Name: Recombineering costrutti omologhi ricombinazione Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Impara a generare vettori di ricombinazione omologa in Drosophila utilizzando tecniche di recombineering. Questo metodo consente mutazioni nulle precise e il tagging di proteine endogene per studi genetici avanzati.

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Vorremmo ringraziare Hugo Bellen e la Bloomington Stock Center per i reagenti. Ringraziamo inoltre Koen Venken, Hugo Bellen e tutti i membri del laboratorio Buszczak e Hiesinger per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del National Institute of Health di ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) e MB (RO1GM086647), una sovvenzione dal Cancer Prevention Research Institute del Texas a MB e PRH (RP100516), e la Welch Fondazione (I-1657) a PRH. MB è un EE e Greer Garson Fogelson Scholar in Ricerca Biomedica e PRH è una Eugene McDermott Scholar in Ricerca Biomedica presso UT Southwestern Medical Center.

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<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
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<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi in quanto riguarda le tecniche descritte qui.

Il potere di organismi modello genetiche nella ricerca biomedica è largamente basato sugli strumenti disponibili per la manipolazione genetica. I piccoli modelli C. elegans e Drosophila consentire, in particolare economico e veloce molecolare le analisi genetiche dei percorsi completi e famiglie di geni implicati nello sviluppo o nella funzione multicellulare. Gli ultimi anni hanno visto progressi significativi nello sviluppo strumento per manipolare i geni in Drosophila 14,15. Per ...

Pulire manipolazioni molecolarmente definiti di singoli geni a loro loci endogene offrono uno strumento prezioso per lo studio di una miriade di domande pertinenti alla biologia degli eucarioti. Drosophila invertire tecniche genetiche per la generazione di alleli perdita-di-funzione avevano dimostrato di essere una sfida fino Golic e colleghi hanno introdotto in genica in vivo il targeting utilizzando la ricombinazione omologa di Drosophila 1-3. Hanno dimostrato che specifici loci genomici possono essere mirate utilizzando un frammento di DNA lineare da un costrutto transgenico integrato. Questo DNA lineare &quot;donatore&quot; viene generato in vivo mediante ricombinazione FRT-mediata (di asportare il DNA dal cromosoma come molecola circolare) seguita da linearizzazione con il meganuclease I-SCEI. Sebbene questa metodologia è stata utilizzata con successo per generare una varietà di lesioni definite, la tecnica non è facilmente scalabile per la manipolazione di numerosi geni in parallelo, poiché ciascun indivicostrutto doppio ko richiede design distinto e personalizzato. Per esempio, la difficoltà di manipolare grandi senza soluzione di frammenti di DNA (&gt; 5 kb) in vitro usando enzimi di restrizione classica / legatura clonazione o PCR, nonché le limitazioni di dimensione dei tradizionali in vettori di trasformazione in vivo spesso interferiscono con la rapida realizzazione di ricombinazione omologa di targeting vettori. Per superare queste limitazioni, abbiamo unito il sistema P [acman] recombineering / transgenesi, che consente al sub-clonazione e transgenesi fino a 100 kb di DNA, con l&#39;estremità-out gene targeting metodologia per stabilire una piattaforma efficiente e relativamente rapido che facilita gene Drosophila targeting. Ricombinazione mediata da ingegneria genetica (recombineering) è un potente ricombinazione omologa a base di tecnologia di clonazione 4,5. In contrasto con l&#39;enzima di restrizione convenzionale / ligasi clonazione, recombineering non è limitata dalla sequenza o size del DNA manipolato. Recombineering utilizza uno speciale E. coli ceppo che ospita macchinari ricombinazione fornito da un λ difettoso profago 4. Questa tecnica è stata recentemente adottata per l&#39;utilizzo in Drosophila 6,7. Recombineering in Drosophila si basa su un condizionale amplificabile cromosoma artificiale batterico modificato (BAC) vettore chiamato P [acman] 6,7. Questo vettore porta due origini di replicazione: oppureiv, che produce numero elevato di copia dopo induzione chimica per la purificazione di grandi quantità di DNA