Name: Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Impara a coltivare cellule primarie del dotto collettore midollare interno di ratto per studiare il riassorbimento dell'acqua mediato dall'arginina-vasopressina. Questo metodo consente di analizzare i meccanismi molecolari della fisiologia renale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL KL 1415/3-2 e 1415/4-2).

1. Preparazione <ol><li> Preparare i piatti della cultura <ol><li> Disgelo collagene tipo IV O / N a 4 ° C e sciogliere in 0,1% di acido acetico sterile. Il volume da utilizzare dipende dal tipo e dal numero di piatti in cui le cellule devono essere seminato. Usare 2 ug / cm 2. </li><li> Incubare piatti almeno per 1 ora a RT e lavare due volte con acqua distillata (A. tridest). </li><li> Lasciare i piatti ad asciugare correttamente. </li></ol></li><li> La supplementazione di medie <ol><li> Aumentare il livello di glucosio fino a 4,5 g / L aggiungendo 1,75 g di glucosio a 500 ml di terreno. Per regolare il mezzo a 600 mosmol, aggiungere 100 mM NaCl 100 mM e urea, per aumentare l&#39;osmolarità da 200 mosmol e 100 mosmol, rispettivamente. </li><li> Aggiungere 1% di acidi non essenziali aminoacidi, 1% ultroser, 500 pM dbcAMP, 20 U / ml nistatina e 0,25 mcg / ml gentamicina (diluizione 1:200 di soluzione madre con una concentrazione di 50 ug / ml) a 600 mosmol mezzo DMEM fresco il giorno della preparazione. </li></ol></li&gt; <li> Soluzione enzimatica <ol><li> Aggiungere 1 mg / ml di ialuronidasi e 2,2 mg / ml di collagenasi di DPBS-contenente 0,25 mg / ml di gentamicina e nistatina. Preparare 1 ml di questa soluzione di enzimi per la digestione di 2 rene midollare interna. La soluzione deve essere sterilizzata per filtrazione ed è memorizzato in 50 ml provette Falcon. </li></ol></li></ol> 2. La coltivazione di primaria Rat midollare interna dotto collettore (IMCD) Cells Tutte le procedure di movimentazione animali devono essere effettuati in conformità con la legislazione locale e federale. <ol><li> Anestetizzare topi in CO 2 (in una scatola saturo di CO 2) o isoflurano (U-400 Anestesia unità, Univentor Ltd., Malta, il flusso d&#39;aria 350-400 ml / min con 2-2.5% isoflurano). Decapitare gli animali per i sanguinamenti che consente il rilevamento esatto del confine tra il biancastro interiore e la midollare esterna più scura. Inoltre, il sanguinamento minimizza il numero di eritrociti isolati. Rimuovere i reni elavarli in DPBS sterile addizionato con gentamicina e nistatina (vedi sopra) in ghiaccio. Gli ulteriori passi devono essere effettuate in condizioni sterili banco pulito. </li><li> Trasferire i reni dalla soluzione DPBS su una compressa sterile per rimuovere il liquido in eccesso. Rimuovere la capsula renale grasso con pinze e forbici sterili. </li><li> Avendo il rene ancora risolto nel comprimere, taglio leggermente vicino all&#39;asse longitudinale del (corticale) lato esterno. Assicurarsi di non tagliare completamente, ma di lasciarla in un unico pezzo, collegato nella pelvi renale. </li><li> Con forbici curve con attenzione sezionare la midollare interna biancastra, che sono circondati dal luccicante midollare esterna rosato. Li Raccogliere in DPBS, contenente gentamicina e nistatina in una capsula di Petri 60 millimetri sul ghiaccio. </li><li> Una volta che tutti midollare sono isolati e raccolti su ghiaccio, ridurre il volume di DPBS ad un livello in cui essi sono solo coperti con tampone. Utilizzare una lametta sterile per tagliare la midollare a cubetti di 53 mm. </li><li> Fondere e arrotondare la punta di una pipetta Pasteur sterile tenendolo per breve tempo in una fiamma. Assicurarsi che la pipetta viene raffreddata prima di continuare. </li><li> Trasferire la sospensione dei tessuti per i 50 ml provette Falcon contenenti preparati al momento soluzione enzimatica sterile con ialuronidasi e collagenasi (vedi 1.3.1) utilizzando il arrotondata pipetta Pasteur. Chiudere il coperchio e incubare a 37 ° C sotto continua agitazione (220 rpm) a bagnomaria tavolo regolare per 1,5 - 2 ore. </li><li> Per triturazione della sospensione, la miscela pipettare su e giù diverse volte al tondo pipetta Pasteur (vedere sopra) finché la sospensione diventa torbida omogenea. </li><li> Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 300 xg e 16 ° C. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet a fondo in DPBS, contenente gentamicina e nistatina e centrifugare di nuovo. Ripetere questa fase di lavaggio una volta. </li><li> Risospendere le cellule in terreno completamente integrato e loro seme in cpiatti ultura e / o piastre e micro-titolazione. La preparazione di 2 midollare (1 animali) produce cellule sufficiente per un 60 millimetri piatto di coltura. </li><li> Dopo 24 ore, lavare le cellule due volte con 600 mosmol DMEM e aggiungere mezzo fresco. Durante la settimana successiva le cellule devono essere lavati 2-3 volte (Figura 1). 6-8 giorni dopo la semina, le cellule IMCD possono essere usate per esperimenti. Ricordate di incubare loro in mezzo senza dbcAMP e nistatina per 24 ore prima di iniziare l&#39;esperimento. Altrimenti AQP2 sarà situato esclusivamente nella membrana plasmatica. </li></ol>

