In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio Attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

Qui riportiamo una tecnica sperimentale di fluorescenza microscopia intravitale di visualizzare eterotipiche piastrine-neutrofili interazioni sul endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi nei topi vivi. Questa tecnologia microscopica sarà prezioso per studiare il meccanismo molecolare della malattia vascolare e per testare agenti farmacologici in condizioni fisiopatologiche.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare l'interazione tipica tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato durante la malattia vascolare. Ciò si ottiene mediante microscopia intravitale a fluorescenza in tempo reale in topi vivi per visualizzare la microvascolarizzazione all'interno del muscolo cremastere. In una seconda fase, vengono infusi anticorpi marcati in fluorescenza e viene avviata l'infiammazione o la lesione per facilitare la visualizzazione diretta delle interazioni tipiche dei neutrofili piastrinici risultanti.

Successivamente, i dati salvati vengono analizzati per quantificare il numero di celle e la loro dinamica. In definitiva, le interazioni tipiche dirette tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato possono essere valutate sulla base del segnale fluorescente degli anticorpi infusi nella microscopia intravitale in tempo reale. La nostra tecnica microscopica intravitale può fornire informazioni sulle interazioni in tempo reale tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi.

Questa tecnologia può essere applicata anche ad altri sistemi, come la valutazione delle interazioni tra cellule tumorali e cellule del sangue. Prima di iniziare l'esperimento, accendere il sistema di microscopio per il modello di infiammazione vascolare. Iniettare intra growly rispecchiante TNF alfa tre ore prima dell'iniezione IP di anestetici.

Una volta che la sedazione è stata confermata dal pizzicamento delle dita dei piedi, incannulare un tubo PE 90 nella trachea del topo per eliminare eventuali difficoltà respiratorie. Successivamente, incannulare un tubo PE 10 nella vena giugulare sinistra per l'infusione di anticorpi marcati in fluorescenza e anestetici aggiuntivi. Quindi estrarre delicatamente e incidere orizzontalmente la pelle scrotale e utilizzare il tampone di preriscaldamento sul campo chirurgico.

Ora premendo sul basso addome con una pinza, estrarre con cautela un testicolo con l'altra pinza di dimensioni, il muscolo maestro dell'auto verticalmente e appiattire il muscolo su un vetrino coprioggetto su un vassoio per microscopio intraflaconico bloccando il tessuto periferico al vassoio. Inizia questo passaggio infondendo prima gli anticorpi DITE 4 88 coniugato di ratto, anti topo CD 42 C e Alexa floor 6 47 coniugato anti topo GR one attraverso la cannula giugulare precedentemente impostata. Quindi, nel set di filtri del microscopio, selezionare la casella di controllo per i canali che verranno esposti e impostare il tempo di esposizione per ogni acquisizione time-lapse selezionata.

Per impostare il numero di punti temporali da 1000 a 1500 con un intervallo di 200 millisecondi per un tempo totale trascorso di cinque minuti. Una volta impostati tutti i parametri nell'acquisizione dell'immagine, selezionare Avvia per iniziare l'acquisizione con un ingrandimento di 60x con una finestra di 157 micrometri per 118 micrometri. Monitorare le piastrine dominanti e aderenti nei neutrofili per cinque minuti nella metà superiore di una sede cremastere infiammata.

Per analizzare la formazione di trombi piastrinici, andare su maschera e selezionare Crea. Quindi, sotto lo strumento di selezione nella vista principale, fai clic sull'icona a forma di matita grande. Usa la matita per colorare una regione al di fuori dell'imbarcazione nella vista principale.

Per impostare una maschera di sfondo, vai su maschera, fai clic su copia questo piano, fai clic su copia maschera. Nel punto temporale corrente, selezionare tutti i punti temporali e fare clic su OK. Per calcolare il segnale di sottofondo, vai alle statistiche e fai clic su Statistiche maschera.

Quindi, nell'ambito dell'immagine, fare clic sul time-lapse 2D corrente o su quattro immagini D nell'ambito della maschera, selezionare l'intera maschera nelle funzioni. In Data di acquisizione, selezionare il tempo trascorso. In Geometria morphing, selezionare l'area in pixel e in intensità selezionare l'intensità massima.

Ora fai clic su Esporta. Aprire il file di testo in un foglio di calcolo e calcolare il valore medio del segnale di fondo per tutto il periodo di registrazione. Per determinare l'intensità della fluorescenza di fondo.

Dopo aver calcolato l'intensità della fluorescenza di fondo durante il trombo piastrinico come appena dimostrato nel modello di infiammazione ulare, andare su maschera, fare clic su segmento, selezionare fit e e canale e inserire il valore medio del segnale di fondo su un basso clic, fare clic su applica e va bene. Quindi vai su statistiche e fai clic su statistiche maschera. Ora nell'ambito dell'immagine, fai clic sul time-lapse 2D corrente o su quattro immagini D nell'ambito della maschera, seleziona l'intera maschera nelle funzioni sotto la data di acquisizione, seleziona il tempo trascorso sotto la geometria morph, seleziona l'area in pixel e sotto l'intensità, seleziona un po' di intensità.

