Name: Metodo ex vivo per limaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Impara un metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione della motilità ciliare negli epiteli delle vie aeree di roditori. Questa tecnica consente analisi quantitative della frequenza battito ciliare e del flusso generato in Mus musculus.

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Il progetto è stato sostenuto da NIH concedere U01HL098180 dal National Heart, Lung, and Blood Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Heart, Lung, and Blood Institute e il National Institutes of Health

1. Setup Reagenti 1.1 Dissezione e immagini Media L-15 Leibovitz (L15) è completato con FBS (10%) e penicillina-streptomicina (100 unità / ml di penicillina G sodica e 100 pg / ml di streptomicina solfato) è usato sia durante il raccolto e di imaging di campioni trachea. 2. Shallow Walled Cultura della Camera dell&#39;Assemblea La camera utilizzato per contenere trachea tessuto è mostrato in Figura 1. Il pavimento della camera è il fondo di vetro 35 millimetri capsula di Petri. La parte superiore e laterale della camera è generato mettendo un piccolo pezzo di 0,3 mm di spessore fogli silicone sopra il piatto di vetro. Il bordo del foglio è tagliato per adattarsi al piatto fondo rotondo ed il centro è ulteriormente tagliato per formare una camera centrale poco profonda (vedere i punti 2.1-2.3). In cima a questa assemblea, un vetrino di vetro 18 millimetri rotonda è posto per generare un ambiente avente adatto per l&#39;imaging. <ol><li> Coprire completamente il vetrino in vetro mm 18 round con un quadrato di 0,3 mm di spessore rivestimento di silicone. </li><li> Con forbici normali dissezione netta tagliare il telone di silicone in eccesso intorno al bordo del vetrino (risultante in uno strato circolare di fogli di silicone). </li><li> Con un bisturi affilato tagliare e rimuovere una piazza centrale di fogli di silicone (circa 10 mm quadrati) dal centro del vetrino coperto (formando così la parte superiore e sui lati della camera di imaging). </li></ol> 3. Trachea Raccolta e Preparazione <ol><li> Euthanize topi secondo locale la cura degli animali istituzionale e utilizzare comitato e / o linee guida governative e rimuovere trachea in plastica 35 millimetri capsula di Petri standard abbastanza L15 supporto al tessuto sommergere (autori hanno usato topi appena prima della nascita al giorno di gestazione 16.5, fino alla appena nati, neonatale e adulto animali 2). </li><li> Rimuovere non trachea corrispondente tessuto applicata all&#39;esterno dila trachea utilizzando dissezione smussa. </li><li> Rimuovere la laringe con un taglio trasversale appena sotto la cartilagine cricoide usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 1). </li><li> Rimuovere i rami bronchiali principali destro e sinistro con un taglio trasversale appena sopra la carena usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 2). </li><li> Premere delicatamente la trachea con una pinza sottile e lavare il lume 2-3 volte con circa 1 ml di balneazione L15 mezzo con un P1000 e P1000 Pipetman punta a cancellare qualsiasi muco e sangue. </li><li> Tagliare un segmento di anello 3-4 di trachea utilizzando un taglio trasversale con micro forbici dissezione (Figura 2B, linea 1). </li><li> Tagliare longitudinalmente attraverso il centro del muscolo trachealis di questo breve segmento trachea usando forbici micro dissezione (Figura 2B, linea 2). </li><li> Tagliare longitudinalmente attraverso il centro degli anelli di cartilagine tracheale con micro forbici dissezione (Figura 2C </strong&gt;, riga), lasciando