Un romanzo ad alta risoluzione In vivo Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere immagini ad alta risoluzione di singole cellule di cellule progenitrici derivate dal midollo osseo seguendo i loro modelli di reclutamento nel cervello normale e nella vascolarizzazione associata al tumore cerebrale nel tempo. Ciò si ottiene rimuovendo la tibia e il femore dai topi donatori per ottenere cellule progenitrici fluorescenti del midollo osseo e quindi iniettando tali cellule in un topo ricevente irradiato. Il secondo passo consiste nel generare xenotrapianti intracranici di GB M nei topi chimerici all'interno di una camera cranica.

Successivamente, i topi vengono sottoposti a una varietà di regimi di trattamento, tra cui la radiazione stereotassica. Il passaggio finale consiste nell'acquisire immagini dei topi su un microscopio confocale a due fotoni. In definitiva, questa metodologia può essere utilizzata per studiare dinamicamente i meccanismi della vascolarizzazione intracranica in una varietà di modelli.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'istopatologia dei tessuti ex vivo, è che possiamo studiare le informazioni dinamiche critiche relative alla formazione dei vasi nel cervello. Pertanto, possiamo rispondere a domande chiave sui meccanismi della neovascolarizzazione intercranica. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per fornire informazioni sulla neovascolarizzazione intracranica, può anche essere applicato ad altri sistemi e processi patologici nel cervello, come l'ischemia intracranica o l'ictus, la malattia neurodegenerativa e i meccanismi delle metastasi delle cellule tumorali al cervello.

Ai fini di questo video, non siamo stati in grado di seguire una rigorosa tecnica asettica. In quanto tale, il cappuccio di biosicurezza è un eccesso di apertura di 12 pollici e gli animali non sono drappeggiati, consentendo allo spettatore un'immagine più chiara e un migliore accesso per orientare le procedure per il lavoro sperimentale. La tecnica asettica deve essere seguita rigorosamente.

Iniziare questa procedura confermando l'espressione della fluorescenza del topo donatore di GFP e sopprimerlo secondo le linee guida del comitato istituzionale per la cura degli animali. Successivamente, pulire entrambi gli arti posteriori e rimuovere la tibia e il femore mentre si lavora in condizioni asettiche. Rimuovi tutto il tessuto in eccesso dalle ossa.

Quindi rimuovere le placche terminali da entrambe le estremità delle quattro ossa estratte. Sciacquarli con un ago calibro 22 e un millilitro di PBS sterile. Diventeranno chiari una volta che tutto il midollo osseo è stato espulso.

Successivamente, mescolare la sospensione di midollo osseo estratta. Beh, dovrebbe contenere circa 20 milioni di cellule, che sono sufficienti per la ricostituzione di tre topi ospiti. Quindi, preparare 3 aghi per tubercolina calibro 27 e aspirare 300 microlitri di sospensione di midollo osseo in ciascuno di essi.

Mentre il mouse è posizionato nel sistema di ritenuta. Segna la superficie della coda dorsale per orientarti. Quindi iniettare la sospensione nella vena caudale laterale di tre precedentemente irradiate.

Nod skid topi in questa procedura che lavorano in condizioni asettiche. Anestetizzare i topi skid del midollo osseo chimerico e somministrare analgesia preventiva approvata da iacuc. Applicare il gel lacrimale per prevenire la disidratazione corneale.

Pulire la testa prima con la soluzione di Betadine, poi con alcool e rimuovere i peli in eccesso. Quindi pulire ulteriormente il cuoio capelluto sottostante con alcool. Fai un'incisione dal punto medio delle orecchie fino a poco sopra gli occhi.

Rimuovere il cuoio capelluto su entrambi i lati della prima incisione per esporre circa cinque millimetri del cranio sottostante. Quindi identificare i punti di riferimento anatomici della superficie del cranio. Successivamente, identificare e sollevare il periostio iniettando il 2% di lidocaina con una soluzione di epinefrina.

Successivamente sezionare il periostio lontano dalla superficie del cranio con uno strumento affilato. Quindi utilizzare un trapano di rifinitura TR da 2,7 millimetri per indebolire un lembo osseo circolare da 2,7 millimetri sull'emisfero destro del cranio equidistante sia da Lambda che da bgma. Non penetrare nell'osso con il trapano per proteggere la dura e il tessuto sottostante.

Ora, rimuovi il lembo osseo indebolito usando la dissezione, le pinzette e il gancio dentale con forza deliberata ma controllata. Quindi, caricare una siringa Hamilton calibro 30 con 10 microlitri di sospensione cellulare e posizionare l'ago sul telaio stereotassico. Quindi posizionare il mouse sul telaio stereotassico.

Allineare l'ago al punto centrale della finestra generata dopodiché, abbassare l'ago fino a toccare la superficie corticale. Quindi reimposta le coordinate digitali. Ora abbassa l'ago di 3,2 millimetri nel tessuto corticale.

Quindi ritrarre di 0,2 millimetri e iniettare a tre millimetri. L'iniezione di profondità deve essere effettuata a una velocità di 10 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago in posizione per un minuto prima di ritrarlo lentamente.

Quindi rimuovere il mouse dalla cornice. Successivamente, mantenere idratata la superficie cerebrale. Utilizzando gocce di PBS sterile.

