Name: Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per luso con sezionato espianti cerebrali corticali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Impara a isolare il liquido cerebrospinale embrionale da roditori per coltivare espianti corticali. Questo metodo permette di studiare i segnali di sviluppo cerebrale e le potenziali applicazioni terapeutiche.

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Siamo grati per il sostegno del NIH (numeri di aggiudicazione R00 NS072192 a MKL, HD029178 a AS.L., e 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL è il destinatario l&#39;Ospedale dei Bambini di Boston Career Development Fellowship / Harvard Fellowship Shore Medical School e membro della Alfred P. Sloan Foundation. CAW è un ricercatore del Howard Hughes Medical Institute.

1. Embryo Isolamento / Preparazione Questa tecnica può essere utilizzata per topo o ratto. In questo protocollo si dimostra la tecnica di raccolta QCS e cerebrale dissezione espianto corticale con cervello di topo embrionale. Ci osservazioni su eventuali differenze importanti rispetto a ratti topi che esistono all&#39;interno delle tecniche generali. Per il sistema embrionale stadiazione età, E1 è classificato come il giorno della spina di ratti, e E0.5 è classificato come il giorno della spina di topi. <ol><li> Preparare un micro-dissezione piatto con elastomero Sylgard silicone. Sylgard 184 elastomero di silicone viene fornito come parte liquida a due componenti, parte A e parte B. Parte sono mescolati A e B parte in un rapporto di 10:1 in peso o volume. Dopo che i componenti liquidi vengono miscelati, versa l&#39;elastomero Sylgard in una piastra di Petri a coprire l&#39;intera superficie del piatto. Alcune bolle d&#39;aria possono essere presenti che dissipare durante il processo di polimerizzazione. Mettere il coperchio sulla piastra di Petri e lasciare che il elastomer per curare. L&#39;elastomero può essere indurita a temperatura ambiente per 24 ore, oppure a temperature più elevate (per esempio 37 ° C) per una più rapida polimerizzazione. Una volta che i componenti liquidi solidificano, il piatto dissezione è pronto all&#39;uso. Il piatto può essere usato ripetutamente per esperimenti multipli, a condizione che sia ben pulita dopo la procedura. </li><li> Preparazione del micro-pipetta capillare (ago). Micro-pipette capillari vengono preparati mediante l&#39;applicazione di calore e tirare con un PC-10 verticale estrattore micropipetta Narishige con le seguenti impostazioni: Un tiro passo; Heater # 2 impostato a 58, 100 g di peso tiro. La punta fine della micropipetta è attentamente spense con pregiati N ° 55 pinze. Il risultante diametro medio interno della cannula è 85 micron. </li><li> Preparare il gruppo aspiratore per l&#39;aspirazione CSF. Inserire micro-stantuffo provvista di micro-pipette capillari nell&#39;ago capillare. In alternativa, collegare un filtro di plastica monouso per la fine del gruppo del tubo aspiratore che è collegato to la micro-pipetta capillare. Spingere l&#39;ago attraverso la guarnizione in posizione sul lato opposto del gruppo aspiratore. </li><li> Trasferimento di embrioni isolati dalla cucciolata di un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard. </li><li> Togliere le membrane extra-embrionali e tessuti in modo che l&#39;embrione è chiaramente esposta. Ogni strato di tessuto-prima la parete uterina e quindi la decidua, può essere sezionato con le forbici iridectomia fini (ad esempio strumenti per le scienze Belle # 15000-02). Ad ogni sito di impianto, la prima parete uterina, quindi la decidua può essere incisi parallelamente all&#39;asse lungo dell&#39;utero, e l&#39;incisione può essere aperto ulteriormente utilizzando una pinza sottile. La decidua può essere rimosso dopo un&#39;incisione simile, esponendo le membrane fetali. Si deve essere esercitato in modo che le membrane fetali non sono incise o perforato. </li><li> Lavare con soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta e un Kimwipe o filtrocarta tagliata in triangoli. </li></ol> 2. Collezione ventricolare CSF <ol><li> Visualizzare embrione al microscopio dissezione: per mouse, l&#39;embrione deve essere che sul suo lato, in modo tale che si ha una vista sagittale dell&#39;embrione. Con embrioni di ratto E16 o più, posizionare l&#39;embrione sulla sua colonna vertebrale dorsale, lungo il suo dimensione planare, da un cranio in direzione caudale, come se l&#39;embrione è sdraiato sulla schiena. In questo modo il CSF può essere raccolto sia da destra e sinistra ventricolo laterale. </li><li> Costantemente