Un romanzo ad alta risoluzione

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini ad alta risoluzione a livello di singola cellula di cellule progenitrici derivate dal midollo osseo, seguendone i modelli di reclutamento nella vascolarizzazione del cervello normale e associata ai tumori cerebrali nel tempo. Questo viene realizzato rimuovendo la tibia e il femore da topi donatori per ottenere cellule progenitrici fluorescenti del midollo osseo, che vengono quindi iniettate in topi riceventi irradiati. Il secondo passaggio consiste nella generazione di xenotrapianti intracranici di GBM in topi chimera all'interno di una camera con finestra cranica.

In seguito, i topi vengono sottoposti a diverse terapie, inclusa la radioterapia guidata stereotassica. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i topi mediante un microscopio confocale a due fotoni. In definitiva, questa metodologia può essere utilizzata per studiare dinamicamente i meccanismi di vascolarizzazione intracranica in diversi modelli.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'istopatologia di tessuto ex vivo, è che possiamo studiare informazioni dinamiche fondamentali relative alla formazione dei vasi nel cervello. In questo modo, possiamo rispondere a domande chiave sui meccanismi della neoangiogenesi intracranica. Sebbene questo metodo possa essere utilizzato per ottenere informazioni sulla neoangiogenesi intracranica, può anche essere applicato ad altri sistemi e processi patologici nel cervello, come l'ischemia intracranica, l'ictus, le malattie neurodegenerative e i meccanismi di metastasi delle cellule tumorali al cervello.

Per scopi dimostrativi di questo video, non è stato possibile seguire una tecnica asettica rigorosa. Pertanto, la cappa di sicurezza biologica presenta un'apertura superiore ai 12 pollici e gli animali non sono coperti con teli, in modo da offrire allo spettatore un'immagine più chiara e un migliore orientamento delle procedure per il lavoro sperimentale. La tecnica asettica deve essere rigorosamente seguita.

Iniziare questa procedura verificando l'espressione della fluorescenza nel topo donatore GFP ed eutanasia secondo le linee guida del comitato istituzionale per la cura degli animali. Successivamente, pulire entrambi gli arti posteriori e rimuovere la tibia e il femore operando in condizioni asettiche. Rimuovere tutti i tessuti in eccesso dalle ossa.

Quindi rimuovere le piastre terminali da entrambe le estremità delle quattro ossa estratte. Lavare con un ago da 22 gauge e un millilitro di PBS sterile. Diventeranno trasparenti una volta che tutto il midollo osseo sarà stato eliminato.

In seguito, mescolare bene la sospensione di midollo osseo estratta. Essa dovrebbe contenere circa 20 milioni di cellule, quantità sufficiente per la ricostituzione di tre topi ospiti. Successivamente, preparare 3 aghi tubercolinici da 27 gauge e aspirare 300 microlitri di sospensione di midollo osseo in ciascuno di essi.

Mentre il mouse è posizionato nel dispositivo di contenimento, segnare la superficie dorsale della coda per orientarsi. Quindi iniettare la sospensione nella vena laterale della coda di tre soggetti preesposti a irradiazione.

Utilizzare topi nod skid in questa procedura lavorando in condizioni asettiche. Anestetizzare i topi chimera con midollo osseo nod skid e somministrare un'analgisia preventiva approvata dal comitato iacuc. Applicare un gel lacrimale per prevenire la disidratazione corneale.

Pulire prima la testa con soluzione di Betadine, quindi con alcol ed eliminare i peli in eccesso. Successivamente, pulire ulteriormente il cuoio capelluto sottostante con alcol. Praticare un'incisione dal punto medio delle orecchie appena sopra gli occhi.

Rimuovere il cuoio capelluto su entrambi i lati della prima incisione per esporre circa cinque millimetri del cranio sottostante. Successivamente, identificare i punti di repère anatomici della superficie cranica. Quindi, identificare e sollevare il periostio iniettando una soluzione di lidocaina al 2% con adrenalina.

Successivamente dissezionare il periosteo dalla superficie del cranio utilizzando uno strumento appuntito. Quindi utilizzare una fresa TR da 2,7 millimetri per indebolire una falda ossea circolare di 2,7 millimetri nell'emisfero destro del cranio, equidistante sia da Lambda che da bgma. Non penetrare l'osso con la fresa, al fine di proteggere la dura madre e i tessuti sottostanti.

Ora, rimuovere il lembo osseo indebolito utilizzando la dissezione, le pinzette e l'uncino dentale con forza controllata ma decisa. Successivamente, caricare una siringa Hamilton da 30 gauge con 10 microlitri di sospensione cellulare e posizionare l'ago sul supporto stereotassico. Quindi, posizionare il topo sul supporto stereotassico.

Allineare l'ago al punto centrale della finestra generata; successivamente, abbassare l'ago fino a quando non tocca la superficie corticale. A questo punto, reimpostare le coordinate digitali. Ora abbassare l'ago di 3,2 millimetri all'interno del tessuto corticale.

Quindi ritirare di 0,2 millimetri e iniettare a tre millimetri. L'iniezione in profondità deve essere eseguita a un ritmo di 10 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago in posizione per un minuto prima di ritirarlo lentamente.

Rimuovere quindi il mouse dal supporto. Successivamente, mantenere idratata la superficie del cervello utilizzando gocce di PBS sterile.

