In tempo reale di immagine degli eterotipica piastrine-neutrofili interazioni sull'endotelio Attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione di trombi in topi vivi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è visualizzare l'interazione tipica tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato durante una malattia vascolare. Questo viene ottenuto mediante microscopia fluorescente intravitale in tempo reale in topi vivi per visualizzare la microvascolatura all'interno del muscolo cremaster. Come secondo passaggio, vengono somministrati anticorpi marcati con fluorescenza e viene indotta un'infiammazione o lesione locale per facilitare la visualizzazione diretta delle interazioni tipiche tra piastrine e neutrofili risultanti.

Successivamente, i dati salvati vengono analizzati al fine di quantificare il numero di cellule e la loro dinamica. In definitiva, le tipiche interazioni dirette tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato possono essere valutate in base al segnale fluorescente degli anticorpi infusi mediante microscopia intravitale in tempo reale. La nostra tecnica di microscopia intravitale può fornire informazioni sulle interazioni in tempo reale tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato durante l'infiammazione vascolare e la formazione del trombo.

Questa tecnologia può essere applicata anche ad altri sistemi, ad esempio per valutare le interazioni tra cellule tumorali e cellule del sangue. Prima di iniziare l'esperimento, accendere il sistema microscopico per il modello di infiammazione vascolare. Iniettare intra-grembo TNF alfa in modo speculare tre ore prima dell'iniezione intraperitoneale di anestetici.

Dopo aver confermato la sedazione mediante pinzatura del dito del piede, inserire un tubo PE 90 nella trachea del topo per eliminare eventuali difficoltà respiratorie. Successivamente, inserire un tubo PE 10 nella vena giugulare sinistra per l'infusione di anticorpi marcati con fluorocromo e ulteriori anestetici. Quindi, estrarre delicatamente e praticare un'incisione orizzontale nella cute scrotale e irrorare con un buffer preriscaldato l'area chirurgica.

Ora, premendo sull'addome inferiore con una pinza, estrarre con cura un testicolo con l'altra pinza, dispiegare il muscolo cremaster in senso verticale e appiattirlo su un coprioggetto di vetro posizionato su un vassoio microscopico intra-viale, fissando i tessuti periferici al vassoio. Iniziare questo passaggio infondendo prima DITE 4 88 coniugato con ratto, anti topo CD 42 C e Alexa floor 6 47 coniugato con anti topo GR one attraverso la cannula giugulare precedentemente posizionata. Successivamente, nell'insieme del filtro del microscopio, selezionare la casella di controllo per i canali che verranno esposti e impostare il tempo di esposizione per ciascuna acquisizione sequenziale selezionata.

Impostare il numero di punti temporali da 1000 a 1500 con un intervallo di 200 millisecondi per un tempo totale trascorso di cinque minuti. Una volta impostati tutti i parametri nell'acquisizione dell'immagine, selezionare "start" per iniziare l'acquisizione con un ingrandimento di 60x e una finestra di 157 micrometri per 118 micrometri. Monitorare le piastrine che si aggregano e aderiscono ai neutrofili per cinque minuti nella metà superiore di un vaso cremasterico infiammato.

Per analizzare la formazione del trombo piastrinico, vai alla maschera e seleziona crea. Quindi, sotto lo strumento di selezione nell'area di visualizzazione principale, fai clic sull'icona della matita grande. Usa la matita per colorare una regione al di fuori del vaso nell'area di visualizzazione principale.

Per impostare una maschera di sfondo, andare su maschera, fare clic su copia questo piano, quindi fare clic su copia maschera. Nel punto temporale corrente, selezionare tutti i punti temporali e fare clic su ok. Per calcolare il segnale di fondo, andare su statistiche e fare clic su statistiche della maschera.

Quindi nell'ambito dell'immagine, fare clic sull'attuale sequenza temporale 2D o sulle immagini in quattro dimensioni nell'ambito della maschera, selezionare l'intera maschera nelle caratteristiche. Sotto la data di acquisizione, selezionare il tempo trascorso. Nella geometria morfologica, selezionare l'area in pixel e nell'intensità selezionare l'intensità massima.

Ora fare clic su esporta. Aprire il file di testo in un programma di foglio elettronico e calcolare il valore medio del segnale di fondo durante l'intero periodo di registrazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza di fondo.

Dopo aver calcolato l'intensità della fluorescenza di fondo durante il trombo piastrinico come appena dimostrato nel modello di infiammazione tissutale, passare alla maschera, fare clic su segmenta, selezionare adatta e, selezionare il canale e inserire il valore medio del segnale di fondo su basso, fare clic su applica e ok. Quindi andare su statistiche e fare clic su statistiche della maschera. Ora nell'ambito dell'immagine, fare clic sull'attuale sequenza temporale 2D o immagini 4D nell'ambito della maschera, selezionare l'intera maschera in funzionalità, sotto data di acquisizione selezionare tempo trascorso, sotto geometria morfologica selezionare area in pixel e sotto intensità selezionare intensità totale.

