Name: Metodo ex vivo per limaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Impara un metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione della motilità ciliare negli epiteli delle vie aeree di roditori. Questa tecnica consente analisi quantitative della frequenza battito ciliare e del flusso generato in Mus musculus.

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Il progetto è stato sostenuto da NIH concedere U01HL098180 dal National Heart, Lung, and Blood Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Heart, Lung, and Blood Institute e il National Institutes of Health

1. Setup Reagenti 1.1 Dissezione e immagini Media L-15 Leibovitz (L15) è completato con FBS (10%) e penicillina-streptomicina (100 unità / ml di penicillina G sodica e 100 pg / ml di streptomicina solfato) è usato sia durante il raccolto e di imaging di campioni trachea. 2. Shallow Walled Cultura della Camera dell&#39;Assemblea La camera utilizzato per contenere trachea tessuto è mostrato in Figura 1. Il pavimento della camera è il fondo di vetro 35 millimetri capsula di Petri. La parte superiore e laterale della camera è generato mettendo un piccolo pezzo di 0,3 mm di spessore fogli silicone sopra il piatto di vetro. Il bordo del foglio è tagliato per adattarsi al piatto fondo rotondo ed il centro è ulteriormente tagliato per formare una camera centrale poco profonda (vedere i punti 2.1-2.3). In cima a questa assemblea, un vetrino di vetro 18 millimetri rotonda è posto per generare un ambiente avente adatto per l&#39;imaging. <ol><li> Coprire completamente il vetrino in vetro mm 18 round con un quadrato di 0,3 mm di spessore rivestimento di silicone. </li><li> Con forbici normali dissezione netta tagliare il telone di silicone in eccesso intorno al bordo del vetrino (risultante in uno strato circolare di fogli di silicone). </li><li> Con un bisturi affilato tagliare e rimuovere una piazza centrale di fogli di silicone (circa 10 mm quadrati) dal centro del vetrino coperto (formando così la parte superiore e sui lati della camera di imaging). </li></ol> 3. Trachea Raccolta e Preparazione <ol><li> Euthanize topi secondo locale la cura degli animali istituzionale e utilizzare comitato e / o linee guida governative e rimuovere trachea in plastica 35 millimetri capsula di Petri standard abbastanza L15 supporto al tessuto sommergere (autori hanno usato topi appena prima della nascita al giorno di gestazione 16.5, fino alla appena nati, neonatale e adulto animali 2). </li><li> Rimuovere non trachea corrispondente tessuto applicata all&#39;esterno dila trachea utilizzando dissezione smussa. </li><li> Rimuovere la laringe con un taglio trasversale appena sotto la cartilagine cricoide usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 1). </li><li> Rimuovere i rami bronchiali principali destro e sinistro con un taglio trasversale appena sopra la carena usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 2). </li><li> Premere delicatamente la trachea con una pinza sottile e lavare il lume 2-3 volte con circa 1 ml di balneazione L15 mezzo con un P1000 e P1000 Pipetman punta a cancellare qualsiasi muco e sangue. </li><li> Tagliare un segmento di anello 3-4 di trachea utilizzando un taglio trasversale con micro forbici dissezione (Figura 2B, linea 1). </li><li> Tagliare longitudinalmente attraverso il centro del muscolo trachealis di questo breve segmento trachea usando forbici micro dissezione (Figura 2B, linea 2). </li><li> Tagliare longitudinalmente attraverso il centro degli anelli di cartilagine tracheale con micro forbici dissezione (Figura 2C </strong&gt;, riga), lasciando due sezioni di trachea tessuto adatto per l&#39;imaging (sezione singolo illustrato nella Figura 2D). </li></ol> 4. Cilia Imaging <ol><li> Trasferimento segmenti di tessuto trachea, lato lumen giù, sul centro di un mm con fondo di vetro piatto 35 cultura con 100-200 ml