Posizionare un'immersione di vetro da tre millimetri sulla superficie del cervello per sigillare la finestra da 2,7 millimetri. Quindi asciugare l'osso cranico circostante. Successivamente, applicare il vet bond per incollare il tessuto del cuoio capelluto all'osso cranico e mantenere l'immersione al suo posto.

Non applicare troppo materiale, poiché potrebbe fuoriuscire sotto il vetro e ridurre la qualità dell'immagine. Successivamente, mescolare la polvere e la soluzione acrilica fresca sotto la cappa ed applicare la miscela sopra il vet bond utilizzando un ago da 22 gauge. Per garantire una sigillatura ermetica, applicare l'acrilico in modo che si sovrapponga leggermente al bordo del vetrino, senza coprire il vetrino stesso.

In questo passaggio, posizionare un topo anestetizzato in un sistema di fissaggio cranico personalizzato all'interno dell'irradiatore stereotassico XAD 2 25 progettato. Acquisire una scansione TC a cono a 360 gradi con il tubo a raggi X impostato a 40 chilovolt di picco e 0,05 milliampere attraverso un filtro in alluminio da due millimetri. Utilizzare l'immagine per posizionare la piattaforma in modo che il centro ISO della radiazione sia diretto verso l'emisfero destro e risulti centrale nella direzione dorso-ventrale.

È disponibile una vasta gamma di collimatori per indirizzare la radiazione, il che dimostra l'adattabilità del modello. In questo caso, utilizziamo un collimatore di otto millimetri per undici millimetri per l'irradiazione emisferica. Inserire il collimatore emisferico nell'irradiatore stereotassico X RAD 2 25.

Ottenere le singole immagini ortogonali TC sia dalla parte superiore che da quella inferiore attraverso il collimatore, per verificare il corretto posizionamento della testa localizzando le strutture ossee anatomiche e regolando manualmente con precisione la posizione dello stadio sul monitor. Sostituire il filtro in alluminio XAD 2 25 IRRADIATOR con un filtro in rame da 0,93 millimetri. Successivamente, eseguire il programma del tubo a raggi X a 225 kilovolt di picco e 13 milliampere ed erogare metà della dose di radiazione dalla parte superiore in direzione antero-posteriore (AP).

Riportare il gantry nella posizione inferiore ed erogare la seconda metà della dose di radiazione dal basso in direzione PA. In questa procedura, anestetizzare il topo con finestra intracranica precedentemente generata e pulire la finestra utilizzando una spruzzata di alcol. Configurare i canali sul microscopio confocale in base ai fluorocromi integrati nel topo chimera generato.

In alternativa, riutilizzare le impostazioni precedenti per ridurre la variabilità tra le sessioni di imaging. Iniettare eventuali marcatori necessari per l'imaging nella vena laterale della coda, in questo caso dextrano per la vascolarizzazione. Capovolgere il topo sul sostegno per la testa appositamente costruito, sostenendolo con plastilina modellabile, assicurandosi che la testa sia perpendicolare al laser e posizionare il sostegno sullo stage mobile del microscopio.

Accendere il laser del primo canale e posizionarlo al centro della finestra intracranica osservando direttamente il punto di intersezione del raggio laser sulla finestra della camera. Acquisire un'immagine di ciascun canale per l'intera finestra utilizzando un obiettivo 5x e usarla come mappa per altre immagini ad alta risoluzione ottenute con obiettivi a lunga distanza 10x e 20x. Questo schema evidenzia gli errori tecnici associati al processo chirurgico e illustra l'effetto che ciascuno di essi avrà sulle immagini prodotte.

L'aria intrappolata sotto la finestra apparirà come bolle nelle immagini. L'accumulo di acrilico sul vetro è autofluorescente nel canale del rosso estremo e oscurerà parte del campo visivo. Analogamente, la sporcizia sulla finestra durante l'acquisizione appare come flessioni autofluorescenti nelle immagini.

Anche la finestra intracranica perfetta può presentare problemi una volta posizionata sotto il microscopio. Gli artefatti respiratori producono immagini a linee, mentre un posizionamento scorretto del topo sul telaio provoca immagini segmentate. Poiché il laser attraversa solo una parte del tessuto, con un successivo processamento dell'immagine è possibile aggiungere un canale aggiuntivo per cellule marcate con CFP, in modo che le immagini GFP possano essere sottratte dalle immagini CFP per rivelare il segnale CFP reale.

Inoltre, sfruttando la caratteristica autofluorescenza della generazione di armoniche di secondo ordine delle fibre di collagene IV, siamo in grado di ottenere immagini della membrana basale della vascolarizzazione. La disponibilità di cinque canali fluorescenti offre all'utente una notevole flessibilità e adattabilità del modello innovativo di specchiatura descritto in questo articolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente i prodotti pericolosi utilizzati durante gli interventi chirurgici.

È inoltre fondamentale essere meticolosi e prestare particolare attenzione ai dettagli per garantire che il tessuto cerebrale rimanga intatto durante l'intero processo di imaging a lungo termine. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come creare un topo chimerico con cellule progenitrici fluorescenti e, di conseguenza, essere in grado di acquisire immagini in tempo reale ad alta risoluzione della vascolarizzazione intracranica dopo l'innesto di cellule tumorali, con o senza intervento terapeutico.