necessarie per il sequenziamento e l&#39;iniezione embrione e ORIS, che mantiene basso numero di copie in condizioni basali. Ulteriormente, il P [acman] vettore è dotato di un sito di attacco batterico (attB). Il sito attB serve come substrato per ΦC31 integrasi transgenesi mediata che permette l&#39;incorporazione di grandi frammenti di DNA in un sito di atterraggio predeterminata all&#39;interno del genoma di Drosophila 8,9. Abbiamo generato un P [acman] vettore (denominato P [acman]-KO 1.0) che può essere utilizzato come vettore di targeting per fini-out ricombinazione omologa 10,11. Per incorporare le estremità-out dei geni della tecnologia nel sistema, abbiamo aggiunto due FRT e due siti di I-SCEI. Abbiamo incluso anche una cassetta Gateway all&#39;interno di questo vettore modificata per semplificare il processo di integrazione tra le braccia di omologia in P [acman]-KO 1.0. Questo fornisce un modo rapido e semplice per introdurre virtualmente qualsiasi regione genomica di interesse nel vettore targeting. In questo protocollo si descrivono Come Engineer un vettore targeting utilizzando P [acman]-KO 1.0, e come mobilitare questo vettore in vivo di indirizzare il locus endogeno. Ai fini del presente protocollo useremo la cassetta RFP / Kan per sostituire un gene di interesse, ma una serie di cassette che contengono un marcatore di selezione antibiotico può essere utilizzato con questo protocollo. Abbiamo progettato e utilizzato con successo una serie di cassette persostituzione del gene e tagging 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Batteri competenti per la ricombinazione</td><td>NCI-Frederick</td><td>Batteri per la ricombinazione (SW102, SW105 e SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 elettrocompatibile E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>include CopyControl soluzione di induzione</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polimerasi</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit di recupero del DNA</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Kit enzimatico</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak e Hiesinger Labs</td><td>Su richiesta</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak e Hiesinger Labs</td><td> Flystocks</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bloomington stock center</td><td>Codici stock: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2; Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Elettroporatrice</td><td>Biorad GenePulser Xcell con modulo PC</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Fisher Marca</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering costrutti omologhi ricombinazione<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Il continuo sviluppo di tecniche per veloce, manipolazione su larga scala di endogeni loci genici estenderà l&#39;uso di Drosophila melanogaster come organismo modello genetico per la ricerca connessa umano-patologia. Gli ultimi anni hanno visto progressi tecnici come ricombinazione omologa e recombineering. Tuttavia, generando null mutazioni inequivocabili o proteine ​​endogene di tagging rimane un notevole sforzo per la maggior parte dei geni. Qui, descriviamo e dimostrare le tecniche per l&#39;utilizzo di metodi di clonazione recombineering-based per generare vettori che possono essere utilizzati per indirizzare e manipolare loci endogeni in vivo In particolare, abbiamo stabilito una combinazione di tre tecnologie:. (1) BAC transgenesi / recombineering, ( 2) le estremità-out ricombinazione omologa e (3) la tecnologia Gateway per fornire un robusto metodo, efficiente e flessibile per manipolare loci genomici endogeni. In questo protocollo, noi forniamo i dettagli passo-passo su come (1) disegno individuavettori l, (2) come clonare grossi frammenti di DNA genomico nel vettore di ricombinazione omologa utilizzando riparazione gap, e (3) come sostituire o tag geni di interesse all&#39;interno di questi vettori che utilizzano un secondo giro di recombineering. Infine, ci sarà anche fornire un protocollo per il modo di mobilitare queste cassette in vivo per generare un ko, o di un gene con tag via knock-in. Possono essere facilmente adottate Questi metodi per obiettivi multipli in parallelo e forniscono un mezzo per manipolare il genoma di Drosophila in modo tempestivo ed efficiente.

