excel. Segnale di fluorescenza di piastrine viene calcolato sottraendo il valore medio di intensità Area sfondo x (pixel) dalla somma di intensità della parte interna del vaso. Questo è l&#39;intensità di fluorescenza del trombo di piastrine. </li><li> Ripetere questo in 30 diversi venule in 3-5 diversi tipi di mouse. Quindi, calcola il valore medio della intensità di fluorescenza delle piastrine. </li><li> Aanalizzare il rotolamento dei neutrofili e l&#39;adesione, l&#39;afflusso di rotolamento dei neutrofili è stata determinata oltre 5 min in ciascuna venule e presentati come numero di cellule al minuto. Il numero di neutrofili aderenti che sono stati fermi per&gt; 30 sec e lentamente strisciando (&lt;10 micron più di 30 secondi), ma non rotolare, sono stati contati e presentati come numero di cellule per 5 min. </li></ol> 5. Microscopia intravitale per Laser-indotta trombosi arteriolare 5-1 Calibrazione di ablazione laser <ol><li> Inserire una diapositiva a specchio sul palco microscopio, applicare una piccola goccia di acqua distillata fino alla parte superiore della diapositiva, e regolare l&#39;intensità e mettere a fuoco con l&#39;oculare. </li><li> Aprire &quot;Finestra di messa a fuoco&quot; e selezionare la scheda &quot;FRAP&quot; nel software SlideBook 5.0. </li><li> Impostare la potenza del laser a 40-50, e impostare entrambe le &quot;ripetizioni Fare doppio clic su&quot; e &quot;dimensione Doppio click&quot; a 8. Segnare la casella &quot;Guida&quot; per far apparire una serie di mirini. </li><li> Selezionare l&#39;icona &quot;Freccia&quot; dalla barra delle applicazioni on parte superiore dello schermo. </li><li> Nella sezione &quot;Allineamento FRAP&quot; scheda, fare clic su &quot;Fuoco prossimo&quot;. Un piccolo punto dovrebbe apparire vicino all&#39;angolo in basso a sinistra sul monitor. Una volta che il punto viene visualizzata, fare doppio clic sul centro di esso. Una volta cliccato, un altro punto dovrebbe apparire in alto a destra del primo spot, fare doppio clic su di esso. Ripetere questa operazione per 16 punti (16 ° posto apparirà nell&#39;angolo in basso a destra.) Fare clic su &quot;Salva&quot; quando completo per aggiornare i parametri di calibrazione. </li><li> Per verificare la precisione della calibrazione, fare clic sul pulsante, un &quot;Centro&quot; piccolo punto dovrebbe apparire al centro dello schermo. In caso contrario, ripetere la calibrazione fino a quando la precisione desiderata. </li></ol> 5-2 laser-indotta la formazione di trombi arteriolare <ol><li> Inserire un mouse anestetizzato (vedere la procedura di 2-2 a 2-12) sul palco microscopio. </li><li> Sotto la finestra &quot;Capture&quot;, selezionare un protocollo o di crearne uno nuovo. Le impostazioni sono le seguenti: CY5 (70 esposizione msec), Open (10 mseesposizione c), e FITC (50 esposizione msec). L&#39;immagine è catturata più di 20 minuti (circa 2.400 punti di tempo con un intervallo di tempo di 500 msec). </li><li> Infondere Dylight 488-coniugato anti-topo CD42c e Alexa Fluor 647-coniugato anti-topo Gr-1 anticorpi come descritto sopra. </li><li> Ottimizzare i parametri microscopio tra intensità di fluorescenza e di immagine in campo chiaro come descritto in 3-3 per 3-7. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Test&quot; per garantire la giusta intensità campo chiaro o segnale anticorpo, arteriola posizionamento e messa a fuoco. </li><li> Fare clic su &quot;Start&quot; per avviare il processo di cattura dell&#39;immagine. </li><li> Prima di sparare il laser ablazione, accertarsi che l&#39;icona del puntatore del mouse è stato selezionato e che la parete del vaso è a fuoco chiaro. </li><li> Per sparare il laser, fare doppio clic su un punto 2-3 micron internamente dalla parete del serbatoio. Lesioni delle cellule endoteliali arteriolare provoca un cambiamento visivo forma che dovrebbe essere evidente nell&#39;immagine chiaro, seguito da accumulo piastrinica. Monitor tromboformazione per 5 min dopo la lesione laser. </li><li> Cinque minuti dopo la lesione laser (la dimensione del trombo dovrebbe essere stabile) mettere in pausa e annullare la cattura. Successivamente, avviare una cattura con 2400 punti di tempo con un intervallo di 500 msec per registrare piastrine aderenti e neutrofili laminazione / aderente per 20 min. Da tre a cinque arteriole sono registrati in un mouse. </li><li> Al termine dell&#39;esperimento, i topi sono stati sacrificati mediante dislocazione cervicale. </li></ol> 6. Analisi dei dati per il modello Trombosi arteriolare <ol><li> Andare oltre 4,1 passi attraverso 4.5. </li><li> Per ottenere l&#39;intensità di fluorescenza di fondo durante le piastrine formazione di trombi, andare oltre i passaggi attraverso 4,7 4.14. </li><li> Vai su &quot;Mask&quot;, fare clic su &quot;Segmento&quot;, selezionare FITC nel canale, e inserire il valore medio del segnale di fondo su Low. Fare clic su &quot;Applica&quot; e &quot;OK&quot;. </li><li> Per analizzare l&#39;intensità di fluorescenza del trombo di piastrine (Dylight 488-coniugato anticorpo anti-CD42c), </strong&gt; andare oltre 4,18 passaggi attraverso 4.19. Per calcolare il segnale anticorpo, &quot;Intensity Somma&quot; viene sottratto dal segnale di fondo (&quot;Maximum Intensity&quot; x &quot;Area (pixel)&quot;). Questo è l&#39;intensità di fluorescenza del trombo di piastrine. </li><li> Per quantificare i neutrofili di laminazione e aderente, giocare il timelapse e contare il numero di celle che visibilmente rotolano nei trombi piastrinici oltre 20 min. Rotolamento è definita come una diminuzione della velocità neutrofili mentre interagisce con il trombo di piastrine per almeno 2 sec. Neutrofili aderenti si intende qualsiasi neutrofili che rimangono attaccati ai trombi piastrinici per almeno 2 min. Il numero di neutrofili laminazione e aderente è stato presentato come il numero di cellule per 20 min. Velocità di laminazione è stata calcolata usando un sistema di tracciamento di particelle. </li></ol>