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<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
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<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la coltura di cellule IMCD primari di ratto. L&#39;approccio produce fino a 21 cm 2 di cellule da un ratto 20. L&#39;esperimento richiede apparecchiatura standard coltura cellulare e può essere effettuata da una sola persona entro circa 6 ore. Pertanto, questo approccio è adatto come metodo di laboratorio standard. Cellule IMCD primari di ratto possono essere seminate in piastre di coltura di diverse dimensi...

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Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Nella raccolta di cellule principali del dotto renali, arginina-vasopressina (AVP) controlla il riassorbimento dell&#39;acqua stimolando l&#39;inserimento del canale dell&#39;acqua aquaporina-2 (AQP2) nella membrana plasmatica. AVP si lega alla proteina-accoppiato vasopressina di tipo-2 recettore G (V2R) stimolare ciclasi e quindi formazione di cAMP. Apertura di questa cascata di segnalazione porta all&#39;attivazione della proteina chinasi A (PKA). PKA fosforila AQP2 a serina 256 (S256), che è la chiave di innesco per la sua ridistribuzione da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica. L&#39;inserimento della membrana facilita il riassorbimento dell&#39;acqua lungo un gradiente osmotico e di una messa a punto del corpo omeostasi acqua. Disregolazione del riassorbimento dell&#39;acqua AVP-mediata, a causa della secrezione di AVP aberrazioni o cause di segnalazione AVP-attivati ​​o è associata a malattie gravi. Diminuzione del riassorbimento di acqua causata da mutazioni di V2R o AQP2 porta a diabete insipido nefrogenico, mentre un elevated livello di AVP plasma sanguigno è associato a un eccessivo riassorbimento di acqua a malattie cardiovascolari come l&#39;insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico (SIADH). Il significato di riassorbimento dell&#39;acqua AVP-mediata deriva non solo dalla sua implicazione nella malattia. La traslocazione AVP-indotta di vescicole AQP2-cuscinetto a e la fusione con la membrana plasmatica rappresenta un processo di esocitosi strettamente cAMP-dipendente, che attualmente non è ben compreso. Altri esempi per una esocitosi cAMP-dipendente sono secrezione di renina nel rene e H + secrezione nello stomaco. Pertanto, delucidazione dei meccanismi molecolari che regolano la traslocazione-AQP2 in cellule renali principali non solo aiuta a comprendere i processi molecolari simili in altri tipi cellulari, ma può anche aprire la strada a nuove terapie per il trattamento di malattie associate a disturbi del riassorbimento dell&#39;acqua AVP-mediata . Elucidating meccanismi AQP2 controllo richiede la raccolta modelli di cellule principali del dotto. Per questo un certo numero di differenti linee cellulari di rene di mammifero sono disponibili. Tuttavia, questi modelli hanno diversi inconvenienti. In molti sistemi di celle a livello della proteina di AQP2 è basso (Tabella 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, altri ectopicamente iperesprimono umani (MCD4, WT10) 11,12 o ratto (CD8) 13 AQP2. In MCD4 e cellule COS-7 il recettore V2 non viene espresso. A nostra conoscenza non vi è alcuna linea cellulare permanente come un modello disponibile, che è derivato dal renale midollare interna dotto collettore, la parte del rene AQP2 cui espressione è più abbondante, ma dal dotto collettore corticale 1,11,13-16 . Tali modelli cellulari sono per esempio il diffuso immortalato i mTERT-CCD 14 linee cellulari di recente istituzione mpkCCD (ad esempio 17) o. Entrambe le linee cellulari esprimono endogenamente AQP2 e V2R, ma dal momento che sono derivati ​​daldotto collettore corticale molto probabilmente contiene un proteoma diverso rispetto a midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule. Devono per esempio esprimere diversa Na + sistemi di trasporto. Qui vi presentiamo un protocollo per colture primarie cellule IMCD esprimono V2R e AQP2 endogeno. Questo modello, quindi, rappresenta più fedelmente la situazione fisiologica nel dotto collettore renale. Come istituisce la cultura richiede solo normali attrezzature di laboratorio altri laboratori possono facilmente adottare questo approccio.