Amplificazione della LA e RA braccia di omologia dovrebbe produrre 500 prodotti bp e la reazione di PCR-SOE dovrebbe produrre un 1,0 kb prodotto (Sezioni 2.1-2.4; Figura 2). La reazione BP eseguita nella sezione 2.5 è in genere di trasformazione molto efficiente e batteriche delle rese di prodotto 5-100 colonie in media. Quasi tutte le colonie testati con PCR di controllo Mostra l&#39;atteso prodotto di PCR. Durante il primo giro di recombineering (sezione 3), si aspettano d...

Tecniche di ricombinazione omologa notevolmente avanzare<em&gt; Drosophila</em&gt; Genetica, consentendo la creazione di mutazioni molecolarmente precise. La recente adozione del recombineering permette di manipolare grandi pezzi di DNA e di trasformarle in<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. I metodi qui presentati combinare queste tecniche per generare rapidamente grandi vettori di ricombinazione omologa.

Recombineering costrutti omologhi ricombinazione<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare rapidamente vettori di ricombinazione omologa di grandi dimensioni che possono essere utilizzati per indirizzare e manipolare loci oph endogeni. Questo viene ottenuto innanzitutto selezionando un clone retrostante, che copre la regione genomica di interesse. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'inserire bracci di omologia in un vettore di ricombinazione omologa.Il terzo passaggio consiste nel clonare il DNA genomico nel vettore di ricombinazione omologa mediante riparazione di gap. L'ultimo passaggio prevede la sostituzione della regione genomica con la cassetta di targeting. In definitiva, queste procedure permetteranno di ingegnerizzare un vettore di targeting per la ricombinazione omologa di Enzo, al fine di generare mutazioni nulle inequivocabili o etichettare proteine endogene in Drosophila attraverso l'uso di tecniche basate sulla ricombinazione.Inoltre, il manoscritto include anche un protocollo per mobilizzare questi cassette in vivo al fine di generare un gene nullo o un gene marcato mediante knockin. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che può essere facilmente adottata per multipli bersagli in parallelo, fornendo un mezzo per manipolare il genoma di oph in modo tempestivo ed efficiente. Per raggiungere questo obiettivo, i nostri metodi combinano tecnologie di ricombinazione e di gateway per generare i vettori di ricombinazione omologa.A differenza della tradizionale restrizione all'interno del clonaggio mediante ligasi, queste tecnologie non sono limitate dalla dimensione o dalla sequenza del DNA, facilitando così il processo di clonaggio. Sebbene questo protocollo descriva un metodo per generare una cassetta di targeting per l'interruzione genica, esso può essere utilizzato anche per manipolare qualsiasi locus endogeno in praticamente qualsiasi modo desiderato. Ciò include l'aggiunta di un marcatore a un gene d'interesse, la sostituzione di un gene d'interesse con GAL4, oppure la generazione di linee con troncamento proteico o linee reporter. Per ottenere un ceppo contenente il gene d'interesse, ovvero CG32095.In questo esempio, aprire una ricerca per il gene@flybased.org. Per ottenere l'elenco dei ceppi, cercare nella sezione "Stock e reagenti" e verificare la sezione intitolata "cloni genomici".Tra le opzioni disponibili, individuare un clone che comprenda almeno 10 chilobasi a monte e cinque chilobasi a valle del gene di interesse. Queste regioni vengono utilizzate come bracci di omologia. Tale selezione può essere effettuata allineando le sequenze dell'estremità 5' e dell'estremità 3' del clone contro il genoma di Drosophila.In alternativa, le linee clonali nel vettore Pac-Man possono essere reperite anche presso pacmanfly.org. Selezionare ora i primer per amplificare le 500 paia di basi all'estremità di ciascun braccio di omologia. Questi frammenti, denominati LA e RA, vengono utilizzati per ricombinare la regione genomica compresa tra