<ol><li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+stroke%3A+a+thrombo-inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease.</a> J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).</li>
<li>Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1%3A+its+role+as+a+selectin+counterreceptor+in+leukocyte-endothelial+and+leukocyte-platelet+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction.</a> Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).</li>
<li>Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-neutrophil-interactions%3A+linking+hemostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation.</a> Blood Rev. 21, 99-111 (2007).</li>
<li>Chen, J., Lopez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+platelets+with+subendothelium+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Interactions of platelets with subendothelium and endothelium.</a> Microcirculation. 12, 235-246 (2005).</li>
<li>Konstantopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+levels+of+shear+support+neutrophil-platelet+adhesion+and+neutrophil+aggregation+in+blood+via+P-selectin+and+beta2-integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin.</a> Circulation. 98, 873-882 (1998).</li>
<li>Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+platelet-polymorphonuclear+leukocyte+interactions%3A+new+clues+to+the+antithrombotic+properties+of+parnaparin%2C+a+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin.</a> Haematologica. 90, 833-839 (2005).</li>
<li>Hidalgo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+interactions+enabled+by+polarized+neutrophil+microdomains+mediate+thromboinflammatory+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury.</a> Nat. Med. 15, 384-391 (2009).</li>
<li>Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+extracellular+protein+disulfide+isomerase+during+thrombus+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li>
<li>Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-versus+microparticle-mediated+tissue+factor+transfer+during+arteriolar+thrombus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development.</a> Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).</li>
<li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets%2C+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li>
<li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+1%2C3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li>
<li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1%28%2B%29+cell+subpopulations+during+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Qui si descrive un protocollo dettagliato per tempo reale microscopia a fluorescenza intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio vascolare attivato durante l&#39;infiammazione e trombosi. In precedenza, simili approcci fluorescenza microscopiche sono stati segnalati per studiare il meccanismo molecolare della formazione di trombi e infiammazione vascolare. 8,12 Poiché il heterotypic interazione cellula-cellula potrebbe essere importante per vaso-occlusione al l...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>0,9% NaCl soluzione salina</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi intramedicali (PE 90)</td><td>BD Diagnostics</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>Tubi intramedicali (PE 10)</td><td>BD Diagnostics</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Murine TNF-&alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488- marcato ratto anti-topo CD42b anticorpo </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-coniugato anti-topo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>NESLAB EX bagnomaria/circolatore</td><td>Microscopio Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61W</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100 Power</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200 multi-manipolatore</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200 controller di scena</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C9300 telecamera ad alta velocità</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>intensificatore</td><td>Video scope Laser di</td> ablazione internazionale <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strumenti fotonici, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr>Innovazioni <td></td><td></td>per <td>l'imaging intelligente</td> <td>SlideBook 5.0</td></tr></tbody></table>

in tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interazione delle piastrine attivate e leucociti neutrofili (principalmente) sulla trombosi attivato media endotelio e infiammazione vascolare. 1,2 Durante la formazione del trombo nel sito di lesione arteriolare, piastrine aderenti all&#39;endotelio attivato e proteine ​​della matrice subendoteliali supportare rotolamento dei neutrofili e adesione. 3 Viceversa, in venulare condizioni infiammatorie, aderenti neutrofili all&#39;endotelio attivato può sostenere l&#39;adesione e l&#39;accumulo di piastrine circolanti. Eterotipica piastrine-neutrofili aggregazione richiede processi sequenziali dagli specifici recettori-counter interazioni tra cellule recettore. 4 È noto che cellule endoteliali attivate rilasciare molecole di adesione come fattore di von Willebrand, avviando adesione piastrinica e accumulo condizioni di alto shear. 5 Inoltre, cellule endoteliali attivate supportare rotolamento dei neutrofili e adesione da selectine esprimono unmolecola-1 di adesione intercellulare d (ICAM-1), rispettivamente, in condizioni di basso attrito. 4 piastrine P-selectina interagisce con neutrofili attraverso P-selectina glicoproteina ligando-1 (PSGL-1), inducendo così l&#39;attivazione dei neutrofili β2 integrine e azienda adesione tra due tipi di cellule. Nonostante i progressi in esperimenti in vitro in cui sono determinati eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni in sangue intero o cellule isolate, 6,7 quegli studi non può manipolare durante condizioni di stress ossidativo malattia vascolare. In questo rapporto, con marcati in fluorescenza, anticorpi specifici contro un mouse piastrinica e dei neutrofili marcatore, si descrive un dettagliato protocollo intravitale microscopica per monitorare le interazioni eterotipiche di piastrine e dei neutrofili sul endotelio attivato durante il TNF-α indotta da infiammazione o dopo laser-indotta lesioni in Cremaster microvasi muscolari di topi vivi.

Con un&#39;analisi dettagliata microscopia intravitale, eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato sono state visualizzate mediante infusione di anticorpi marcati con fluorescenza contro una piastrina (CD42c) o neutrofili marcatore (Gr-1) in topi vivi. In un modello di TNF-α indotta infiammazione venulare, neutrofili più laminazione sono stabilmente aderito all&#39;endotelio presumibilmente dall&#39;interazione attivati ​​β2 integrine con ICAM-1 durante il periodo d...

