Valutare fenotipi neurodegenerative Drosophila Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la neurodegenerazione dei neuroni dopaminergici nella drosofila transgenica. Ciò si ottiene esprimendo prima i transgeni desiderati sotto il controllo del promotore della tirosina idrossilasi tramite il sistema GAL four UAS. Il secondo passo della procedura consiste nel raccogliere mosche del genotipo desiderato, separarle per sesso ed invecchiarle.

Il terzo passo consiste nel testare l'attività di arrampicata delle mosche con l'asse geografico negativo man mano che invecchiano. Il passo finale consiste nel contare il numero di neuroni dopaminergici provenienti da cervelli sezionati raccolti a diverse età. In definitiva, i risultati mostreranno cambiamenti nel comportamento locomotorio dell'animale e nelle dimensioni della loro popolazione di neuroni dopaminergici.

Le implicazioni di questo approccio si estendono alla terapia di malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson. Questo approccio può aiutare a identificare i geni neuroprotettivi e gli interventi farmacologici Per impostare il test, selezionare moscerini di pari età dei genotipi desiderati. Separali per sesso e raggruppali casualmente in coorti da 20 a 30 animali.

Ogni coorte rappresenta un campione statistico. Mantenere le coorti su un ciclo di luce-buio di 12 ore per controllare gli effetti dei ritmi circadiani sul comportamento locomotorio e a una temperatura che può essere replicata nella sala prove. Cambia le fiale della coorte ogni due o tre giorni e testatele settimanalmente a un orario costante.

30 minuti prima del test, anestetizzare ogni coorte con anidride carbonica e trasferirla in una provetta di plastica etichettata ricavata da fiale di cibo vuote unite con nastro adesivo. I moscerini dovrebbero essere svegli dopo 5-10 minuti, ma il recupero completo dall'anestesia varia con l'età e il genotipo e deve essere ottimizzato. Ora. Creare una scala di altezza da visualizzare dietro le fiale di test.

Segna le distanze tra uno e 20 centimetri su un foglio di carta bianco. Quindi fissare la bilancia in posizione. Ora allinea i tubi da testare contro la scala a circa 20-30 centimetri di distanza.

Posizionare una fotocamera digitale con una vista quadrata delle fiale. Assicurarsi che le etichette sui tubi e la scala siano ben visibili. Una volta posizionato, avviare la registrazione e avviare un timer digitale.

Ora tocca un tubo per alcuni secondi. Tutte le mosche dovrebbero raccogliere il fondo del tubo. Assicurati di eseguire questo passaggio in modo coerente con la stessa durata e la stessa forza durante l'intero esperimento.

Dopo un minuto, ripeti nuovamente l'atterramento per la seconda di 15 prove consecutive. Quando tutte le 15 prove sono state completate, riporta le mosche in fiale fresche ispezionando visivamente i filmati. Per ciascuna delle 15 prove eseguite per coorte, contare il numero di mosche al di sopra dei due centimetri.

Dopo che sono trascorsi 10 secondi, il segno dei due centimetri viene determinato empiricamente, è la distanza che tutti i controlli attraversano dopo 10 secondi in molte delle età in esame. Prendi il punteggio medio delle 15 prove ed esprimilo come percentuale dei membri della coorte che hanno superato il segno. Il numero di ripetizioni statistiche è uguale al numero di coorti testate per ciascun gruppo, non dai 15 studi.

Valutare la significatività statistica tra i diversi genotipi utilizzando il T-test, l'anova o altri metodi di analisi appropriati di uno studente. Metti le mosche in una capsula di dissezione con etanolo al 70% per circa un minuto. Per rimuovere la cera per cuticole.

Quindi trasferisci le mosche in un'altra capsula di dissezione riempita con PBS ghiacciato e procedi con la dissezione del cervello. Posiziona la mosca con il lato ventrale rivolto verso l'alto e, facoltativamente, rimuovi le ali e le zampe. Usa un paio di pinze per tenere il corpo e un altro per tenere la cuticola sotto l'occhio.