Quindi fare clic su Esporta. Apri il file di testo nel programma per fogli di calcolo e calcola l'intensità della fluorescenza del trombo piastrinico. Per l'analisi della trombosi arteriolare, iniziare con l'infusione di DITE 4 88 anticorpi coniugati anti topo CD 42 C, ANDOR 6 47 coniugati anti topo GR one, come appena dimostrato.

Dopo aver fatto clic su Avvia per avviare il processo di acquisizione dell'immagine, fare doppio clic su un punto a due o tre micrometri all'interno della parete del recipiente per sparare il laser. La lesione delle cellule endoteliali arteriolari provoca un cambiamento visivo della forma che dovrebbe essere evidente nell'immagine in campo chiaro seguito dall'accumulo di piastrine. Cinque minuti dopo la lesione laser, mettere in pausa e annullare l'acquisizione.

Successivamente avviare una cattura con 2.400 punti temporali con un intervallo di 500 millisecondi per registrare le piastrine aderenti e i neutrofili aderenti e aderenti per 20 minuti. Dopo aver calcolato l'intensità della fluorescenza di fondo durante il trombo piastrinico in modo simile al modello di infiammazione pulare, andare su maschera, fare clic su segmento, selezionare fite e canale e inserire il valore medio del segnale di fondo su basso clic applicare e ok. Ora nell'ambito dell'immagine, fai clic sul time-lapse 2D corrente o sulle immagini 40 D nell'ambito della maschera, seleziona l'intera maschera nelle funzioni sotto la data di acquisizione, seleziona il tempo trascorso in Morpho seleziona l'area in pixel e in intensità, seleziona una certa intensità.

Quindi fare clic su Esporta. Apri il file di testo nel programma per fogli di calcolo e calcola l'intensità della fluorescenza del trombo piastrinico. Per quantificare i neutrofili rotolanti e aderenti, riproduci il time lapse e conta il numero di cellule che si ribaltano visibilmente.

Il trombo piastrinico nell'arco di 20 minuti di rotolamento è definito come una diminuzione della velocità dei neutrofili mentre interagisce con il trombo piastrinico per almeno due secondi. I neutrofili aderenti sono definiti come tutti i neutrofili che rimangono attaccati al trombo piastrinico per almeno due minuti. Qui, immagini rappresentative della comparsa di segnali fluorescenti associati ai neutrofili in rosso e alle piastrine in verde.

Durante l'infiammazione ulare è mostrata, la freccia mostra la direzione del flusso sanguigno nel vaso. Il numero di neutrofili rotanti e aderenti sulle cellule endoteliali infiammate è stato determinato rispettivamente in 0,25 cellule al minuto e 18,5 cellule per cinque minuti. I dati sono rappresentativi della media più o meno l'errore standard della media di 30 diversi E in quattro topi wild type.

Qui viene tracciato il segnale fluorescente mediano integrato delle piastrine in funzione del tempo. Si è scoperto che la maggior parte delle piastrine in rosso aderisce ai neutrofili aderenti e striscianti in verde piuttosto che alla parete del vaso infiammata. Passiamo ora alle interazioni piastriniche dei neutrofili a seguito di lesione arteriolare indotta dal laser.

Queste immagini illustrano un singolo neutrofilo in rosso e indicato con la freccia gialla che rotola sopra il trombo piastrinico in verde con un secondo neutrofilo in rosso e indicato dalla freccia bianca che rotola rapidamente sulle cellule endoteliali arteriolari, entrambe su un intervallo di cattura di cinque secondi qui, un singolo neutrofilo di nuovo in rosso è mostrato mentre si ribalta e aderisce a un trombo piastrinico in verde su un intervallo di 15 secondi. La punta della freccia identifica i neutrofili rotolanti e aderenti e la spessa freccia grigia indica la direzione del flusso sanguigno. Qui, il segnale fluorescente mediano integrato delle piastrine è tracciato in funzione del tempo.

Il numero di neutrofili rotanti e aderenti è stato determinato in 21,5 e 1,6 cellule rispettivamente in 20 minuti. Il rapido rollio iniziale dei neutrofili si è verificato sulle cellule endoteliali. Una volta che i neutrofili sono entrati in contatto con il trombo piastrinico, la velocità di rotolamento dei neutrofili sul trombo piastrinico è stata modificata con un intervallo di 8,2 micrometri al secondo ed è mediata dall'interazione di pectina e psgl L one.

I dati sono rappresentativi della media più o meno, l'errore standard della media di 14 diversi trombi in sette topi wild type cinque minuti dopo la lesione laser. La dimensione del trombo piastrinico rimane relativamente costante durante l'imaging e i neutrofili rotolano e aderiscono al trombo. Il segnale fluorescente dalle piastrine circolanti è trascurabile.

Rispetto a quello del trombo piastrinico, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare il sistema di microscopio intravitale con topi vivi, permettendoti di visualizzare in tempo reale le interazioni eterotipiche tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato all'interno della microvascolarizzazione.