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull&#39;endotelio Attivato durante l&#39;infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare l'interazione tipica tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato durante una malattia vascolare. Questo viene ottenuto mediante microscopia fluorescente intravitale in tempo reale in topi vivi per visualizzare la microvascolatura all'interno del muscolo cremaster. Come secondo passaggio, vengono somministrati anticorpi marcati con fluorescenza e viene indotta un'infiammazione o lesione locale per facilitare la visualizzazione diretta delle interazioni tipiche tra piastrine e neutrofili risultanti.Successivamente, i dati salvati vengono analizzati al fine di quantificare il numero di cellule e la loro dinamica. In definitiva, le tipiche interazioni dirette tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato possono essere valutate in base al segnale fluorescente degli anticorpi infusi mediante microscopia intravitale in tempo reale. La nostra tecnica di microscopia intravitale può fornire informazioni sulle interazioni in tempo reale tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione del trombo.Questa tecnologia può essere applicata anche ad altri sistemi, ad esempio per valutare le interazioni tra cellule tumorali e cellule del sangue. Prima di iniziare l'esperimento, accendere il sistema microscopico per il modello di infiammazione vascolare. Iniettare intra-grembo TNF alfa in modo speculare tre ore prima dell'iniezione intraperitoneale di anestetici.Dopo aver confermato la sedazione mediante pinzatura del dito del piede, inserire un tubo PE 90 nella trachea del topo per eliminare eventuali difficoltà respiratorie. Successivamente, inserire un tubo PE 10 nella vena giugulare sinistra per l'infusione di anticorpi marcati con fluorocromo e ulteriori anestetici. Quindi, estrarre delicatamente e praticare un'incisione orizzontale nella cute scrotale e irrorare con un buffer preriscaldato l'area chirurgica.Ora, premendo sull'addome inferiore con una pinza, estrarre con cura un testicolo con l'altra pinza, dispiegare il muscolo cremaster in senso verticale e appiattirlo su un coprioggetto di vetro posizionato su un vassoio microscopico intra-viale, fissando i tessuti periferici al vassoio. Iniziare questo passaggio infondendo prima DITE 4 88 coniugato con ratto, anti topo CD 42 C e Alexa floor 6 47 coniugato con anti topo GR one attraverso la cannula giugulare precedentemente posizionata. Successivamente, nell'insieme del filtro del microscopio, selezionare la casella di controllo per i canali che verranno esposti e impostare il tempo di esposizione per ciascuna acquisizione sequenziale selezionata.Impostare il numero di punti temporali da 1000 a 1500 con un intervallo di 200 millisecondi per un tempo totale trascorso di cinque minuti. Una volta impostati tutti i parametri nell'acquisizione dell'immagine, selezionare "start" per iniziare l'acquisizione con un ingrandimento di 60x e una finestra di 157 micrometri per 118 micrometri. Monitorare le piastrine che si aggregano e aderiscono ai neutrofili per cinque minuti nella metà superiore di un vaso cremasterico infiammato.Per analizzare la formazione del trombo piastrinico, vai alla maschera e seleziona crea. Quindi, sotto lo strumento di selezione nell'area di visualizzazione principale, fai clic sull'icona della matita grande. Usa la matita per colorare una regione al di fuori del vaso nell'area di visualizzazione principale.Per impostare una maschera di sfondo, andare su maschera, fare clic su copia questo piano, quindi fare clic su copia maschera. Nel punto temporale corrente, selezionare tutti i punti temporali e fare clic su ok. Per calcolare il segnale di fondo, andare su statistiche e fare clic su statistiche della maschera.Quindi nell'ambito dell'immagine, fare clic sull'attuale sequenza temporale 2D o sulle immagini in quattro dimensioni nell'ambito della maschera, selezionare l'intera maschera nelle caratteristiche. Sotto la data di acquisizione, selezionare il tempo trascorso. Nella geometria morfologica, selezionare l'area in pixel e nell'intensità selezionare l'intensità massima.Ora fare clic su esporta. Aprire il file di testo in un programma di foglio elettronico e calcolare il valore medio del segnale di fondo durante l'intero periodo di registrazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza di fondo.Dopo aver calcolato l'intensità della fluorescenza di fondo durante il trombo piastrinico come appena dimostrato nel modello di infiammazione tissutale, passare alla maschera, fare clic su segmenta, selezionare adatta e, selezionare il canale e inserire il valore medio del segnale di fondo su basso, fare clic su applica e ok. Quindi andare su statistiche e fare clic su statistiche della maschera. Ora nell'ambito dell'immagine, fare clic sull'attuale sequenza temporale 2D o immagini 4D nell'ambito della maschera, selezionare l'intera maschera in funzionalità, sotto data di acquisizione selezionare tempo trascorso, sotto geometria morfologica selezionare area in pixel e sotto intensità selezionare intensità totale.Quindi fare clic su esporta. Aprire