Quindi fare clic su esporta. Aprire il file di testo nel programma di foglio elettronico e calcolare l'intensità di fluorescenza del trombo piastrinico. Per analizzare la trombosi arteriolare, iniziare infondendo l'anticorpo anti topo CD 42 coniugato con DITE 4 88 e l'anticorpo anti topo GR uno coniugato con ANDOR 6 47, come appena dimostrato.

Dopo aver fatto clic su "start" per avviare il processo di acquisizione delle immagini, fare doppio clic su un punto distante due-tre micrometri all'interno della parete del vaso per attivare il laser. Il danno alle cellule endoteliali arteriolari provoca un cambiamento visibile della forma, che dovrebbe essere evidente nell'immagine in campo chiaro, seguito dall'accumulo di piastrine. Cinque minuti dopo l'infortunio laser, mettere in pausa e annullare l'acquisizione.

Successivamente, avviare un'acquisizione con 2.400 punti temporali a intervalli di 500 millisecondi per registrare le piastrine aderenti e i neutrofili rotolanti e aderenti per 20 minuti. Dopo aver calcolato l'intensità di fluorescenza di fondo durante il trombo piastrinico con un metodo simile a quello utilizzato nel modello di infiammazione venulare, passare alla maschera, fare clic su segmenta, selezionare fite e canale, inserire il valore medio del segnale di fondo nel campo dedicato, quindi fare clic su applica e ok. Ora, nell'ambiente di visualizzazione delle immagini, fare clic su sequenza temporale 2D corrente o immagini 4D nella visualizzazione della maschera, selezionare l'intera maschera nelle funzionalità, sotto data di acquisizione selezionare tempo trascorso, sotto Morpho selezionare area in pixel e sotto intensità selezionare intensità media.

Quindi fare clic su esporta. Aprire il file di testo nel programma di foglio elettronico e calcolare l'intensità di fluorescenza del trombo piastrinico. Per quantificare i neutrofili in rotolamento e aderenti, riprodurre la sequenza temporale e contare il numero di cellule che rotolano visibilmente.

Il rotolamento del trombo piastrinico per 20 minuti è definito come una riduzione della velocità dei neutrofili durante l'interazione con il trombo piastrinico per almeno due secondi. I neutrofili aderenti sono definiti come quei neutrofili che rimangono attaccati al trombo piastrinico per almeno due minuti. Di seguito, immagini rappresentative dell'aspetto dei segnali fluorescenti associati ai neutrofili in rosso e alle piastrine in verde.

Nell'infiammazione venulare mostrata, la freccia indica la direzione del flusso sanguigno nel vaso. Il numero di neutrofili che rotolano e di neutrofili aderenti sulle cellule endoteliali infiammate è stato determinato essere rispettivamente di 0,25 cellule al minuto e di 18,5 cellule ogni cinque minuti. I dati sono rappresentativi della media più o meno l'errore standard della media di 30 diversi Es in quattro topi di tipo selvaggio.

Qui il segnale fluorescente integrato mediano dei piastrine è riportato in funzione del tempo. Si è osservato che la maggior parte delle piastrine in rosso aderisce ai neutrofili aderenti e striscianti in verde piuttosto che alla parete del vaso infiammata. Ora passiamo alle interazioni tra neutrofili e piastrine successive a un danno arteriolare indotto da laser.

Queste immagini illustrano un singolo neutrofilo in rosso, indicato dalla freccia gialla, che rotola sul trombo piastrinico in verde, mentre un secondo neutrofilo in rosso, indicato dalla freccia bianca, rotola rapidamente sulle cellule endoteliali arteriolari; entrambi gli eventi sono ripresi in un intervallo di acquisizione di cinque secondi. In un altro caso, un singolo neutrofilo nuovamente in rosso è mostrato mentre rotola e aderisce a un trombo piastrinico in verde in un intervallo di 15 secondi. La testa della freccia identifica i neutrofili in rotolamento e aderenti, mentre la freccia grigia spessa indica la direzione del flusso sanguigno. Qui, il segnale fluorescente integrato mediano delle piastrine è riportato in funzione del tempo.

Il numero di neutrofili rotolanti e aderenti è stato determinato essere rispettivamente di 21,5 e 1,6 cellule su un periodo di 20 minuti. Il rotolamento rapido iniziale dei neutrofili è avvenuto sulle cellule endoteliali. Una volta che i neutrofili hanno contattato il trombo piastrinico, la velocità di rotolamento dei neutrofili sul trombo piastrinico è cambiata con un intervallo di 8,2 micrometri al secondo ed è mediata dall'interazione tra pectina e PSGL-1.

I dati sono rappresentativi della media più o meno l'errore standard della media di 14 trombi diversi in sette topi di tipo selvaggio, cinque minuti dopo un danno da laser. La dimensione del trombo piastrinico rimane relativamente costante durante l'acquisizione delle immagini, e i neutrofili rotolano e aderiscono al trombo. Il segnale fluorescente proveniente dalle piastrine circolanti è trascurabile.

Rispetto a quello del trombo piastrinico, dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come impostare il sistema di microscopia intravitale con topi vivi, permettendovi di visualizzare in tempo reale le interazioni eterotipiche tra piastrine e neutrofili sull'endotelio attivato all'interno della microvascolatura.