Quindi allontanare la testa dal corpo. Quindi, rimuovi i probos estraendoli dalla testa. Quindi afferrare la cuticola della testa sui bordi opposti del nuovo foro e tirare in direzioni opposte fino a quando il cervello non viene rimosso dalla capsula della testa.

Ora delicatamente, rimuovi la cuticola rimanente dalla superficie del cervello. Quindi rimuovere tutto il tessuto tracheale pieno d'aria. Ciò impedirà al cervello di fluttuare durante le successive fasi di incubazione.

Preparare una pipetta per la manipolazione del cervello da un puntale per pipetta P 200. Tagliate qualche millimetro ed equilibratelo con Triton X 100 allo 0,1% in PBS. Trasferire il cervello in una provetta da mezzo millilitro completamente riempita con il 4% di PFA in PBS.

Fissare il cervello a temperatura ambiente per 20 minuti con una leggera rotazione. Dopo 20 minuti, utilizzare una pipetta P 1000 per sostituire il fissativo con mezzo millilitro di tampone di lavaggio allo 0,1% di Triton X 100 in PBS. Mescolare per inversione e lasciare incubare il cervello per un minuto prima di sostituire il tampone di lavaggio.

Dopo un minuto, sostituire il tampone di lavaggio una seconda volta e incubare il cervello a temperatura ambiente per 20 minuti. Quindi sostituire il tampone di lavaggio per la terza volta e incubare il cervello per altri 20 minuti. Ora, rimuovi il tampone di lavaggio e lascia incubare il cervello in mezzo millimetro di tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo un'ora, aggiungere una diluizione da uno a 100 di anticorpi antit in soluzione bloccante. Lasciarlo incubare per due giorni a quattro gradi Celsius con una leggera rotazione. Per rimuovere il blocco, ripetere i lavaggi utilizzati per rimuovere il fissaggio.

Quindi equilibrare il cervello con mezzo millilitro di diluizione da uno a 200 di anticorpo secondario in soluzione bloccante per due giorni a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata. Pochi giorni dopo, rimuovere l'anticorpo secondario utilizzando la stessa procedura di lavaggio. Per preparare le slitte di montaggio, aggiungere 2 gocce da 25 microlitri di supporto di montaggio a un vetro di copertura.

Posizionare due vetri di copertura sul supporto di montaggio con uno spazio vuoto al centro. Lasciare asciugare i vetrini. Se la larghezza del vetrino di montaggio non si adatta al tavolino del microscopio confocale, utilizzare lo smalto per unghie per fissare un vetrino coprioggetti di 22 x 22 millimetri al vetrino in modo che si adatti correttamente.

Ora sostituisci la soluzione in cui si trovano i cervelli con 50 microlitri di terreno di montaggio. Equilibrare il cervello con il terreno di montaggio pipettandolo con un puntale P 200 tagliato. Quindi, usa una punta tagliata a 200 m per trasferire il cervello nella trincea.

Nella diapositiva di montaggio, orientare il cervello per visualizzare il lato anteriore o posteriore. Quindi coprili con un vetrino coprioggetti numero 1,5 e da un angolo, riempi lo spazio tra i vetri di copertura con un supporto di montaggio per rimuovere tutta l'aria. Lasciare asciugare i vetrini e poi sigillarli con smalto prima del loro esame.

L'alfa-sinucleina umana è stata espressa nei neuroni DA utilizzando il quattro driver TH GAL nel saggio di arrampicata. I maschi che esprimono questo transgene hanno mostrato un declino accelerato rispetto ai controlli di pari età e a volare come coex che esprime il partner di legame NRF 2D NA. Le femmine di Math S hanno mostrato risultati simili confrontando i moscerini maschi di quattro settimane di genotipi diversi.

La conta dei neuroni DA basata sull'immunofluorescenza è stata utilizzata per quantificare il numero di neuroni PPL uno. Una piccola ma significativa perdita di neuroni PPL 1 è stata riscontrata nei moscerini che esprimono alfa-sinucleina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la neurodegenerazione dei neuroni varg negli zoa transgenici mediante saggi CLA e immunofluorescenza tirosina aasi.

Grazie per l'attenzione.