il file di testo nel programma di foglio elettronico e calcolare l'intensità di fluorescenza del trombo piastrinico. Per analizzare la trombosi arteriolare, iniziare infondendo l'anticorpo anti topo CD 42 coniugato con DITE 4 88 e l'anticorpo anti topo GR uno coniugato con ANDOR 6 47, come appena dimostrato.Dopo aver fatto clic su "start" per avviare il processo di acquisizione delle immagini, fare doppio clic su un punto distante due-tre micrometri all'interno della parete del vaso per attivare il laser. Il danno alle cellule endoteliali arteriolari provoca un cambiamento visibile della forma, che dovrebbe essere evidente nell'immagine in campo chiaro, seguito dall'accumulo di piastrine. Cinque minuti dopo l'infortunio laser, mettere in pausa e annullare l'acquisizione.Successivamente, avviare un'acquisizione con 2.400 punti temporali a intervalli di 500 millisecondi per registrare le piastrine aderenti e i neutrofili rotolanti e aderenti per 20 minuti. Dopo aver calcolato l'intensità di fluorescenza di fondo durante il trombo piastrinico con un metodo simile a quello utilizzato nel modello di infiammazione venulare, passare alla maschera, fare clic su segmenta, selezionare fite e canale, inserire il valore medio del segnale di fondo nel campo dedicato, quindi fare clic su applica e ok. Ora, nell'ambiente di visualizzazione delle immagini, fare clic su sequenza temporale 2D corrente o immagini 4D nella visualizzazione della maschera, selezionare l'intera maschera nelle funzionalità, sotto data di acquisizione selezionare tempo trascorso, sotto Morpho selezionare area in pixel e sotto intensità selezionare intensità media.Quindi fare clic su esporta. Aprire il file di testo nel programma di foglio elettronico e calcolare l'intensità di fluorescenza del trombo piastrinico. Per quantificare i neutrofili in rotolamento e aderenti, riprodurre la sequenza temporale e contare il numero di cellule che rotolano visibilmente.Il rotolamento del trombo piastrinico per 20 minuti è definito come una riduzione della velocità dei neutrofili durante l'interazione con il trombo piastrinico per almeno due secondi. I neutrofili aderenti sono definiti come quei neutrofili che rimangono attaccati al trombo piastrinico per almeno due minuti. Di seguito, immagini rappresentative dell'aspetto dei segnali fluorescenti associati ai neutrofili in rosso e alle piastrine in verde.Nell'infiammazione venulare mostrata, la freccia indica la direzione del flusso sanguigno nel vaso. Il numero di neutrofili che rotolano e di neutrofili aderenti sulle cellule endoteliali infiammate è stato determinato essere rispettivamente di 0,25 cellule al minuto e di 18,5 cellule ogni cinque minuti. I dati sono rappresentativi della media più o meno l'errore standard della media di 30 diversi Es in quattro topi di tipo selvaggio.Qui il segnale fluorescente integrato mediano dei piastrine è riportato in funzione del tempo. Si è osservato che la maggior parte delle piastrine in rosso aderisce ai neutrofili aderenti e striscianti in verde piuttosto che alla parete del vaso infiammata. Ora passiamo alle interazioni tra neutrofili e piastrine successive a un danno arteriolare indotto da laser.Queste immagini illustrano un singolo neutrofilo in rosso, indicato dalla freccia gialla, che rotola sul trombo piastrinico in verde, mentre un secondo neutrofilo in rosso, indicato dalla freccia bianca, rotola rapidamente sulle cellule endoteliali arteriolari; entrambi gli eventi sono ripresi in un intervallo di acquisizione di cinque secondi. In un altro caso, un singolo neutrofilo nuovamente in rosso è mostrato mentre rotola e aderisce a un trombo piastrinico in verde in un intervallo di 15 secondi. La testa della freccia identifica i neutrofili in rotolamento e aderenti, mentre la freccia grigia spessa indica la direzione del flusso sanguigno. Qui, il segnale fluorescente integrato mediano delle piastrine è riportato in funzione del tempo.Il numero di neutrofili rotolanti e aderenti &egrave; stato determinato essere rispettivamente di 21,5 e 1,6 cellule su un periodo di 20 minuti. Il rotolamento rapido iniziale dei neutrofili &egrave; avvenuto sulle cellule endoteliali. Una volta che i neutrofili hanno contattato il trombo piastrinico, la velocit&agrave; di rotolamento dei neutrofili sul trombo piastrinico &egrave; cambiata con un intervallo di 8,2 micrometri al secondo ed &egrave; mediata dall'interazione tra pectina e PSGL-1.I dati sono rappresentativi della media più o meno l'errore standard della media di 14 trombi diversi in sette topi di tipo selvaggio, cinque minuti dopo un danno da laser. La dimensione del trombo piastrinico rimane relativamente costante durante l'acquisizione delle immagini, e i neutrofili rotolano e aderiscono al trombo. Il segnale fluorescente proveniente dalle piastrine circolanti è trascurabile.Rispetto a quello del trombo piastrinico, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come impostare il sistema di microscopia intravitale con topi vivi, permettendovi di visualizzare in tempo reale le interazioni eterotipiche tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato all'interno della microvascolatura.