due sezioni di trachea tessuto adatto per l&#39;imaging (sezione singolo illustrato nella Figura 2D). </li></ol> 4. Cilia Imaging <ol><li> Trasferimento segmenti di tessuto trachea, lato lumen giù, sul centro di un mm con fondo di vetro piatto 35 cultura con 100-200 ml di L-15. </li><li> Per quantificare cilia flusso generato aggiungere una piccola quantità di microsfere fluorescenti 0,20 ìm alla L-15 bagnando il campione di tessuto trachea (~ 1 x 10 11 particelle / ml o 20 microlitri / ml della Fluoresbrite 2,5% sospensione acquosa microsfere). </li><li> Posizionare la camera di imaging preparato precedentemente (vedere Procedura di 1-3 sopra) in cima alla trachea campione silicone lato del foglio in basso, con il campione trachea situato nel centro della camera murato superficiale formata dal taglio finestra nella lastra di silicone (figura 1 ). </li><li> Premere delicatamente sul vetrino per fissare in posizione e rimuovere qualsiasi eccesso di L-15 supporti dai bordi usinga P1000 e P1000 punta Pipetman. </li><li> Montare il fondo di vetro cultura piatto 35 millimetri e il campione trachea su un microscopio invertito con ottica 100X oggettivi e DIC. </li><li> Utilizzando una macchina fotografica ad alta velocità e il software di acquisizione filmato raccoglie i film di ciglia motilità a + 200 fotogrammi al secondo lungo il ciliato epiteli tracheale del raggomitolati bordo del muscolo trachealis (box, e figura 2D Delineato: esempio ancora immagine da filmato registrato) (Movie supplementare 1). </li><li> Utilizzando FITC immagini epifluorescente e una luce CCD basso (Vedi elenco delle attrezzature di cui sopra), raccogliere i film di movimento microsfere fluorescenti sulla superficie degli epiteli tracheale ciliato per consentire successivamente la quantificazione delle ciglia flow generato (Movie integrativa 2). </li></ol> 5. Quantificazione di Cilia Motilità <ol><li> Caricare DIC film imaged nel pacchetto software ImageJ e seguendo la tecnica descritta da Iain Drummond 13 utilizzare lo strumento linea per tracciare una linea di trama che attraversa le ciglia battere. A &quot;reslice&quot; di questa linea genera un immagine tipo chimografo dove il movimento delle ciglia tutta la linea genera un modello di onda. Il numero di pixel tra ogni picco dell&#39;onda è li misurati (un pixel = un fotogramma filmato) da cui è possibile calcolare il numero di battiti al minuto (cioè Hz). </li><li> Per misurare ciglia generato flussi di carico fluorescenti film tallone nel pacchetto software ImageJ, e usare il plugin MTrackJ 14 per tenere traccia manualmente perline fluorescenti sulla superficie della trachea epiteli e lasciare che il software genera velocità di perline e direzionalità per ciascuna sfera rintracciato. </li></ol> Si deve prestare attenzione quando si utilizza perline fluorescenti per quantificare il flusso come la distanza tra le ciglia battere può influenzare fortemente il flusso misurato grandezza. Il movimento del tallone in Supplemental Movie 2 è un buon esempio di questo. In questo esempio beadmovimento è veloce alla superficie delle ciglia battere e riduce notevolmente spento per perline più lontano nei media balneazione. Per controllare per questo, perline tracciati dovrebbero essere raccolti solo ad una distanza fissa sopra la epiteli ciliato in tutti i campioni per permettere una comparazione corretta da fare. Infine, per ottenere dati rappresentativi sul flusso del fluido, sfere dovrebbero essere monitorati a lungo possibile, preferiamo usare tracce tallone che coprono 10 + cellule ciliate per calcolare il flusso del fluido.