inserire la micro-pipetta capillare nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, tentando di non contattare le cellule neuroepiteliali volta la pipetta è stata inserita. Per E14.5 embrioni di topo o più, il CSF può essere aspirato dal ventricolo destro e quindi l&#39;ago rimosso e inserito nel ventricolo sinistro. A causa della pervietà dei ventricoli e il tubo neurale in embrioni più giovane di E14.5, ilintero volume del CSF può spesso essere aspirato dai ventricoli laterali con l&#39;inserimento di un ago singolo. Tuttavia, questo non è sempre il caso come tempi di sviluppo e la pervietà dei ventricoli collegamento può variare leggermente, e quindi, il micro-pipetta capillare può anche essere inserita nella cisterna magna per raccogliere il massimo volume CSF. </li><li> Una volta che il micro-pipetta capillare viene inserita nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, attenzione e delicatezza iniziare l&#39;aspirazione del CSF nella pipetta, utilizzando il micro-stantuffo per creare pressione negativa e aspirare il CSF, o fornendo una leggera pressione negativa creata per via orale in modo tale che CSF inizia a fluire dolcemente nel micro-pipetta capillare in modo lento e controllato. Si raccomanda che lo spettatore controlla con propri funzionari locali in materia di politiche istituzionali di questi approcci. </li><li> Continuare ad applicare pressione negativa e raccogliere il liquor nella micro-capillare pipetta.In entrambi embrioni di topo e ratto di E16.5/E17 o più giovane, è possibile osservare il collasso ventricolo leggermente dalla comparsa di un divot formando sul lato della testa che il micro-pipetta capillare è dentro In anziane embrioni, a causa della maggiore dimensione del cervello, potrebbe non essere possibile osservare la testa collasso. </li><li> Interrompere l&#39;applicazione di pressione e rimuovere delicatamente la micro-capillare pipetta dal ventricolo laterale. </li><li> Delicatamente espellere il campione CSF in una provetta Eppendorf che è stata raffreddata su ghiaccio. </li><li> Continua la raccolta del QCS da una intera cucciolata di animali e in comune i campioni nel tubo stesso. </li><li> Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C per 10 minuti per eliminare cellule contaminanti. </li><li> Analizzare i campioni per eventuali segni di contaminazione cellule neuroepiteliali o globuli rossi. I segni di contaminazione sono di solito indicati dal fluido che appare torbida o rosso / rosa, o la presenza di un pellet con una macchia di sangue tinta. Dopo centrifugazione, il CSF possono essere esaminate al microscopio per le prove di cellule o detriti cellulari. Se ci sono segni di contaminazione del fluido deve essere eliminato. Come controllo aggiuntivo, il contenuto di pellet possono essere colorati per cellule. Un campione pulito CSF ​​può essere usato per la coltura cellulare, cultura corticale, spettrometria, western blot, ELISA, saggi e altri. Il QCS chiara dovrebbe essere trasferito in una nuova provetta sterile Eppendorf. Il campione può essere utilizzato per l&#39;analisi, in pool con altri campioni o SNAP congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il congelamento e lo scongelamento di piccoli campioni di fluido può provocare una diminuzione piccolo volume e cambiamenti nella concentrazione di proteina. Ciò può essere evitato liofilizzazione dei campioni. </li></ol> 3. Espianto Dissection corticale <ol><li> Trasferire la E14.5 embrione isolato dalla cucciolata su un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard. </li><li> Rimuovere embrione da membrane extra-embrionali e tessuti, come descritto al punto 1.5. </li> &lt;li&gt; lavaggio con soluzione sterile salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta. </li><li> Sezionare attraverso la regione cervicale separa la testa dal resto dell&#39;embrione (Figura 1A). </li><li> Usando un bel bisturi (bisturi oftalmico), tagliare lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Afferrare entrambi i lati di questa incisione con una pinza sottile e togliere la pelle. Successivamente, usare le forbici iridectomia per fare un&#39;incisione che corre la lunghezza della linea mediana del cranio in via di sviluppo. Successivamente, fare due incisioni aggiuntivi, circa 1/3 della distanza fra le estremità anteriore e posteriore del cranio sviluppo. Utilizzare una pinza sottile di cogliere i &quot;lembi&quot; del cranio che derivano da questa parte della dissezione, e rimuovere il tessuto in via di sviluppo cranio, esponendo la corteccia (Figura 