i bracci di omologia nel Pacman.Plasmide KO 1.0. Assicurarsi che le regioni di omologia di 500 basi non contengano siti di restrizione BAM H I, poiché questi verranno digeriti per linearizzare il plasmide. Impostare due reazioni PCR separate per amplificare i frammenti LA e RA; per il frammento LA, includere nel primer diretto una sequenza TTV I e nel primer inverso una sequenza ISC I.Incorporare il sito AB MH in una posizione distante sette basi in direzione 3' rispetto alla sequenza complementare corrispondente al braccio di omologia opposto. Per il frammento RA, includere nel primer diretto il sito AB MH in una posizione distante sette basi in direzione 3' rispetto alla sequenza complementare corrispondente al braccio opposto, e nel primer inverso le sequenze at TB2 e I sce E1 come stampo. Utilizzare un microlitro di DNA di back-up ottenuto da una mini-preparazione non purificata, oppure mezzo microlitro di batteri contenenti il costrutto coltivati per tutta la notte e poi sottoposti a ebollizione, in questa e in tutte le successive PCR.Assicurarsi di utilizzare una DNA polimerasi con capacità di correzione. Tuttavia, ciò non è necessario per i controlli PCR. Eseguire i campioni PCR su un gel di agarosio all'1% ed estrarre i prodotti utilizzando un kit di recupero DNA XMO clean.Eluire il DNA con 10 microlitri di acqua sterile. Successivamente, utilizzando da 10 a 30 nanogrammi di ciascun DNA amplificato, eseguire un'analisi di splicing mediante PCR di estensione con sovrapposizione.Di solito viene utilizzato circa un ventesimo dei prodotti PCR purificati. A questo punto, utilizzando una reazione BP secondo il protocollo del produttore, clonare il frammento fuso LARA nel plasmide Pacman KA. Questo plasmide può essere richiesto al Boost Truck Lab. Inoculare le cellule SW102 contenenti il vettore di interesse in quattro millilitri di LB aggiunti dell'antibiotico di selezione appropriato, in questo caso 25 microgrammi per millilitro.Coltivare il ceppo in presenza di cloramfenicolo a 32 gradi Celsius durante la notte a 250 RPM. Prestare attenzione che la temperatura non superi i 32 gradi Celsius, altrimenti il giorno seguente verrà attivato il sistema di ricombinazione delle cellule. Digestione di 0,4 microgrammi del Pac-Man KO contenente LA e RA con circa 20 unità di bmh.Uno in una reazione di 25 microlitri a 37 gradi Celsius. Eseguire una reazione prolungata di almeno tre ore, poiché ciò è fondamentale per eliminare i falsi positivi. Successivamente, inoculare un millilitro della coltura saturo di SW 1 0 2 nella coltura di riserva in 44 millilitri di LB con cloramfenicolo.Coltivarlo a 32 gradi Celsius con agitazione fino a un OD 600 compreso tra 0,2 e 0,3, il che di solito richiede da 60 a 90 minuti. Avviare contemporaneamente una coltura parallela come controllo negativo senza shock termico. La comparsa di numerose colonie su questo controllo indica generalmente una trasformazione avvenuta con plasmide non digerito.Mentre la coltura cresce, eseguire una digestione con l'enzima di restrizione BAM H su un plasmide, quindi separare il prodotto in un gel, estrarre il DNA dal gel e diluirlo in 10 microlitri di acqua riscaldata, ma assolutamente non in tampone. A temperature fino a 55 gradi Celsius, sali e tamponi possono interferire.Lo shock termico mediante elettroporazione coltiva a 42 gradi Celsius per esattamente 15 minuti in un bagno termico, ma lasciare la coltura di controllo senza shock termico a 32 gradi. Trasferire immediatamente entrambe le colture in provette coniche da 50 millilitri refrigerate e lasciarle in una miscela di ghiaccio e acqua per cinque minuti. Mantenere le cellule a temperature basse è fondamentale per la loro competenza.Non risospendere mai le cellule mediante pipettaggio ripetuto o vortex. Centrifugare ora le colture, scartare il soprannatante e lavare il pellet in glicerolo al 10% freddo su ghiaccio; aggiungere prima cinque millilitri di glicerolo. Successivamente