Analisi co-coltura delle interazioni proteina extracellulare che influenzano secrezione di insulina da parte del pancreas cellule beta

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare come le interazioni transcellulari che coinvolgono i domini extracellulari di specifiche proteine transmembrana influenzino la funzione delle cellule beta e più specificamente la secrezione di insulina. Ciò si ottiene effettuando prima il sezionamento, una linea cellulare di mammifero con un plasmide contenente la proteina di interesse nella seconda fase. Una linea cellulare beta è in co-coltura con le cellule di mammifero.

Nella fase finale, la co-coltura viene incubata in terreni con diverse concentrazioni di glucosio al fine di consentire la valutazione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio. In definitiva, i radioimmunodosaggi insulinici o Eliza vengono utilizzati per valutare i livelli di insulina secreta nel terreno dalle cellule beta in coltura. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la sovraespressione genica e il knockdown, è che evita la perturbazione dell'mRNA e dell'espressione proteica che potenzialmente influisce sulla salute e/o sulla funzione delle cellule beta in modi che possono confondere le analisi dell'interazione specifica della proteina.

Iniziare trasferendo le celle HEC 2 93 in una piastra da 24 pozzetti in 0,5 millilitri di terreno HEC 2 93 per pozzetto per garantire che le celle siano distribuite uniformemente sul fondo della piastra. Agitare la piastra lungo un asse alla volta con velocità sincrona all'onda formata nel pozzetto. Quando le cellule HEC 2 93 raggiungono il 100% di co, la fluenza trasfetta le colture con 0,8 microgrammi del plasmide che codifica per la proteina di interesse in due microlitri di lipo 2000.

Secondo il protocollo lipo, lo schema generale della co-coltura che sta per essere dimostrata è qui raffigurato utilizzando un dispositivo di rimozione cellulare non enzimatico. Iniziare questa fase raccogliendo le cellule INS 1 a circa il 70-80% di fluenza dal fondo di un pallone di coltura T 75. Dopo aver fatto girare le celle per tre minuti a 150 Gs a temperatura ambiente, utilizzare una pipetta P 1000 per risospendere il pellet in un millilitro di metà INS uno e mezzo.

I terreni utilizzano quindi una pipetta da 10 millilitri per aggiungere altri 24 millilitri di terreno misto e sospendono nuovamente le cellule, aspirano i terreni dai pozzetti della piastra a 24 pozzetti contenente le cellule HEC 2, 9, 3. Quindi, utilizzando una pipetta P 1000, aggiungere delicatamente 500 microlitri della sospensione di una cellula INS sullo strato di cellule esagonali lungo i lati del pozzetto. Dopo ogni sei pozzetti, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per risospendere le cellule INS one.

Anche in questo caso per garantire una sospensione cellulare omogenea. Ora incubare le cellule per 24-48 ore, a seconda del protocollo sperimentale. Dopo che le cellule sono state incubate per il periodo sperimentale desiderato, un pozzetto alla volta, aspirare il terreno di co-coltura con una mano e sostituire immediatamente il terreno con 250 microlitri di glucosio da 2,5 millimolari nel tampone bicarbonato ringer di Krebs con l'altra.

Dopo aver pre-incubato le cocolture per un'ora, sostituire il tampone KRB a basso contenuto di glucosio con 250 microlitri di glucosio da 2,5 millimolari o 20 millimolari. Dopo un'altra ora di incubazione, trasferire il tampone KRB in provette per microfusibili e far girare il tampone per cinque minuti a 1500 Gs e quattro gradi Celsius mentre le provette sono nella centrifuga. Aggiungere immediatamente 100 microlitri di tampone di lisi cellulare rippa con inibitori della proteasi alla piastra e incubare la piastra per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Quando le provette hanno finito di girare, rimuovere 200 microlitri di surnatante per una successiva analisi mediante radioimmunodosaggio insulinico o Eliza. Infine, centrifugare quello che ora è il lisato cellulare per 15 minuti a 10.000 g e quindi rimuovere 50 microlitri di SNAT per l'analisi mediante immunodosaggio radio insulinico o Eliza. Qui vengono mostrati i risultati ottenuti dalla co-coltura di cellule beta INS one con cellule HC 2 93 trasfettate per esprimere un'isoforma neuro liggen qui indicata come NLX.

L'espressione di NLX ha aumentato la secrezione basale e stimolata di insulina da parte di cellule I NS one co-coltivate. Il dominio extracellulare NX deve interagire con un'altra proteina o molecola sulla superficie cellulare di I NS per indurre le cellule INS a secernere più insulina. I risultati di altri tipi di analisi che utilizzano il sistema di co-coltura sono illustrati in questi due grafici seguenti.

In questo primo grafico, viene mostrato l'aumento del contenuto di insulina delle cellule INS 1 co-coltivate da parte di NLY. Mentre in questo esperimento, l'RNA è stato raccolto dallo strato cellulare e analizzato da R-T-Q-P-C-R. La co-coltura con NLY ha aumentato i livelli di mRNA di insulina e PDX one.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire metodi aggiuntivi come la QPCR o l'immunoistochimica quantitativa per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se le interazioni extracellulari della proteina trasfettata possono causare cambiamenti nella struttura cellulare o nell'espressione genica.