Posizionare un vetrino coprioggetti da tre millimetri sulla superficie del cervello per sigillare la finestra da 2,7 millimetri. Quindi asciugare l'osso del cranio circostante. Quindi, applicare il legante veterinario per incollare il tessuto del cuoio capelluto all'osso del cranio e mantenere il vetrino coprioggetti in posizione.

Non applicare troppo in quanto fuoriesce sotto il vetro e riduce il potenziale di imaging. Quindi, mescola la polvere acrilica dentale fresca e la soluzione nel cappuccio e applica la miscela sul legame veterinario utilizzando un ago calibro 22. Per garantire una tenuta ermetica, applicare l'acrilico in modo che si sovrapponga leggermente al bordo del vetrino, ma non in modo che copra il vetrino.

In questa fase, posizionare un topo anestetizzato in un sistema di ritenuta personalizzato per la testa all'interno dell'irradiatore stereotassico XAD 2 25 progettato dalla casa. Ottenere una TAC a fascio conico a 360 gradi con il tubo a raggi X che funziona a una tensione di picco di 40 kilo e 0,05 milliampere attraverso un filtro in alluminio da due millimetri. Utilizzare l'immagine per posizionare il tavolino in modo tale che il centro ISO della radiazione sia puntato verso l'emisfero destro e sia centrale nella direzione ventrale dorsale.

È disponibile un'ampia varietà di collimatori per indirizzare la radiazione, il che dimostra l'adattabilità del modello. In questo caso, usiamo otto millimetri per 11 millimetri per l'irradiazione emisferica. Inserire il collimatore emisferico nell'irradiatore stereotassico X RAD 2 25.

Ottenere le singole immagini ortogonali TC sia dall'alto che dal basso attraverso il collimatore per garantire il corretto posizionamento della testa localizzando le strutture ossee anatomiche e regolando manualmente la posizione del tavolino sul monitor. Sostituire il filtro in alluminio XAD 2 25 IRRADIATOR con un filtro per il trattamento del rame da 0,93 millimetri. Quindi eseguire il programma del tubo a raggi X a 225 di picco di tensione e 13 milliampere e somministrare metà della dose di radiazioni dall'alto in una direzione AP.

Riportare il gantry nella posizione inferiore e somministrare la seconda metà della dose di radiazioni dal basso in direzione PA. In questa procedura, anestetizzare il topo della finestra intracranica precedentemente generato e pulire la finestra con spray alcolico. Impostare i canali sul microscopio confocale come determinato dai fluorocromi integrati nel topo chimerico generato.

In alternativa, riutilizzare le impostazioni precedenti per ridurre la variabilità tra le sessioni di imaging. In questo caso, iniettare tutti i tag necessari per l'imaging nella vena caudale laterale, destrano per la vascolarizzazione. Capovolgere il mouse sul sistema di ritenuta della testa costruito su misura, supportato da plastilina modellabile, assicurandosi che la testa sia perpendicolare al laser e caricare in piano il sistema di ritenuta sul tavolino mobile del microscopio.

Accendere il laser del primo canale e posizionarlo al centro della finestra intracranica guardando direttamente il punto di intersezione del raggio laser sulla finestra della camera. Scatta un'immagine di ciascun canale per l'intera finestra con una lente cinque x e usala come mappa per altre immagini a risoluzione più elevata con lenti a lungo raggio 10 x e 20 x. Questo schema evidenzia gli errori tecnici associati al processo chirurgico e dimostra l'effetto che ciascuno di essi avrà sulle immagini prodotte.

L'aria intrappolata sotto la finestra sarà visibile come bolle sulle immagini. L'accumulo di acrilico sul vetro è autofluorescente nel canale rosso lontano e bloccherà parte del campo visivo. Allo stesso modo, lo sporco sulla finestra durante l'imaging si presenta come flessione autofluorescente nelle immagini.

Anche la finestra intracranica perfetta può incontrare problemi una volta che è sotto il microscopio. Gli artefatti di respirazione producono immagini allineate, mentre un cattivo posizionamento del mouse sul fotogramma si traduce in un'immagine segmentata. Poiché il laser attraversa solo una parte del tessuto con la post-elaborazione dell'immagine, è possibile aggiungere un canale aggiuntivo per le cellule marcate con CFP, in base al quale le immagini GFP possono essere sottratte dalle immagini CFP per rivelare il vero segnale CFP.

Inoltre, utilizzando l'autofluorescenza di seconda generazione armonica caratteristica delle quattro fibre di collagene, siamo in grado di visualizzare la membrana basale del sistema vascolare. La disponibilità di cinque canali fluorescenti consente all'utente una grande flessibilità e adattabilità del nuovo modello di mirroring descritto in questo articolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere a mente i prodotti pericolosi utilizzati durante le procedure chirurgiche.

È inoltre essenziale essere meticolosi e prestare particolare attenzione ai dettagli per garantire che il tessuto cerebrale rimanga intatto durante l'imaging a lungo termine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un topo chimerico con cellule progenitrici fluorescenti e, a sua volta, essere in grado di acquisire immagini ad alta risoluzione in tempo reale del sistema vascolare intracranico dopo l'impianto di cellule tumorali con o senza intervento terapeutico.