Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l'uso con sezionato espianti cerebrali corticali
11 marzo 2013
Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell'embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi di terreno di coltura o nel liquido cerebrospinale.<
L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare il ruolo dei segnali secreti nel liquor spinale embrionale (CSF) nello sviluppo della corteccia cerebrale. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il CSF embrionale per utilizzarlo come mezzo di coltura. Nei passaggi successivi, la parete corticale cerebrale in via di sviluppo viene dissezionata, posizionata su una membrana in policarbonato e messa a galleggiare sul CSF.
I risultati mostrano che il liquido cefalorachidiano embrionale fornisce segnali indicativi alla corteccia cerebrale in via di sviluppo, in base all'analisi di espianti mediante colorazione immunos. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del liquido cefalorachidiano. Ad esempio, quali sono i componenti del liquido cefalorachidiano, quale ne è la funzione in diverse fasi dello sviluppo e, si spera, aiutare a determinarne un giorno l'utilizzo come veicolo terapeutico per le malattie neurodegenerative.
È fondamentale che il liquor sia raccolto senza contaminazioni e che i danni al tessuto corticale espiantato siano ridotti al minimo. Queste procedure possono richiedere una notevole pratica poiché prevedono la manipolazione di piccoli tessuti con strumenti di dissezione molto fini. Iniziare preparando gli aghi per micropipetta.
Ad esempio, su un micropipettatore verticale Orica PC 10, preparare micropipette capillari da 10 a 20 microlitri con le seguenti impostazioni: un tiraggio in un solo passaggio, riscaldatore numero due impostato a 58 e un peso di trazione di 100 grammi. Spezzare la punta fine della micropipetta utilizzando pinzette fini numero 55. Il diametro interno medio dell'ago risultante sarà di 85 micrometri.
Successivamente, preparare l'insieme dell'aspiratore. Per l'aspirazione del liquido cefalorachidiano, inserire il micro stantuffo fornito insieme alle micropipette capillari nell'ago capillare. In alternativa, collegare un filtro monouso in plastica all'estremità dell'insieme del tubo aspiratore che è connesso alla micropipetta capillare.
Successivamente, all'estremità opposta dell'assemblaggio dell'aspiratore, spingere l'ago attraverso la guarnizione e posizionarlo. Trasferire ora un embrione isolato di topo o ratto in una piastra per microdissezione preparata con Sylgard. Lavare l'embrione con HBSS sterile ed eliminare il liquido circostante l'embrione mediante aspirazione e tamponamento con carta assorbente.
Visualizzare l'embrione al microscopio stereoscopico. Se si tratta di un embrione di topo, deve essere posizionato sul fianco, in modo da ottenere una vista sagittale. Inserire ora con precisione la pipetta capillare microscopica nel ventricolo laterale o cefalico, nel ventricolo mesencefalico o nello sterno CI.
Magna cercando di non entrare in contatto con le cellule neuroepiteliali. Una volta inserita la pipetta, inserire l'ago solo fino a quando il tessuto non viene perforato. A questo punto, aspirare con attenzione e delicatezza il LCS nella pipetta, utilizzando una leggera pressione negativa generata dal microstilo o dall'aspirazione orale.
Il liquido cerebrospinale dovrebbe iniziare a fluire delicatamente nella pipetta micropipetta in modo lento e controllato. Continuare ad applicare una pressione negativa fino al completamento del prelievo. È fondamentale che il prelievo produca un liquido limpido e trasparente.
Se si osserva qualsiasi segno di contaminazione da sangue, come ad esempio un colore rosso o giallo della soluzione, scartare il campione sia negli embrioni di topo che di ratto. Alla fase E16,5-E17 o precedente, è possibile osservare un leggero collasso del ventricolo nel punto in cui è posizionata la pipetta microcapillare. Quando il flusso di liquido cerebrospinale cessa a seguito di questo evento, rimuovere delicatamente la pipetta microcapillare.
Successivamente, espellere delicatamente il campione di LCS raccolto in una provetta per microcentrifuga raffreddata su ghiaccio proveniente da una cucciolata di topi E 14,5. Si prevede di raccogliere tra 10 e 15 microlitri di LCS al termine di tutti i prelievi. Centrifugare la provetta a 10.000 ×g e a 4 °C per 10 minuti.
Per rimuovere eventuali cellule contaminanti, trasferire il liquido cefalorachidiano chiaro in un nuovo tubo. L'esame al microscopio per rilevare contaminanti può essere eseguito ora, se ritenuto puro. Il campione può essere utilizzato per analisi, raggruppato con altri campioni oppure congelato rapidamente con azoto liquido e conservato a meno 80 gradi Celsius per raccogliere espianti corticali da utilizzare in esperimenti con terreni supplementati con liquido cefalorachidiano.
In una piastra rivestita con sigaretta, esporre la corteccia di un embrione E 14,5. Rimuovere il dura insieme al cranio in via di sviluppo, lasciando però la pia e l'aracnoide attaccate alla corteccia mediante un bisturi. Dividere il cervello lungo il piano mediano nel piano midsagittale, separando gli emisferi corticali destro e sinistro.