1B). </li><li> Utilizzo del bisect bisturi il cervello lungo la linea mediana a metà piano sagittale, che separa gli emisferi destro e sinistro corticali (figure1B, C). La pia e aracnoide sono lasciati aderenti alla corteccia, e la dura madre viene rimosso insieme con il cranio in via di sviluppo. </li><li> Preparare ogni emisfero corticale separatamente. Posizionare il lato mediale dell&#39;emisfero in modo che si può vedere l&#39;eminenza gangliare e la corteccia in via di sviluppo (figure 1 C, D). </li><li> Utilizzando il bisturi, fare una incisione coronale attraverso il neuroepitelio corticale caudale al bulbo olfattivo in via di sviluppo. Questa incisione dovrebbe iniziare al confine anteriore delle eminenze ganglionari mediale e laterale, e si estendono attraverso la regione cingolata anteriore del rudimento di sviluppo corticale (Figura 1E). </li><li> Fai un&#39;altra incisione coronale appena caudalmente al confine posteriore dell&#39;eminenza gangliare laterale (Figura 1F). Questa incisione dovrebbe estendersi anche dal limite laterale della eminenza gangliare alla parete mediale del rudimento di sviluppo corticale. </li><li> Ritrarre la corticale crea &quot;flap&quot;ta dalle due incisioni fatte a passi 3,7 e 3,8, con una leggera pressione bisturi o da un flusso di HBSS consegnati con una pipetta 200 pl per evitare danni meccanici alla corteccia. Poi fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l&#39;eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figure 1G, H). Poi, sezionare via di sviluppo e l&#39;ippocampo orlo corticale del telencefalo mediale, all&#39;apice della neocorteccia dove la superficie laterale e parete corticale interemisferica. </li><li> Fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l&#39;eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figura 1H). </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto sezionato supplementare che è sul piatto Sylgard dal espianto sezionato corticale. Si può usare pipettaggio gentile con tampone HBSS fresco per pipettare via qualsiasi tessuto sezionato in più. La corteccia è sezionato con il lato rivolto verso il basso meningea (Figura 1I). </li></ol><ol><li> Preparare un anello di filo di platino collegato ad una pipetta di vetro. Riscaldare la pipetta di vetro con un filo di platino ripiegato inserito nell&#39;estremità della pipetta di vetro. Ruotando la fine del ciclo filo di platino, la dimensione del ciclo può essere aumentato o diminuito, e il ciclo può essere sagomato per adattarsi alle dimensioni del espianto desiderato. (Questo può essere preparato in anticipo e riutilizzati.) </li><li> Riscaldare l&#39;estremità del filo di platino per sterilizzare il loop. </li><li> Isolare l&#39;espianto sezionato corticale e rimuovere il supporto HBSS supplementari pipettando dolce, lasciando una piccola quantità da utilizzare con il gancio di metallo. </li><li> Inserire un centimetro 1 membrana in policarbonato in un piatto di 4 cm di diametro di imaging. </li><li> Utilizzando il lato del cappio di filo di platino, capovolgere delicatamente la corteccia in modo che il lato rivolto verso l&#39;alto meningea. </li><li> Sollevare l&#39;espianto corticale fuori del piatto dissezione, ponendo l&#39;espianto a metà del ciclo e con le forze idrostatiche intrinsecisollevare l&#39;espianto su una superficie piana. </li><li> Delicatamente il espianto sulla membrana di policarbonato, e sollevare l&#39;anello del filo di platino distanza tale che l&#39;espianto rimane sulla membrana in piano con la superficie ventricolare fare contatto con la membrana. </li><li> Sollevare delicatamente la membrana e pipettare 50 pl di CSF o altri mezzi di comunicazione sotto la membrana. </li><li> Coprire il piatto di imaging, collocarlo in un contenitore umidificato secondaria, e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 24 ore a sostenere continua proliferazione cellulare e la crescita espianto. Figura 2 rappresenta uno schema della preparazione finale corticale piatto espianto. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Il metodo descritto per la raccolta ventricolare CSF ha prodotto campioni relativamente puri embrionale CSF con composizione proteica stabile e consistente attività in un certo numero di saggi cellulari 9. Con una tecnica buona raccolta e la prole di dieci E14.5 topi, ci si può aspettare di raccogliere 10-15 ml di CSF, e da una cucciolata di ratti E16, si può aspettare di raccogliere circa 50-90 ml di liquido cerebrospinale. Questa tecnica di raccolta minimizza la contaminazione da sangue e dei tessuti, attra...