risospendere.Sospendere le cellule agitando delicatamente e mescolando, quindi aggiungere altri 20 millilitri di glicerolo. Ripetere la centrifugazione e la risospensione nel glicerolo al 10% altre due volte, quindi centrifugare nuovamente le cellule. A questo punto, il pellet cellulare potrebbe essere molto fragile e si deve fare attenzione durante l’eliminazione del soprannatante.Ora sospendere il pellet in un millilitro di glicerolo freddo al 10% e trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare le cellule per 30 secondi a 12.000 G a quattro gradi Celsius e rimuovere la maggior parte del soprannatante, lasciando circa 90 microlitri di cellule nel glicerolo. A questo punto, le cellule possono essere conservate a -80 gradi Celsius.Tuttavia, ciò potrebbe ridurre la loro competenza. Aggiungere ora due microlitri o 50 nanogrammi del plasmide digerito con BAM H uno alle cellule e mescolare delicatamente utilizzando la punta di una pipetta. Trasferire la miscela in una cuvetta da elettroporazione da un millimetro e trattare le cellule.Successivamente, aggiungere 300 microlitri di SOC e lasciare rigenerare le cellule per due ore a 32 gradi Celsius senza agitazione. Al termine del periodo di recupero, seminare le cellule su agar LB contenente 50 microgrammi di ampicillina per millilitro di soluzione. Quindi, incubare le cellule a 32 gradi Celsius per 24-30 ore il giorno successivo.Effettuare la selezione delle colonie con corretta riparazione per gap mediante PCR. Utilizzare i primer T tre e RA check per il frammento RA e i primer T sette e LA check per il frammento LA. È fondamentale verificare entrambe le braccia, poiché a volte si osserva l'incorporazione di una sola delle due braccia.I primer di controllo devono essere progettati a una distanza di 100-200 paia di basi dalla regione bersaglio. Se i passaggi successivi non dovessero riuscire, questi primer possono essere convalidati utilizzando primer adiacenti e il plasmide originale come stampo. Le colonie positive ottenute dalla PCR mostreranno una banda che migra a un livello compreso tra 800 e 1000 paia di basi.Coltivare le colonie positive a 32 gradi Celsius in quattro millilitri di terreno con ampicillina per tutta la notte; da queste cellule può essere preparata una riserva congelata per un uso successivo. Iniziare amplificando il cassetto di knock-out di RFP dal plasmide linearizzato utilizzando i primer appropriati. Successivamente, purificare il prodotto in gel e sospenderlo in 20 microlitri di acqua sterile.Il frammento RFP con cassette e le braccia di omologia dovrebbe avere una lunghezza di circa tre chilobasi. Inoculare un millilitro della coltura saturata di SW102 Pac-Man KO in 44 millilitri di terreno LB contenente ampicillina. Far crescere a 32 gradi Celsius in agitazione fino a un OD600 compreso tra 0,2 e 0,3.Includere anche un campione identico come controllo negativo non sottoposto a shock termico. Dopo che le colture hanno raggiunto la densità desiderata, purificarle per elettroporazione come descritto nella sezione precedente. Successivamente, elettroporare circa 100 nanogrammi della cassetta di targeting in 90 microlitri di cellule elettrocompetenti utilizzando lo stesso metodo precedentemente descritto.Dopo che le cellule si sono riprese per due ore, seminarle su agar LB contenente ampicillina e canamicina e incubare le piastre per 24-30 ore a 32 gradi Celsius. Il giorno successivo, coltivare colture da cinque millilitri provenienti da cinque colonie diverse a 32 gradi Celsius per tutta la notte. Nella mattina seguente, eseguire una mini prep grezza ed analizzare metà del DNA ottenuto su un gel di agarosio all'1% per verificare la presenza di un plasmide a basso peso molecolare.Non dovrebbe esserci alcun plasmide che migra al di sotto di 12 kilobasi, come si osserva nella corsia due di questo gel. Preparare ora un'analisi da uno a 500 del DNA proveniente da una colonia positiva e utilizzare un microlitro del DNA diluito per trasformare 50 microlitri di cellule epi 300. Piastrare le cellule epi 300 recuperate su agar LB contenente ampicillina e canamicina e incubarle per 18-24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, inoculare una singola colonia in 10 millilitri di lb con antibiotici e coltivare in agitazione durante la notte. La mattina seguente, utilizzare il coltura saturo per inoculare 100 millilitri di lb.Aggiungere gli antibiotici appropriati e aggiungere 100 microlitri di soluzione di controllo della copia 1000x. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per cinque-sei ore con agitazione nel corso della stessa giornata. Eseguire una maxi prep e verificare l'inserzione del cassetto nel sito corretto mediante sequenziamento.Ora progettare ed eseguire un test di digestione con enzimi di restrizione utilizzando un clone con risultati di sequenziamento corretti per caratterizzare il vettore combier. In questo esempio, il vettore di targeting CG 3 2 0 9 5 è stato digerito in serie con PAC uno, ASC uno, BH uno e a T due. La comparsa di tutte le bande previste e l'assenza di bande anomale confermano che il vettore di targeting è stato correttamente combier.Il vettore può ora essere trasformato in moscerini. I moscerini trasformati che esprimono la ricombinasi possono essere selezionati tra la loro prole. Si noti che i vettori di grandi dimensioni sono sensibili al taglio meccanico.Evitiamo cicli di congelamento e scongelamento e prepariamo il DNA fresco per l'iniezione. Le mosche transgeniche risultanti contengono il costrutto di targeting in un sito di inserimento predefinito, ma non ancora nel locus endogeno del genoma. L'ultimo passaggio, che consiste nella sostituzione del locus endogeno, non richiede ulteriore biologia molecolare, ma soltanto metodi standard di Drosophila già pubblicati, che includono la mobilizzazione mediata da shock termico della cassetta di targeting e uno screening delle mosche per la re-integrazione della cassetta di targeting lontano dal sito di inserimento originale.Questi metodi sono descritti in pubblicazioni recenti. L'amplificazione dei bracci di omologia LA e RA dovrebbe produrre frammenti di 500 paia di basi, mentre la reazione P-C-R-S-O-E dovrebbe generare un prodotto di un chilobase. La reazione BP è generalmente molto efficiente.La trasformazione batterica del suo prodotto di solito produce da cinque a 100 colonie. Quasi tutte le colonie analizzate con un controllo PCR mostrano il prodotto atteso durante il primo ciclo di ricombinazione. Si prevede di ottenere da 20 a 40 colonie dopo aver trasformato il Pacman KO 1.0 digerito, contenente i bracci LA e RA, in cellule SW102 contenenti il gene di interesse. Il 40-60% di queste linee cellulari conterrà il prodotto di ricombinazione desiderato.In questo esempio, sono state ottenute circa 60 colonie e il controllo mediante PCR ha mostrato che circa il 60% delle colonie portava il prodotto di ricombinazione desiderato. Il secondo ciclo di ricombinazione è tipicamente molto più efficiente. Normalmente si osservano da tre a 50 colonie dopo la trasformazione, con il 90-95% che contiene la costruzione desiderata. I plasmidi al di sotto di 12 chilobasi identificano colonie falsamente positive, come nel caso della copia numero due.In questo esempio, durante il tentativo di questo protocollo, è importante ricordare che nei batteri la ricombinazione di frammenti di DNA di grandi dimensioni è molto inefficiente. Pertanto, per ottenere risultati ottimali è fondamentale preparare cellule competenti di alta qualità e utilizzare DNA fresco.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come generare un vettore di targeting per la ricombinazione omologa N out in Drosophila. Questo vettore potrebbe essere utilizzato per produrre qualsiasi manipolazione pulita e definita a livello molecolare di geni singoli nei loro loci endogeni.

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