Preparare ciascun emisfero corticale separatamente. Posizionare l'emisfero con il lato mediale rivolto verso l'alto in modo da poter osservare l'eminenza gangliare e la corteccia in via di sviluppo. Utilizzando il bisturi, eseguire un'incisione coronale attraverso l'involucro neuroepiteliale corticale fino al bulbo olfattivo in via di sviluppo.
Questa incisione deve iniziare al confine anteriore delle eminenze gangliari laterali e mediali ed estendersi attraverso la regione del cingolo anteriore dell'abbozzo corticale in via di sviluppo. Effettuare un'altra incisione coronale subito adiacente al confine posteriore dell'eminenza gangliare laterale. Questa incisione deve estendersi dal confine laterale dell'eminenza gangliare alla parete mediale dell'abbozzo corticale in via di sviluppo.
Utilizzare il bisturi per ritrarre il lembo corticale creato dalle due incisioni. Questo riduce il rischio di danneggiare la corteccia. Procedere ora alla dissezione dell'ippocampo in via di sviluppo e dell'emisfero corticale dell'encefalo mediale.
Eseguire questa operazione a partire dall'apice della neocorteccia, dove la superficie corticale laterale incontra la parete interemisferica. Successivamente, effettuare un'incisione trasversale lungo il confine che separa l'eminenza gangliare laterale dalla corteccia in via di sviluppo. Rimuovere eventuali tessuti aggiuntivi dissecati dalla piastra.
La corteccia dissezionata è ora posizionata con il lato meningeale rivolto verso il basso. Per trasferire la corteccia, preparare un anello di filo di platino collegato a una pipetta di vetro utilizzando un becco di Bunsen per fondere l'estremità della pipetta sul filo di platino. Una volta assemblato, sterilizzare l'anello di filo di platino e lasciarlo raffreddare.
Rimuovere con delicatezza il mezzo in eccesso intorno all'X explan mediante aspirazione. Lasciare una piccola quantità di soluzione da utilizzare con l'ansa di platino. Successivamente, posizionare una membrana in policarbonato di un centimetro di diametro in una piastra per imaging di quattro centimetri di diametro.
Ora, utilizzando il bordo dell'ansa di filo di platino, capovolgere delicatamente la corteccia in modo che la faccia meningeale sia rivolta verso l'alto. Quindi posizionare l'explants X al centro dell'ansa e, sfruttando le forze idrostatiche intrinseche, sollevare l'explants corticale dalla piastra. Successivamente, posizionare delicatamente l'explants sulla membrana in policarbonato e rimuovere l'ansa di platino.
Successivamente, caricare una pipetta con 50 microlitri di LCR o altro mezzo. Sollevare delicatamente la membrana e rilevare il mezzo sottostante. Ciao, coprire la piastra per imaging.
Posizionarlo in un contenitore secondario umidificato e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore. Per sostenere la proliferazione continua e la crescita dell'espianto, i volumi di raccolta del liquor (CSF) provenienti da dimensioni medie di nidiata sono stati calcolati sia per topi che per ratti provenienti da diverse età embrionali. Quando sono stati raccolti campioni puri di CSF, il liquor può essere analizzato mediante diverse tecniche, come ad esempio una colorazione argentica di pochi microgrammi.
Questo CSF proviene da un topo E14,5. Espianti di 24 ore di età proliferati con CSF al 100% presentano un'istologia tissutale simile a quella degli embrioni di roditore alla stessa età gestazionale, come mostrato da colorazioni immunoistochimiche. pH tre.
Un marcatore della divisione cellulare è espresso lungo la superficie ventricolare. La B-R-D-U, un marcatore della sintesi del DNA, mostra inoltre l'incorporazione lungo la zona ventricolare. E T uj uno, un marcatore neuronale, è espresso nella lamina corticale in via di sviluppo.
Prima di eseguire queste procedure, è importante verificare le politiche istituzionali relative alle tecniche da noi dimostrate. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per studiare i segnali secreti all'interno del liquido cerebrospinale (CSF) nell'istruire il ruolo della corteccia cerebrale durante lo sviluppo in vitro.
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Panoramica
Questo studio analizza il ruolo del liquido cerebrospinale (CSF) embrionale nello sviluppo della corteccia cerebrale. Viene descritto il metodo per isolare il CSF ventricolare dagli embrioni di roditore, insieme a una tecnica per la coltura di espianti della corteccia cerebrale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Tecniche di coltura cellulare
Sfondo
- Il liquido cerebrospinale (CSF) bagna le cellule neuroepiteliali e progenitrici durante le prime fasi dello sviluppo cerebrale.
- Comprendere la funzione biologica del CSF è fondamentale per ottenere informazioni sullo sviluppo cerebrale.
- L'isolamento del CSF può facilitare studi sui suoi componenti e sui suoi ruoli.