Il QCS è un fluido complesso che bagna la neuroepitelio sviluppo 1-6 e offre 7 essenziali pressione e promuovere la crescita spunti per lo sviluppo del cervello 8-12. Per studiare il QCS nel corso dello sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato tecniche per isolare liquor ventricolare di sviluppare embrioni di ratto o il mouse durante le varie fasi di sviluppo 6,9. Metodi precedenti di isolamento incluso con una lente di micro-ago e isolamento del QCS con un micro-iniettore 1,2. Il nostro metodo utilizza un micro-capillare pipetta di vetro la cui punta è stato tirato per creare un punto ultrafine per la penetrazione nel tessuto migliore. Il micro-capillare pipetta di vetro è collegato ad un aspiratore modo che la raccolta liquor ventricolare può essere controllato con cambiamenti nella pressione dolci. Per studiare l&#39;influenza delle cellule staminali di segnali CSF, si sezionare cerebrali corticali espianti, disporle su membrane in policarbonato, e galleggiare li cu appropriatemedia lture integrato con campioni di CSF 9. Con questa tecnica, ridotti volumi di supporti sono sufficienti per la coltura tissutale, consentendo un uso efficiente di CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Wiretrop II aghi capillari </td><td> Drummond scientifico </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Adesivi Ellsworth </td><td> N ° 184 SIL ELAST kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspiratore gruppo del tubo </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Filtro usa e getta </td><td> Venturi o farmacia locale </td><td> non disponibile </td><td> Sigaretta filtro standard </td></tr><tr><td> Roundstock coltello oftalmico (15 coltello stab grado) </td><td> Mondo Strumenti di precisione, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35 millimetri di vetro a fondo piatto di cultura </td><td> MatTek Corp. </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platino-iridio filo </td><td> Tritech ricerca </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch membrana </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridectomia Forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l&#39;uso con sezionato espianti cerebrali corticali

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Il QCS è un fluido complesso con una proteoma varia dinamicamente durante tutto lo sviluppo e in età adulta. Durante lo sviluppo embrionale, il QCS nascente differenzia dal liquido amniotico alla chiusura del tubo neurale anteriore. Volume di CSF aumenta poi nei giorni successivi, come le cellule progenitrici neuroepiteliale che rivestono i ventricoli e del plesso coroide generate CSF. I contatti embrionali CSF apicale, superficie ventricolare delle cellule staminali neurali del cervello in via di sviluppo e il midollo spinale. CSF fornisce la pressione del fluido cruciale per l&#39;espansione del cervello sviluppo e distribuisce crescita importante promuovere fattori di cellule progenitrici neurali temporalmente in un modo specifico. Per studiare la funzione del CSF, è importante isolare campioni puri di embrionale CSF senza contaminazione da sangue o tessuto telencephalic sviluppo. Qui, si descrive una tecnica per isolare campioni relativamente puri ventricolare embrionale CSF che possono essere utilizzati perun&#39;ampia gamma di saggi sperimentali compresi spettrometria di massa, elettroforesi proteica, e coltura di cellule e espianto primaria. Dimostriamo come sezionare e cultura espianti corticali su membrane porose in policarbonato per crescere sviluppo del tessuto corticale con ridotti volumi di supporto o nel liquido cerebrospinale. Con questo metodo, gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando CSF ​​da varie età o condizioni per studiare l&#39;attività biologica del proteoma CSF sulle cellule bersaglio.

La raccolta CSF dovrebbe produrre un chiaro, fluido trasparente. Non ci dovrebbero essere tracce di contaminazione da sangue, come dimostrato da un fluido tinta rosso o giallo nell&#39;aspirato e nel tubo Eppendorf. Ci dovrebbe anche essere alcuna prova di tessuto in aspirazione e il tubo Eppendorf. Quando il CSF viene centrifugata, si può anche valutare la CSF microscopicamente per garantire che non vi è alcuna contaminazione. Se ci sono segni di contaminazione, il QCS deve essere eliminata. Da una cucciolata E14.5 il ...

Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell&#39;embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi di terreno di coltura o nel liquido cerebrospinale.

Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l&#39;uso con sezionato espianti cerebrali corticali

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare il ruolo dei segnali secreti nel liquor spinale embrionale (CSF) nello sviluppo della corteccia cerebrale. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il CSF embrionale per utilizzarlo come mezzo di coltura. Nei passaggi successivi, la parete corticale cerebrale in via di sviluppo viene dissezionata, posizionata su una membrana in policarbonato e messa a galleggiare sul CSF.I risultati mostrano che il liquido cefalorachidiano embrionale fornisce segnali indicativi alla corteccia cerebrale in via di sviluppo, in base all'analisi di espianti mediante colorazione immunos. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del liquido cefalorachidiano. Ad esempio, quali sono i componenti del liquido cefalorachidiano, quale ne è la funzione in diverse fasi dello sviluppo e, si spera, aiutare a determinarne un giorno l'utilizzo come veicolo terapeutico per le malattie neurodegenerative.È fondamentale che il liquor sia raccolto senza contaminazioni e che i danni al tessuto corticale espiantato siano ridotti al minimo. Queste procedure possono richiedere una notevole pratica poiché prevedono la manipolazione di piccoli tessuti con strumenti di dissezione molto fini. Iniziare preparando gli aghi per micropipetta.Ad esempio, su un micropipettatore verticale Orica PC 10, preparare micropipette capillari da 10 a 20 microlitri con le seguenti impostazioni: un tiraggio in un solo passaggio, riscaldatore numero due impostato a 58 e un peso di trazione di 100 grammi. Spezzare la punta fine della micropipetta utilizzando pinzette fini numero 55. Il diametro interno medio dell'ago risultante sarà di 85 micrometri.Successivamente, preparare l'insieme dell'aspiratore. Per l'aspirazione del liquido cefalorachidiano, inserire il micro stantuffo fornito insieme alle micropipette capillari nell'ago capillare. In alternativa, collegare un filtro monouso in plastica all'estremit&agrave; dell'insieme del tubo aspiratore che &egrave; connesso alla micropipetta capillare.Successivamente, all'estremità opposta dell'assemblaggio dell'aspiratore, spingere l'ago attraverso la guarnizione e posizionarlo. Trasferire ora un embrione isolato di topo o ratto in una piastra per microdissezione preparata con Sylgard. Lavare l'embrione con HBSS sterile ed eliminare il liquido circostante l'embrione mediante aspirazione e tamponamento con carta assorbente.Visualizzare l'embrione al microscopio stereoscopico. Se si tratta di un embrione di topo, deve essere posizionato sul fianco, in modo da ottenere una vista sagittale. Inserire ora con precisione la pipetta capillare microscopica nel ventricolo laterale o cefalico, nel ventricolo mesencefalico o nello sterno CI.Magna cercando di non entrare in contatto con le cellule neuroepiteliali. Una volta inserita la pipetta, inserire l'ago solo fino a quando il tessuto non viene perforato. A questo punto, aspirare con attenzione e delicatezza il LCS nella pipetta, utilizzando una leggera pressione negativa generata dal microstilo o dall'aspirazione orale.Il liquido cerebrospinale dovrebbe iniziare a fluire delicatamente nella pipetta micropipetta in modo lento e controllato. Continuare ad applicare una pressione negativa fino al completamento del prelievo. È fondamentale che il prelievo produca un liquido limpido e trasparente.Se si osserva qualsiasi segno di contaminazione da sangue, come ad esempio un colore rosso o giallo della soluzione, scartare il campione sia negli embrioni di topo che di ratto. Alla fase E16,5-E17 o precedente, è possibile osservare un leggero collasso del ventricolo nel punto in cui è posizionata la pipetta microcapillare. Quando il flusso di liquido cerebrospinale cessa a seguito di questo evento, rimuovere delicatamente la pipetta microcapillare.Successivamente, espellere delicatamente il campione di LCS raccolto in una provetta per microcentrifuga raffreddata su ghiaccio proveniente da una cucciolata di topi E 14,5. Si prevede di raccogliere tra 10 e 15 microlitri di LCS al termine di tutti i prelievi. Centrifugare la provetta a 10.000 ×g e a 4 °C per 10 minuti.Per rimuovere eventuali cellule contaminanti, trasferire il liquido cefalorachidiano chiaro in un nuovo tubo. L'esame al microscopio per rilevare contaminanti può essere eseguito ora, se ritenuto puro. Il campione può essere utilizzato per analisi, raggruppato con altri campioni oppure congelato rapidamente con azoto liquido e conservato a meno 80 