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<li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li>
<li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Misura della frequenza del battito delle ciglia (CBF) è relativamente facile usando obiettivi del microscopio ad alta potenza e le immagini veloce acquisizione hardware 13,15, e spiega perché le misure CBF sono alla base della maggior parte degli studi indagano clearance mucociliare durante la salute e la malattia. Tuttavia, mentre la misurazione CBF è essenziale per comprendere la clearance mucociliare, la misurazione della CBF solo ignora l&#39;importanza di fondo di entrambi i flussi generati ciliare e cig...

Analisi della funzione di cilia motili nella epiteli delle vie aeree è sperimentalmente importanti per la comprensione dei fattori genetici e ambientali che possono influenzare la clearance mucociliare e la salute polmonare 1. La semplice protocollo sviluppato per l&#39;imaging del mouse epiteli delle vie aeree fornisce un metodo efficiente per interrogare vie respiratorie ciglia motilità nei modelli mutanti e knockout topo e richiedono solo competenze di base in topo tracheale dissezione dei tessuti ed ex imaging in vivo di vie ciglia motilità con videomicroscopia alta risoluzione. Questo protocollo è stato istituito e perfezionato nel corso di una schermata di mutagenesi del mouse su larga scala per consentire una rapida valutazione della funzione delle ciglia mobili (cilia frequenza del battito, forma battito delle ciglia, ciglia flusso generato) in mutanti con cardiopatia congenita associata a heterotaxy 2-5. Le attuali tecniche utilizzate per lo studio delle vie respiratorie ciglia motilità possono essere raggruppati in due l&#39;ex vivo tipo acuto o lontermine ger in approcci sperimentali in vitro. Esperimenti acuti includono ex vivo di visualizzazione nasali / vie aeree biopsie spazzola umani 6,7 e analisi di semplici sezioni trasversali 8 vie respiratorie. Gli approcci in vitro utilizzano varie tecniche di coltura cellulare per produrre fogli di differenziata epiteli ciliato, come nelle culture di interfaccia Liquid Air o respiratori sospensione culture 9-11. Tuttavia, queste vie respiratorie epiteli tecniche reciliation richiedono investimenti molto significativo nel tempo e la formazione prima di tutte le cellule epiteliali ciliate utilizzabili sono prodotte per la sperimentazione (4-6 settimane 9,10). Mentre acuta analisi ex vivo delle vie respiratorie epiteliali biopsie pennello sono comunemente utilizzati per gli studi clinici umani, questo metodo non è utilizzabile in studi del mouse a causa di lesioni aggravate tessuto meccanico 12. La tecnica descritta in questo protocollo per l&#39;analisi del moustracheale e vie aeree epiteli non è solo semplice da eseguire, ma non richiede particolari doti dissezione né le attrezzature specializzate, oltre a quelli standard per l&#39;imaging da videomicroscopia. Ci sono molti vantaggi a questo semplice protocollo. Prima, come mouse trachea raccolta dei tessuti è rapida e facile da eseguire, esso consente la rapida valutazione della funzione cilia vie aeree in un gran numero di topi. Questo può includere analisi acuta degli effetti a breve termine diversi trattamenti in vitro. Secondo, essendo una tecnica ex vivo, l&#39;epitelio ciliato vie respiratorie rimane attaccata ad esso sottostanti tessuti di sostegno e conservano quindi associate percorsi di segnalazione cellulare. Quindi in confronto a in vitro reciliated epiteli delle vie aeree, questa preparazione è una migliore rappresentazione del naturale in ambiente tessuto vivo. Terzo, questo protocollo permette l&#39;acquisizione di una serie di parametri quantitativi differenti che possono fornire la valutazione oggettiva motile cilia funzione. Infine, a differenza di altri metodi attuali per via aerea visualizzazione cilia, questo protocollo permette la visualizzazione delle ciglia perpendicolarmente alla direzione battito ciglia, permettendo vista di profilo delle ciglia che è ottimale per l&#39;imaging ad alta risoluzione del battito ciglia e generazione di onda metacronale . Questo protocollo può essere modificato in vari modi per affrontare una vasta gamma di esigenze sperimentali come il ruolo di agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico sulla funzione cilia muco delle vie aeree e la generazione / manutenzione di vie respiratorie battito delle ciglia e propagazione delle onde metacronale.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>No rosso fenolo </td></tr><tr><td>Siero fetale bovino </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x pinze fini </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da micro dissezione </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettatore </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>punte P1000 </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm rotondo in vetro vetrino vetrini </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Piastre per colture in plastica da 35 mm </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture da 35 mm con fondo in vetro </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di silicone 0,012" (0,3 mm) di spessore </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0,20 &mu; m diametro Fluoresbrite YG Microsfere di carbossilato </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito, con obiettivo a olio 100x e filtri DIC </td> Il marchio <td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>non è critico. </td></tr><tr><td>Lampada al mercurio da 100 watt, filtri di eccitazione/emissione FITC epifluorescenti</td><td>Lecia</td><td></td><td>Brand non è fondamentale.</td></tr><tr><td>Tavolino per microscopio Incubatore</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Non necessario se si esegue l'imaging delle ciglia a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Fotocamera ad alta velocità in campo chiaro </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>Brand non è critico. Deve essere più veloce di 125 fps</td></tr><tr><td>Fotocamera fluorescente ad alta velocità </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>Marca non è critico. Deve essere più veloce di 10 fps</td></tr><tr><td>Software di analisi video</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ con plug-in</td><td></td> MtrackJ</tr></tbody></table>

metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di cilia motilità in roditori airway epiteli

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

È stata stabilita una tecnica ex vivo per l&#39;imaging del mouse epiteli delle vie respiratorie per l&#39;analisi quantitativa della funzione ciglia motile importante per la comprensione funzione della clearance mucociliare. Appena raccolto il mouse trachea è tagliato longitudinalmente attraverso il muscolo trachealis e montato in una camera murata bassa su un piatto fondo di vetro. Il campione trachea è posizionato lungo il suo asse lungo di approfittare del muscolo trachealis ad arricciarsi longitudinalmente. Questo permette l&#39;imaging di movimento ciliare nella vista profilo lungo l&#39;intera lunghezza tracheale. I video a 200 frame / sec si ottengono utilizzando interferenza differenziale microscopia a contrasto e una fotocamera digitale ad alta velocità per consentire l&#39;analisi quantitativa delle ciglia frequenza del battito ciliare e forma d&#39;onda. Con l&#39;aggiunta di perline fluorescenti durante l&#39;imaging, cilia flusso di fluido generato anche può essere determinato. Il tempo di protocollo si estende a circa 30 minuti, con 5 minuti per la preparazione della camera, 5-10 min per campionemontaggio, e 10-15 minuti per videomicroscopia.

Controllo ciglia delle vie aeree deve essere chiaramente visibile e visto da battere in modo coordinato (Movie Supplemental 1; la riproduzione del filmato è rallentato a tempo reale 15%), con un flusso notevole nella direzione di battito delle ciglia (Movie Supplemental 2; la riproduzione di film è al 100% tempo reale). Quantificazione dei film ciglia dovrebbe produrre risultati simili a quello visto in Figura 3. Raccolta di film DIC alta velocità rende possibile la qua...

Una tecnica semplice e affidabile per la visualizzazione e la quantificazione delle vie aeree ciglia motilità e ciglia flusso generato usando il mouse trachea è descritto. Questa tecnica può essere modificato per determinare come una vasta gamma di fattori influenza cilia motilità, compresi agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico muco.

Metodo ex vivo per l&#39;imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare e quantificare la motilità delle CLIA respiratorie e il flusso generato dalle CLIA utilizzando la trachea di topo appena isolata. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto una camera di imaging poco profonda. I passaggi successivi della procedura consistono nel prelevare e montare il tessuto tracheale per l'acquisizione delle immagini.Viene quindi mostrato come visualizzare e registrare la motilit&agrave; C e il flusso generato dai CLIA utilizzando un microscopio invertito con videografia ad alta velocit&agrave; attraverso un obiettivo 100 XDIC. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare il video quantificando la frequenza di battito dei CLIA e il flusso generato dai CLIA mediante il software Image J. In definitiva, i risultati possono mostrare variazioni nella motilit&agrave; respiratoria dei CLIA e nel flusso generato dai CLIA attraverso la microscopia video ad alta velocit&agrave;.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente un'immagine riproducibile dell'epitelio tra delle cavie per valutazioni quantitative costanti del movimento cigliato. Questo può essere ottenuto in 20-30 minuti con una formazione mini

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Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Le ciglia dei neuroni sensoriali olfattivi contengono proteine della cascata di trasduzione del segnale, ma un'analisi spaziale dettagliata della loro distribuzione è difficile nelle criosezioni. Descriviamo qui un approccio ottimizzato per la marcatura dell'intera montatura e la visualizzazione en face delle proteine ciliari.