real-time-imaging-heterotypic-platelet-neutrophil-interactions-on

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo la visualizzazione in tempo reale delle interazioni cellula del sangue-endoteliale nelle vene mesenteriali di un modello murino iniettato per via intraperitoneale con lipopolisaccaride.

Microscopia intravitale per analizzare le interazioni tra cellule del sangue ed endoteliali in un modello murino di infiammazione

Per studiare l'interazione dei batteri con i vasi sanguigni sottoposti a stress di taglio, vengono descritti una camera di flusso e un modello di microscopia intravitale mesenterica in vivo che consentono di sezionare i fattori batterici e dell'ospite che contribuiscono all'adesione vascolare.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

Questa applicazione semplificata della microscopia intravitale delle vene mesenterarie nei topi può essere utilizzata in diversi modelli di infiammazione per osservare le interazioni leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti.

Interazioni intravitale Microscopia di leucociti-endoteliali e piastrine-leucociti in Mesenterial Vene Mice

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

Questo articolo descrive un modello sperimentale di emostasi che misura contemporaneamente la funzione piastrinica e la coagulazione. Piastrine e di fibrina fluorescenza viene misurata in tempo reale, e il tasso di piastrine di adesione, il tasso di coagulazione, e l'inizio della coagulazione sono determinati. Il modello viene utilizzato per determinare le proprietà delle piastrine procoagulanti sotto flusso nei concentrati di trasfusione.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Questo lavoro descrive un metodo basato sulla microscopia a fluorescenza per lo studio dell'adesione piastrinica, della diffusione e della secrezione sotto flusso. Questa piattaforma versatile permette di studiare la funzione piastrinica per la ricerca meccanicistica sulla trombosi e sull'emostasi.

Imaging di cellule vive di degranulazione piastrinica e secrezione sotto flusso

Presentiamo un modello di malattia vascolare in vitro per studiare le interazioni del sangue intero con l'endotelio derivato dal paziente. Questo sistema permette lo studio delle proprietà trombogeniche delle cellule endoteliali primarie in varie circostanze. Il metodo è particolarmente adatto per valutare in situ trombogenicità e terapia anticoagulante durante diverse fasi della coagulazione.

Modello di malattia microfluidico in vitro per studiare le interazioni sangue-endoteliali intere e le dinamiche del coagulo di sangue in tempo reale

Descriviamo qui il metodo per l'imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell'osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.

In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

La funzione piastrinica sotto flusso può essere valutata e la rianimazione emostatica simulata può essere modellata utilizzando un dispositivo microfluidico, che ha applicazioni nella medicina traumatologica e trasfusionale.

Microfluidica nella valutazione della funzione piastrinica

Scopri la microscopia intravitale a fluorescenza per visualizzare in tempo reale le interazioni piastrine-neutrofili sull'endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare nei topi vivi. Questo metodo consente di studiare la formazione dei trombi e valutare potenziali interventi farmacologici.

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sullendotelio Attivato durante linfiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi (Video) | JoVE Journal

In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio Attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Esplora altri video