- Gli espianti possono essere utilizzati per analizzare gli effetti del CSF sullo sviluppo corticale.
Scopo dello studio
- Isolare il liquido cefalorachidiano embrionale da utilizzare come mezzo di coltura.
- Indagare i segnali induttivi forniti dal liquido cefalorachidiano alla corteccia cerebrale in via di sviluppo.
- Esplorare possibili applicazioni terapeutiche del liquido cefalorachidiano nelle malattie neurodegenerative.
Metodi Utilizzati
- Isolamento del liquido cerebrospinale ventricolare da embrioni di roditore.
- Dissezione della parete corticale cerebrale in via di sviluppo.
- Coltura di espianti su membrane di policarbonato.
- Analisi mediante immunomarcatura degli espianti per valutare gli effetti del liquido cerebrospinale.
Risultati principali
- Il liquido cefalorachidiano embrionale fornisce segnali indicativi per lo sviluppo della corteccia.
- L'analisi degli espianti rivela i componenti e le funzioni del liquido cefalorachidiano.
- Il metodo sviluppato può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del liquido cefalorachidiano.
- Viene evidenziato il potenziale del liquido cefalorachidiano come veicolo terapeutico.
Conclusioni
- Lo studio migliora la comprensione del ruolo del liquido cerebrospinale nello sviluppo del cervello.
- Il liquido cerebrospinale isolato può rappresentare uno strumento prezioso per future ricerche.
- I risultati potrebbero portare a nuove strategie terapeutiche per le malattie neurodegenerative.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di un liquido cerebrospinale (CSF) embrionale puro consente la riduzione dei rischi meccanicistici nella validazione di bersagli neurosviluppali, fornendo un microambiente definito e fisiologicamente rilevante. Questo approccio sostiene la previsione affidabile degli effetti segnalanti derivati dal CSF sulle cellule progenitrici corticali, orientando le decisioni iniziali della fase di scoperta. Il metodo favorisce una continuità traslazionale dalla scoperta alla valutazione preclinica del CSF come potenziale veicolo terapeutico per disturbi neurodegenerativi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei componenti del proteoma del liquor cerebrospinale come segnali indicativi per lo sviluppo corticale.
- Valore operativo: Fornisce una fonte di fluido esente da contaminazioni per saggi funzionali di validazione di bersagli.
- Valore scientifico: Supporta la riduzione del rischio biologico isolando gli effetti del liquor cerebrospinale sulla proliferazione e differenziazione dei progenitori neurali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara liquido cerebrospinale (CSF) validato per saggi standardizzati che misurano le risposte di espianti corticali.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso volumi definiti di raccolta del CSF e protocolli di centrifugazione.
- Valore scientifico: Permette letture quantitative mediante immunomarcatura di marcatori di proliferazione e neuronali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la continuità del sistema rilevante per la patologia utilizzando liquido cefalorachidiano (CSF) proveniente da specifici stadi embrionali.
- Valore operativo: Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio mediante l'analisi del CSF e la correlazione con l'istologia dell'espianto.
- Valore scientifico: Facilita la riduzione del rischio meccanicistica del CSF come veicolo terapeutico per condizioni neurodegenerative.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo di isolamento del liquor e di coltura di espianti corticali si integra nei flussi di lavoro di scoperta precoce, consentendo la verifica di ipotesi sui percorsi di segnalazione del liquor prima degli sforzi di identificazione dei composti guida.
- Biologia della scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi isolando il LCS ventricolare per testarne gli effetti sul neuroepitelio corticale.
- Screening: Fornisce LCS pronto per i saggi con output quantitativi per la valutazione di composti o fattori.
- Analisi: Genera parametri misurabili, inclusi la proliferazione (BrdU) e l'espressione dei marcatori neuronali (TuJ1).
- Ricerca traslazionale: Collega l'analisi della composizione del LCS alla continuità preclinica attraverso modelli a espianto abbinati allo stadio.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'isolamento del LCS, utile per la validazione iterativa di diversi bersagli nello sviluppo neurologico.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nei meccanismi di sviluppo corticale mediati dal liquido cerebrospinale.
- Valore operativo: Raccolta standardizzata e riproducibile del liquido cerebrospinale, con riduzione della variabilità biologica.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo di terapie mirate al liquido cerebrospinale, grazie a una riduzione precoce dei rischi.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione dei candidati terapeutici basati sul liquido cerebrospinale, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nelle tecniche di microchirurgia e di aspirazione del liquor cerebrospinale ventricolare.
- Strumentazione comprendente tiratore di micropipette, dispositivo di aspirazione e microscopio per dissezione.
- Standardizzazione dei volumi di raccolta del liquor cerebrospinale e dei protocolli di valutazione della contaminazione.
- Considerazioni sull’adattamento della procedura di isolamento del liquor cerebrospinale negli embrioni di ratto rispetto a quelli di topo.
- Limitazioni pratiche, tra cui la variabilità del rendimento del liquor cerebrospinale e il rischio di danneggiamento dei tessuti durante la dissezione.