<table><tbody><tr><td>Collagene di tipo IV Mouse</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

coltura primaria rat midollare interna raccolta cellule del dotto

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginina-vasopressina (AVP) facilita il riassorbimento di acqua da parte renale raccogliendo cellule principali del dotto e quindi una messa a punto del corpo omeostasi acqua. AVP si lega ai recettori V2 della vasopressina (V2R) sulla superficie delle cellule e induce quindi la sintesi di cAMP. Questo stimola processi di segnalazione cellulari che portano ai cambiamenti nella fosforilazione del canale dell&#39;acqua aquaporina-2 (AQP2). Proteina chinasi A phoshorylates AQP2 e innesca così la traslocazione di AQP2 da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica facilitando riassorbimento di acqua da urina primaria. Aberrazioni di AVP liberazione dalla segnalazione ipofisi o AVP-attivato nelle cellule principali possono causare il diabete insipido centrale o nefrogenica, rispettivamente, un plasma sanguigno livello AVP elevata è associata a malattie cardiovascolari come l&#39;insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico. Qui vi presentiamo un protocollo per cultivatiil ratto di primaria midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule, che esprimono V2R e AQP2 endogena. Le cellule sono adatti per chiarire i meccanismi molecolari alla base del controllo di AQP2 e quindi di scoprire nuovi bersagli farmacologici per il trattamento di malattie associate alla disregolazione del riassorbimento dell&#39;acqua AVP-mediata. Cellule IMCD sono ottenuti da topo renale midollare interna e sono utilizzati per esperimenti da sei a otto giorni dopo la semina. Cellule IMCD possono essere coltivate in piatti normali di coltura cellulare, boccette e piastre micro-titolo di formati diversi, la procedura richiede solo poche ore, ed è adatto per laboratori standard di coltura cellulare.

La coltivazione di successo di cellule IMCD primari di ratto si tradurrà in un monostrato confluente 6-8 giorni dopo la semina (Figura 2). A 60 millimetri piatto di coltura sono circa 6 x 10 6 cellule. Le cellule strettamente aderire alle piastre di coltura, in quanto questi sono stati rivestiti con collagene di tipo IV, un componente membrana basale 18. Pertanto, le cellule IMCD non staccarsi nemmeno durante le diverse procedure di lavaggio accurato. Fino al 80% delle cellule in c...

Arginina-vasopressina (AVP) controlla la messa a punto del corpo omeostasi acqua facilitando il riassorbimento di acqua da parte delle cellule principali renali. Qui vi presentiamo un protocollo per la coltivazione di ratto primario midollare interna raccogliere cellule del dotto adatti per la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base di riassorbimento di acqua AVP-mediata.

Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule primarie del dotto collettore midollare interno (IMCD) adatte allo studio del riassorbimento dell'acqua mediato dalla VP. Questo viene ottenuto innanzitutto rimuovendo i reni del ratto. Il secondo passaggio consiste nell'isolare la midollare interna dalla midollare esterna e dalla corteccia circostanti.Successivamente, i meli interni vengono digeriti enzimaticamente per liberare le singole cellule. L'ultimo passaggio consiste nel sospendere e selezionare le cellule principali, quindi seminarle in piastre di coltura. Alla fine, sei otto giorni dopo la semina, le cellule sono pronte per essere utilizzate nei saggi sperimentali.Il sistema di coltura cellulare è adatto per chiarire i meccanismi molecolari alla base del riassorbimento di acqua mediato da VP e, possibilmente, di altri processi TIC dipendenti da CAP. Inoltre, il sistema può essere utilizzato per la scoperta di nuovi candidati farmaceutici e di nuovi bersagli terapeutici per il trattamento di malattie associate a un'alterata regolazione del riassorbimento di acqua mediato da VP. La procedura sarà dimostrata da una studentessa di dottorato del nostro laboratorio e da Beata Eman e Andrea Giller, due tecnici del nostro laboratorio.Al seguito della sequenza temporale indicata, rivestire le piastre per coltura con collagene. Tipo quattro, il giorno precedente l'intervento del giorno successivo, preparare prima le soluzioni di mezzo ed enzimatica. Aggiungere i supplementi al mezzo DMEM appena preparato.Per preparare la soluzione enzimatica, aggiungere un milligrammo per millilitro di ialuronidasi e 2,2 milligrammi per millilitro di collagenasi nel DPBS filtrato. Sterilizzare la soluzione e conservarla in un tubo Falcon da 50 millilitri.Preparare un millilitro di soluzione enzimatica per ogni due mila renali interni digeriti. Il passaggio più difficile di questo protocollo è la dissezione del milia interno. Per garantire il successo, il sangue viene drenato dagli animali prima della dissezione, rendendo più facile individuare il confine lucente tra il milia interno e il modello auto dopo l'eutanasia.Rimuovere i reni e conservarli nel DPBS sterile preparato in precedenza. Operare in condizioni sterili. Trasferire i reni dalla soluzione di DPBS, integrata con Gentamicina e Nistatina, su una garza sterile per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso.Successivamente, con il bisturi sterile, rimuovere la capsula adiposa del rene mentre è ancora fissata sulla compressa. Effettuare un taglio vicino all'asse longitudinale della superficie esterna o corticale. Assicurarsi di non tagliare completamente, ma di lasciare il tessuto ancora unito in corrispondenza del bacinetto renale.Successivamente, identificare la parte esterna della midollare di colore rosa iridescente e la parte interna biancastra. Con forbici curve, dissezionare con attenzione la midollare interna dalla midollare esterna circostante. Posizionare il tessuto nella soluzione di DPBS preparata in precedenza.Dopo aver isolato e raccolto tutti i Meli su ghiaccio, ridurre il volume della soluzione di DPBS, integrata con Gentamicina e Nistatina, fino a un livello in cui siano appena coperti dal tampone. Utilizzare una lametta sterile per tagliare i Meli in cubi di circa cinque millimetri cubi. Successivamente, sciogliere e arrotondare l'estremità affilata di una pipetta pasteur sterile tenendola brevemente in una fiamma.Dopo averlo raffreddato, utilizzare questa pipetta per trasferire la sospensione tissutale in un tubo Falcon da 50 millilitri contenente la soluzione enzimatica sterile fresca, preparata in precedenza. Collocare il tubo in un bagnomaria e incubare a 37 gradi Celsius sotto agitazione continua per un'ora e mezza o due ore.Dopo questo periodo, aspirare e dispensare la miscela più volte con la pipetta fino a quando la sospensione diventa torbida in modo omogeneo. Una volta completamente omogeneizzata, centrifugare la sospensione per cinque minuti. Successivamente, eliminare il soprannatante res.Sospendere il pellet e centrifugare nuovamente. Ripetere questa fase di lavaggio un’altra volta. Risospendere le cellule in mezzo completamente integrato e seminare in piastre da coltura o piastre a pozzetti subito dopo la semina; le cellule IMCD isolate, così come gli eritrociti e i detriti cellulari, possono essere valutate al microscopio.Questo fornirà una prima indicazione del numero di cellule isolate dopo 24 ore. Lavare le cellule con DMEM a 600 milliosmoli e aggiungere mezzo fresco. Durante la settimana successiva, le cellule dovrebbero essere lavate da due a tre volte.Le cellule IMCD dovrebbero essere pronte per gli esperimenti da sei a otto giorni dopo la semina, quando sono cresciute fino a confluenza, come mostrato qui. Ricordarsi di incubare le cellule in mezzo privo di DBC MP e INE per 24 ore prima di iniziare l'esperimento. In caso contrario, l'acquaporina due sarà localizzata principalmente nella membrana plasmatica.La corretta coltivazione di cellule IMCD primarie di ratto porterà alla formazione di un monolayer confluenziale tra sei e otto giorni dal seeding, quando stimolate con arginina, vasopressina o forskolina; in tali condizioni, l'aqp2 transloca da vescicole intracellulari alla membrana plasmatica, come mostrato qui. Inoltre, l'espressione di AQP2 nelle cellule IMCD aumenta dopo un trattamento di 30 minuti con VP o forolina, come illustrato in questo western blot. Successivamente a questa procedura, isolamento di D-N-A-R-N-A, esperimenti di R-T-P-C-R e immunoprecipitazione.L'analisi del sangue mediante tecnica Western e la microscopia a immunofluorescenza possono essere eseguite per analizzare i geni e i prodotti genici delle cellule del dotto collettore inod. Questo sistema di coltura cellulare, che esprime proteine endogene, è particolarmente indicato per applicazioni in approcci di screening non pregiudiziali.

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