di L-15. </li><li> Per quantificare cilia flusso generato aggiungere una piccola quantità di microsfere fluorescenti 0,20 ìm alla L-15 bagnando il campione di tessuto trachea (~ 1 x 10 11 particelle / ml o 20 microlitri / ml della Fluoresbrite 2,5% sospensione acquosa microsfere). </li><li> Posizionare la camera di imaging preparato precedentemente (vedere Procedura di 1-3 sopra) in cima alla trachea campione silicone lato del foglio in basso, con il campione trachea situato nel centro della camera murato superficiale formata dal taglio finestra nella lastra di silicone (figura 1 ). </li><li> Premere delicatamente sul vetrino per fissare in posizione e rimuovere qualsiasi eccesso di L-15 supporti dai bordi usinga P1000 e P1000 punta Pipetman. </li><li> Montare il fondo di vetro cultura piatto 35 millimetri e il campione trachea su un microscopio invertito con ottica 100X oggettivi e DIC. </li><li> Utilizzando una macchina fotografica ad alta velocità e il software di acquisizione filmato raccoglie i film di ciglia motilità a + 200 fotogrammi al secondo lungo il ciliato epiteli tracheale del raggomitolati bordo del muscolo trachealis (box, e figura 2D Delineato: esempio ancora immagine da filmato registrato) (Movie supplementare 1). </li><li> Utilizzando FITC immagini epifluorescente e una luce CCD basso (Vedi elenco delle attrezzature di cui sopra), raccogliere i film di movimento microsfere fluorescenti sulla superficie degli epiteli tracheale ciliato per consentire successivamente la quantificazione delle ciglia flow generato (Movie integrativa 2). </li></ol> 5. Quantificazione di Cilia Motilità <ol><li> Caricare DIC film imaged nel pacchetto software ImageJ e seguendo la tecnica descritta da Iain Drummond 13 utilizzare lo strumento linea per tracciare una linea di trama che attraversa le ciglia battere. A &quot;reslice&quot; di questa linea genera un immagine tipo chimografo dove il movimento delle ciglia tutta la linea genera un modello di onda. Il numero di pixel tra ogni picco dell&#39;onda è li misurati (un pixel = un fotogramma filmato) da cui è possibile calcolare il numero di battiti al minuto (cioè Hz). </li><li> Per misurare ciglia generato flussi di carico fluorescenti film tallone nel pacchetto software ImageJ, e usare il plugin MTrackJ 14 per tenere traccia manualmente perline fluorescenti sulla superficie della trachea epiteli e lasciare che il software genera velocità di perline e direzionalità per ciascuna sfera rintracciato. </li></ol> Si deve prestare attenzione quando si utilizza perline fluorescenti per quantificare il flusso come la distanza tra le ciglia battere può influenzare fortemente il flusso misurato grandezza. Il movimento del tallone in Supplemental Movie 2 è un buon esempio di questo. In questo esempio beadmovimento è veloce alla superficie delle ciglia battere e riduce notevolmente spento per perline più lontano nei media balneazione. Per controllare per questo, perline tracciati dovrebbero essere raccolti solo ad una distanza fissa sopra la epiteli ciliato in tutti i campioni per permettere una comparazione corretta da fare. Infine, per ottenere dati rappresentativi sul flusso del fluido, sfere dovrebbero essere monitorati a lungo possibile, preferiamo usare tracce tallone che coprono 10 + cellule ciliate per calcolare il flusso del fluido.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Misura della frequenza del battito delle ciglia (CBF) è relativamente facile usando obiettivi del microscopio ad alta potenza e le immagini veloce acquisizione hardware 13,15, e spiega perché le misure CBF sono alla base della maggior parte degli studi indagano clearance mucociliare durante la salute e la malattia. Tuttavia, mentre la misurazione CBF è essenziale per comprendere la clearance mucociliare, la misurazione della CBF solo ignora l&#39;importanza di fondo di entrambi i flussi generati ciliare e cig...