Tutta Monte Etichettatura del Cilia nel Main olfattivo Sistema di Mice

Utilizzando ad alta risoluzione di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopia, un ex vivo osservazione del battito di ciglia motile ependimale situato all'interno il mouse ventricoli cerebrali è dimostrata dal live-imaging. La tecnica consente una registrazione della frequenza battito ciliare unico e battendo angolo come pure i loro calcio intracellulare proprietà oscillazione stimolazione.

Immagini dal vivo del ependimale Cilia nei ventricoli laterali del cervello di topo

In questo studio, una tecnica dettagliata di microscopia ottica è stata ottimizzata per l'osservazione e l'analisi in tempo reale del movimento delle ciglia CPEC ex vivo insieme a un metodo di microscopia elettronica per l'analisi ultrastrutturale.

L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

In questa pubblicazione descriviamo protocolli per la valutazione del gioco mucociliare delle vie aeree (MCC) nei topi in vivo utilizzando l'imaging a radionuclide a doppia modalità. Questo protocollo è progettato per una singola tomografia computerizzata ad emissione di fotoni (SPECT) e un protocollo di acquisizione della tomografia computerizzata (CT) utilizzando collimatori a tutto il corpo del mouse (MWB) in un doppio sistema SPECT/CT.

Valutazione in vivo del nulla osta mucociliario nei topi

Per garantire un'analisi funzionale ciliare di successo e di alta qualità per la diagnosi di PCD, è essenziale un metodo preciso e attento per il campionamento e il trattamento dell'epitelio respiratorio. Per continuare a fornire un servizio diagnostico PCD durante la pandemia COVID-19, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato aggiornato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.

Campionamento ed elaborazione della spazzolatura nasale mediante videomicroscopia ciliare digitale ad alta velocità – Adattamento alla pandemia COVID-19

Questo protocollo descrive la raccolta, l'espansione e la differenziazione delle cellule epiteliali nasali in modelli organotipici di cellule epiteliali delle vie aeree e la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia tramite imaging di cellule vive e script personalizzati.

Raccolta, espansione e differenziazione di modelli primari di cellule epiteliali nasali umane per la quantificazione della frequenza del battito delle ciglia

L'analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.

Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria

Qui, descriviamo un modello in vitro per isolare e differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree murine, concentrandosi sulla loro acclimatazione all'estratto di fumo di sigaretta cronico (CSE). Il modello potrebbe essere utilizzato per caratterizzare in modo completo l'impatto multi-omico della CSE, che potrebbe fornire informazioni sulle risposte cellulari in condizioni di esposizione cronica al fumo.

Modello in vitro per lo studio del differenziamento e dei cambiamenti di multi-omiche su cellule epiteliali delle vie aeree murine stimolate con estratto di fumo di sigaretta

La coltura dell'interfaccia aria-liquido è comunemente usata per sviluppare epitelio pseudostratificato delle vie aeree differenziando le cellule epiteliali bronchiali umane normali primarie che imitano il lato apicale delle vie aeree polmonari. Qui, descriviamo un semplice protocollo per determinarne la qualità monitorando le sue proprietà biofisiche, come la funzione ciliare e l'integrità della membrana.

Determinazione della funzione ciliare e dell'impermeabilità della membrana dell'epitelio pseudostratificato delle vie aeree polmonari

Questo metodo descrive lo sfruttamento del segnale endogeno in un modello murino transgenico ARL13B-CENTRIN-2 per visualizzare le ciglia primarie in situ, in tre dimensioni su ampie aree di tessuto mineralizzato, dalla raccolta dei tessuti all'analisi dell'organizzazione delle ciglia. Questo protocollo può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti.

Imaging volumetrico e analisi delle ciglia primarie nel tessuto muscoloscheletrico utilizzando il modello murino ARL13B-CENTRIN-2

Impara un metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione della motilità ciliare negli epiteli delle vie aeree di roditori. Questa tecnica consente analisi quantitative della frequenza battito ciliare e del flusso generato in Mus musculus.

Metodo ex vivo per l'imaging ad alta risoluzione di Cilia Motilità in roditori Airway epiteli

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