gradi Celsius per raccogliere espianti corticali da utilizzare in esperimenti con terreni supplementati con liquido cefalorachidiano.In una piastra rivestita con sigaretta, esporre la corteccia di un embrione E 14,5. Rimuovere il dura insieme al cranio in via di sviluppo, lasciando però la pia e l'aracnoide attaccate alla corteccia mediante un bisturi. Dividere il cervello lungo il piano mediano nel piano midsagittale, separando gli emisferi corticali destro e sinistro.Preparare ciascun emisfero corticale separatamente. Posizionare l'emisfero con il lato mediale rivolto verso l'alto in modo da poter osservare l'eminenza gangliare e la corteccia in via di sviluppo. Utilizzando il bisturi, eseguire un'incisione coronale attraverso l'involucro neuroepiteliale corticale fino al bulbo olfattivo in via di sviluppo.Questa incisione deve iniziare al confine anteriore delle eminenze gangliari laterali e mediali ed estendersi attraverso la regione del cingolo anteriore dell'abbozzo corticale in via di sviluppo. Effettuare un'altra incisione coronale subito adiacente al confine posteriore dell'eminenza gangliare laterale. Questa incisione deve estendersi dal confine laterale dell'eminenza gangliare alla parete mediale dell'abbozzo corticale in via di sviluppo.Utilizzare il bisturi per ritrarre il lembo corticale creato dalle due incisioni. Questo riduce il rischio di danneggiare la corteccia. Procedere ora alla dissezione dell'ippocampo in via di sviluppo e dell'emisfero corticale dell'encefalo mediale.Eseguire questa operazione a partire dall'apice della neocorteccia, dove la superficie corticale laterale incontra la parete interemisferica. Successivamente, effettuare un'incisione trasversale lungo il confine che separa l'eminenza gangliare laterale dalla corteccia in via di sviluppo. Rimuovere eventuali tessuti aggiuntivi dissecati dalla piastra.La corteccia dissezionata è ora posizionata con il lato meningeale rivolto verso il basso. Per trasferire la corteccia, preparare un anello di filo di platino collegato a una pipetta di vetro utilizzando un becco di Bunsen per fondere l'estremità della pipetta sul filo di platino. Una volta assemblato, sterilizzare l'anello di filo di platino e lasciarlo raffreddare.Rimuovere con delicatezza il mezzo in eccesso intorno all'X explan mediante aspirazione. Lasciare una piccola quantità di soluzione da utilizzare con l'ansa di platino. Successivamente, posizionare una membrana in policarbonato di un centimetro di diametro in una piastra per imaging di quattro centimetri di diametro.Ora, utilizzando il bordo dell'ansa di filo di platino, capovolgere delicatamente la corteccia in modo che la faccia meningeale sia rivolta verso l'alto. Quindi posizionare l'explants X al centro dell'ansa e, sfruttando le forze idrostatiche intrinseche, sollevare l'explants corticale dalla piastra. Successivamente, posizionare delicatamente l'explants sulla membrana in policarbonato e rimuovere l'ansa di platino.Successivamente, caricare una pipetta con 50 microlitri di LCR o altro mezzo. Sollevare delicatamente la membrana e rilevare il mezzo sottostante. Ciao, coprire la piastra per imaging.Posizionarlo in un contenitore secondario umidificato e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per sostenere la proliferazione continua e la crescita dell'espianto, i volumi di raccolta del liquor (CSF) provenienti da dimensioni medie di nidiata sono stati calcolati sia per topi che per ratti provenienti da diverse età embrionali. Quando sono stati raccolti campioni puri di CSF, il liquor può essere analizzato mediante diverse tecniche, come ad esempio una colorazione argentica di pochi microgrammi.Questo CSF proviene da un topo E14,5. Espianti di 24 ore di età proliferati con CSF al 100% presentano un'istologia tissutale simile a quella degli embrioni di roditore alla stessa età gestazionale, come mostrato da colorazioni immunoistochimiche. pH tre.Un marcatore della divisione cellulare è espresso lungo la superficie ventricolare. La B-R-D-U, un marcatore della sintesi del DNA, mostra inoltre l'incorporazione lungo la zona ventricolare. E T uj uno, un marcatore neuronale, è espresso nella lamina corticale in via di sviluppo.Prima di eseguire queste procedure, è importante verificare le politiche istituzionali relative alle tecniche da noi dimostrate. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare i segnali secreti all'interno del liquido cerebrospinale (CSF) nell'istruire il ruolo della corteccia cerebrale durante lo sviluppo in vitro.

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