Analisi della funzione di cilia motili nella epiteli delle vie aeree è sperimentalmente importanti per la comprensione dei fattori genetici e ambientali che possono influenzare la clearance mucociliare e la salute polmonare 1. La semplice protocollo sviluppato per l&#39;imaging del mouse epiteli delle vie aeree fornisce un metodo efficiente per interrogare vie respiratorie ciglia motilità nei modelli mutanti e knockout topo e richiedono solo competenze di base in topo tracheale dissezione dei tessuti ed ex imaging in vivo di vie ciglia motilità con videomicroscopia alta risoluzione. Questo protocollo è stato istituito e perfezionato nel corso di una schermata di mutagenesi del mouse su larga scala per consentire una rapida valutazione della funzione delle ciglia mobili (cilia frequenza del battito, forma battito delle ciglia, ciglia flusso generato) in mutanti con cardiopatia congenita associata a heterotaxy 2-5. Le attuali tecniche utilizzate per lo studio delle vie respiratorie ciglia motilità possono essere raggruppati in due l&#39;ex vivo tipo acuto o lontermine ger in approcci sperimentali in vitro. Esperimenti acuti includono ex vivo di visualizzazione nasali / vie aeree biopsie spazzola umani 6,7 e analisi di semplici sezioni trasversali 8 vie respiratorie. Gli approcci in vitro utilizzano varie tecniche di coltura cellulare per produrre fogli di differenziata epiteli ciliato, come nelle culture di interfaccia Liquid Air o respiratori sospensione culture 9-11. Tuttavia, queste vie respiratorie epiteli tecniche reciliation richiedono investimenti molto significativo nel tempo e la formazione prima di tutte le cellule epiteliali ciliate utilizzabili sono prodotte per la sperimentazione (4-6 settimane 9,10). Mentre acuta analisi ex vivo delle vie respiratorie epiteliali biopsie pennello sono comunemente utilizzati per gli studi clinici umani, questo metodo non è utilizzabile in studi del mouse a causa di lesioni aggravate tessuto meccanico 12. La tecnica descritta in questo protocollo per l&#39;analisi del moustracheale e vie aeree epiteli non è solo semplice da eseguire, ma non richiede particolari doti dissezione né le attrezzature specializzate, oltre a quelli standard per l&#39;imaging da videomicroscopia. Ci sono molti vantaggi a questo semplice protocollo. Prima, come mouse trachea raccolta dei tessuti è rapida e facile da eseguire, esso consente la rapida valutazione della funzione cilia vie aeree in un gran numero di topi. Questo può includere analisi acuta degli effetti a breve termine diversi trattamenti in vitro. Secondo, essendo una tecnica ex vivo, l&#39;epitelio ciliato vie respiratorie rimane attaccata ad esso sottostanti tessuti di sostegno e conservano quindi associate percorsi di segnalazione cellulare. Quindi in confronto a in vitro reciliated epiteli delle vie aeree, questa preparazione è una migliore rappresentazione del naturale in ambiente tessuto vivo. Terzo, questo protocollo permette l&#39;acquisizione di una serie di parametri quantitativi differenti che possono fornire la valutazione oggettiva motile cilia funzione. Infine, a differenza di altri metodi attuali per via aerea visualizzazione cilia, questo protocollo permette la visualizzazione delle ciglia perpendicolarmente alla direzione battito ciglia, permettendo vista di profilo delle ciglia che è ottimale per l&#39;imaging ad alta risoluzione del battito ciglia e generazione di onda metacronale . Questo protocollo può essere modificato in vari modi per affrontare una vasta gamma di esigenze sperimentali come il ruolo di agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico sulla funzione cilia muco delle vie aeree e la generazione / manutenzione di vie respiratorie battito delle ciglia e propagazione delle onde metacronale.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>No rosso fenolo </td></tr><tr><td>Siero fetale bovino </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x pinze fini </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da micro dissezione </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettatore </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>punte P1000 </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm rotondo in vetro vetrino vetrini </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Piastre per colture in plastica da 35 mm </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture da 35 mm con fondo in vetro </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di silicone 0,012" (0,3 mm) di spessore </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0,20 &mu; m diametro Fluoresbrite YG Microsfere di carbossilato </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito, con obiettivo a olio 100x e filtri DIC </td> Il marchio <td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>non è critico. </td></tr><tr><td>Lampada al mercurio da 100 watt, filtri di eccitazione/emissione FITC epifluorescenti</td><td>Lecia</td><td></td><td>Brand non è fondamentale.</td></tr><tr><td>Tavolino per microscopio Incubatore</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Non necessario se si esegue l'imaging delle ciglia a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Fotocamera ad alta velocità in campo chiaro </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>Brand non è critico. Deve essere più veloce di 125 fps</td></tr><tr><td>Fotocamera fluorescente ad alta velocità </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>Marca non è critico. Deve essere più veloce di 10 fps</td></tr><tr><td>Software di analisi video</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ con plug-in</td><td></td> MtrackJ</tr></tbody></table>

metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di cilia motilità in roditori airway epiteli

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

È stata stabilita una tecnica ex vivo per l&#39;imaging del mouse epiteli delle vie respiratorie per l&#39;analisi quantitativa della funzione ciglia motile importante per la comprensione funzione della clearance mucociliare. Appena raccolto il mouse trachea è tagliato longitudinalmente attraverso il muscolo trachealis e montato in una camera murata bassa su un piatto fondo di vetro. Il campione trachea è posizionato lungo il suo asse lungo di approfittare del muscolo trachealis ad arricciarsi longitudinalmente. Questo permette l&#39;imaging di movimento ciliare nella vista profilo lungo l&#39;intera lunghezza tracheale. I video a 200 frame / sec si ottengono utilizzando interferenza differenziale microscopia a contrasto e una fotocamera digitale ad alta velocità per consentire l&#39;analisi quantitativa delle ciglia frequenza del battito ciliare e forma d&#39;onda. Con l&#39;aggiunta di perline fluorescenti durante l&#39;imaging, cilia flusso di fluido generato anche può essere determinato. Il tempo di protocollo si estende a circa 30 minuti, con 5 minuti per la preparazione della camera, 5-10 min per campionemontaggio, e 10-15 minuti per videomicroscopia.

Controllo ciglia delle vie aeree deve essere chiaramente visibile e visto da battere in modo coordinato (Movie Supplemental 1; la riproduzione del filmato è rallentato a tempo reale 15%), con un flusso notevole nella direzione di battito delle ciglia (Movie Supplemental 2; la riproduzione di film è al 100% tempo reale). Quantificazione dei film ciglia dovrebbe produrre risultati simili a quello visto in Figura 3. Raccolta di film DIC alta velocità rende possibile la qua...

Una tecnica semplice e affidabile per la visualizzazione e la quantificazione delle vie aeree ciglia motilità e ciglia flusso generato usando il mouse trachea è descritto. Questa tecnica può essere modificato per determinare come una vasta gamma di fattori influenza cilia motilità, compresi agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico muco.

Metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare la motilità delle CLIA respiratorie e il flusso generato dalle CLIA utilizzando la trachea di topo appena isolata. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una camera di imaging poco profonda. I passaggi successivi della procedura consistono nel prelevare e montare il tessuto tracheale per l'acquisizione delle immagini.Viene quindi mostrato come visualizzare e registrare la motilit&agrave; C e il flusso generato dai CLIA utilizzando un microscopio invertito con videografia ad alta velocit&agrave; attraverso un obiettivo 100 XDIC. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare il video quantificando la frequenza di battito dei CLIA e il flusso generato dai CLIA mediante il software Image J. In definitiva, i risultati possono mostrare variazioni nella motilit&agrave; respiratoria dei CLIA e nel flusso generato dai CLIA attraverso la microscopia video ad alta velocit&agrave;.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente un'immagine riproducibile dell'epitelio tra delle cavie per valutazioni quantitative costanti del movimento cigliato. Questo può essere ottenuto in 20-30 minuti con una formazione minima. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali relative ai meccanismi cellulari e molecolari che regolano la clearance del muco nell'eWAY, specialmente quando viene utilizzato in combinazione con diversi modelli murini geneticamente modificati e mutanti.Iniziare costruendo la camera utilizzata per contenere i campioni di trachea come base o pavimento della camera. Utilizzare una piastra di coltura da 35 millimetri con fondo in vetro per la parte superiore. Utilizzare una guarnizione in silicone dello spessore di 0,3 millimetri.Posizionare la lamina su un coprioggetto circolare in vetro da 18 millimetri e tagliarne il bordo. Successivamente, con un bisturi, partendo dal centro del silicone, ritagliare un quadrato da 10 millimetri. Il coprioggetto in vetro e il silicone costituiscono rispettivamente la parte superiore e i lati della camera di coltura.Verranno posizionati sopra il campione che è stato posto nella piastra di coltura. Dopo aver soppresso un topo in conformità con le linee guida istituzionali, isolare chirurgicamente la trachea. Raccogliere la trachea in una piastra di coltura in plastica da 35 millimetri con una quantità sufficiente di mezzo L 15 per immergerla completamente.Mediante dissezione ottusa, rimuovere tutti i tessuti non tracheali intorno alla trachea. Successivamente, utilizzando forbici da microdissezione, rimuovere il laringe con un taglio trasversale appena al di sotto della cartilagine cricoidea. A questo punto, rimuovere i rami bronchiali primari destro e sinistro con un taglio trasversale appena sopra la carina, utilizzando pinzette fini.Tenere delicatamente la trachea. Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, lavare il lume due o tre volte con mezzo L 15 per rimuovere muco e sangue. Successivamente, usando forbici da microdissezione, effettuare un taglio trasversale per rimuovere un segmento di trachea di tre o quattro anelli.Quindi, nel piccolo segmento della trachea, effettuare un taglio longitudinale attraverso il centro del muscolo tracheale. Infine, tagliare longitudinalmente al centro degli anelli cartilaginei tracheali utilizzando forbici per microdissezione, lasciando due sezioni di tessuto tracheale adatte all'immagine. Dopo la dissezione, trasferire i segmenti di tessuto tracheale con la faccia luminale rivolta verso il basso al centro della piastra con fondo in vetro contenente circa 100 microlitri di L 15.Per quantificare il flusso generato dal CLIA con 20 microlitri di una sospensione al 2,5% di microsfere fluorescenti per millilitro di mezzo L 15. Posizionare ora la copertura in silicone e vetro sulla trachea ed esercitare una leggera pressione per fissarla. Quindi, lungo i bordi, rimuovere qualsiasi eccesso di mezzo con una pipetta da un millilitro.Ora trasferire la camera su un microscopio invertito dotato di un obiettivo da 100x e ottica DIC. Utilizzando una telecamera ad alta velocità e un software di acquisizione video, registrare filmati della motilità CLIA a 200 o più fotogrammi al secondo lungo l'epitelio tracheale ciliato del margine arrotolato del muscolo tracheale. Mediante imaging fluorescente FS e epi e una telecamera CCD a bassa luminosità, acquisire filmati delle microsfere fluorescenti in movimento sulla superficie dell'epitelio tracheale ciliato.Utilizzando questi filmati, procedere con la quantificazione dei campioni di flusso generati da CLIA. I campioni possono essere ripresi per un'ora senza alcuna alterazione evidente della funzione ciliare. Iniziare calcolando i battiti CLIA al minuto. Caricare i filmati acquisiti in contrasto di interferenza differenziale (DIC) nel pacchetto software ImageJ.Seguire la tecnica descritta da Aian Drummond. Utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea raster. Attraversare le ciglia battenti.Creare una sezione trasversale di questa linea per generare un'immagine di tipo grafico in cui il movimento del CA lungo la linea produce un modello ondulatorio. Contare ora il numero di pixel tra ogni picco d'onda lungo questa linea. Da questo conteggio.Calcolare i battiti al minuto sapendo che ogni fotogramma del filmato è rappresentato da un pixel lungo la linea. Successivamente, misurare il flusso generato da C Cate. Caricare i filmati delle microsfere fluorescenti nel pacchetto software Image J.Utilizzando il plugin MT track J, tracciare manualmente le microsfere fluorescenti lungo la superficie dell'epitelio tracheale. Il software calcolerà la velocità e la direzionalità per ciascuna microsfera tracciata. Prestare attenzione al fatto che la distanza dalle ciglia battenti può influenzare notevolmente l'entità del flusso misurato.In questo esempio, il movimento delle perline è rapido sulla superficie delle ciglia battoni e diminuisce per le perline più lontane nel mezzo di immersione; per controllare questo fenomeno, le tracce delle perline devono essere raccolte solo a una distanza fissa sopra l'epitelio ciliato in tutti i campioni, in modo da permettere confronti corretti. Infine, per il flusso del liquido, seguire le perline per il tempo più lungo possibile. È preferibile utilizzare perline che attraversino più di 10 cellule ciliate per effettuare questi calcoli.Utilizzando il protocollo descritto, i cigli delle vie aeree di controllo dovrebbero essere chiaramente visibili e osservabili in modo coordinato. Allo stesso modo, dovrebbe essere evidente un flusso nella direzione del battito. Tipicamente, l'acquisizione di filmati ad alta velocità in contrasto di interferenza differenziale consente la quantificazione della frequenza di battito ciliare e fornisce ottime immagini.Per la valutazione qualitativa della forma del battito CLIA. Il tracciamento dei microsferette fluorescenti fornisce una misura della velocità del flusso generato da CLIA. La direzionalità viene calcolata dividendo lo spostamento totale di una microsferetta fluorescente per la lunghezza della traccia lasciata da una microsferetta fluorescente.Pertanto, una traiettoria rettilinea ottiene il punteggio massimo. Mentre un percorso tortuoso ottiene un valore molto più basso. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere accuratamente il muscolo traches da tutti i tessuti connettivi e adiposi circostanti prima di tagliare.Poiché l'arrotolamento del muscolo tracheale dopo il taglio è essenziale per posizionare il CLIA respiratorio in modo ottimale per la visualizzazione. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come studi farmacologici, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio come o perché gli agenti farmacologici modulano l'attività del C respiratorio?

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