Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

L'obiettivo generale del seguente protocollo è consentire l'analisi su scala genomica della funzione genica monitorando contemporaneamente diverse risposte cellulari. In questa dimostrazione, vengono utilizzati reporter basati sulla luciferasi di Firefly RAN e sulla luciferasi Cipro Dina per monitorare rispettivamente l'attività della via P 53 WINT e della via KRAS. Questi tre reporter vengono cotrasfettati insieme a irna diretti verso un gene di interesse in cellule HCT one 16, una linea cellulare di cancro del colon-retto.

Successivamente, le attività della luciferasi di firefly e della luciferasi vanilla vengono misurate nei lisati cellulari, mentre l'attività della luciferasi Cipro DEA viene misurata in un enzima secreto nel mezzo di coltura. Si ottengono risultati che dimostrano la riproducibilità del sistema saggio nonché la capacità di rivelare azioni condivise e specifiche dei geni all'interno di questi tre percorsi biologici rilevanti per il cancro.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come microray o pries multicolore è che rappresenta un approccio economico, universale ed efficiente dal punto di vista dei costi per analizzare i prodotti cellulari della trascrizione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nella ricerca sul cancro, come lo sviluppo di strategie terapeutiche mirate a livello molecolare. Sebbene il nostro protocollo di trasfezione transiente richieda uno sforzo minimo di IL e un impegno iniziale ridotto per l'allestimento dello screening, è probabile che aumenti la variabilità del segnale da pozzetto a pozzetto, fenomeno che può essere compensato analizzando i rapporti tra i segnali reporter anziché osservare i valori assoluti provenienti dai pozzetti. Per iniziare questa procedura, lavare cinque piastre da 10 centimetri quadrati contenenti cellule HCT 116 al 80-90% di confluenza con PBS, quindi raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione per ogni piastra.

Utilizzare un millilitro di soluzione di tripsina, seguito da neutralizzazione con 10 millilitri di DMEM contenente FBS al 2% e penicillina all'1%. Trasferire le cellule sospese in una provetta conica da 50 millilitri e centrifugare a circa 130 ×g per cinque minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di mezzo di coltura.

Contare il numero di cellule con un contatore cellulare, quindi preparare una soluzione cellulare con 10 alla quinta cellule per millilitro. Conservare 150 millilitri di sospensione cellulare per il passaggio successivo utilizzando una piastra dispensatrice automatica a gocce multiple. Aggiungere 100 microlitri, ovvero 10 alla quarta cellule, in ciascun pozzetto di una piastra da coltura a 96 pozzetti.

In questo caso, la sospensione cellulare dovrebbe essere sufficiente per la semina in piastre a 1296 pozzetti. Incubare le piastre con le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con anidride carbonica al 5% mentre si prepara la miscela di trasfezione. Il DNA del costrutto reporter di alta qualità utilizzato in questo caso è stato isolato mediante kit MIDI standard e diluito a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.

Per ogni reporter, preparare 100 microlitri di soluzione stock del costrutto reporter combinando i seguenti componenti: 30 microlitri di P 53, 30 microlitri di FL, 30 microlitri di eight X-T-C-F-R-L, 30 microlitri di elk one G four, sei microlitri di U-A-S-C-L e quattro microlitri di H two oh. Questo produrrà una miscela di DNA con un rapporto finale di 1:1:1:0,2 dei reporter e una concentrazione finale di DNA di 0,3 milligrammi per millilitro. Successivamente, preparare miscele di trasfezione I-R-N-A-D-N-A sufficienti per trasfettare 1296.

Per ottenere una soluzione di DNA con una concentrazione finale di tre microgrammi per millilitro per piastra, diluire 80 microlitri della soluzione madre del costrutto reporter in otto millilitri di tampone EC del kit QIAGEN effecting. Aggiungere 20 microlitri della soluzione di DNA in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Il numero di piastre a 96 pozzetti dipenderà dal numero di pool di irna da testare.

Ad esempio, in questo caso, avremo bisogno di 4 piastre a 96 pozzetti per la valutazione. Utilizzando un manipolatore automatico di liquidi biome, trasferire 384 diversi pool di siRNA, due microlitri di ciascun siRNA a concentrazione di cinque micromolari, nel pozzetto corrispondente della piastra PCR contenente la soluzione di DNA diluita. Successivamente, aggiungere un microlitro di soluzione di potenziatore in ogni pozzetto della piastra DNA-siRNA.

Lasciare avvenire la reazione di potenziamento a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere tre microlitri di reagente di trasfezione a ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per ulteriori 10 minuti. Per arrestare la formazione dei complessi di trasfezione, aggiungere 10 microlitri di DMEM contenente 2%FBS e 1%penicillina-streptomicina a ogni pozzetto della piastra PCR.

Recuperare le piastre da 1296 pozzetti contenenti le cellule HCT-116 dall'incubatore. Trasferire 10 microlitri della miscela di trasfezione in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente le cellule, poiché ogni trasfezione verrà eseguita in triplice replicato. La stessa miscela verrà applicata a due ulteriori piastre da 96 pozzetti contenenti cellule.

Incubare le cellule con le miscele di trasfezione a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato con il 5% di anidride carbonica per 36 ore. 36 ore dopo la trasfezione delle cellule, le attività della luciferasi sono pronte per essere misurate.

Dato che questo studio comprende più reporter, uno secreto nel mezzo di coltura e altri due espressi nel citoplasma cellulare, le misurazioni saranno effettuate sia sul mezzo di coltura che su un lisato cellulare per rilevare l'attività della luciferasi Cipro Dina o CL nella coltura. Piastra replicata del mezzo.

20 microlitri di un mezzo di coltura in una piastra bianca opaca a 96 pozzetti. Utilizzando il Multi Drop, aggiungere 20 microlitri di tampone per saggio CL in ogni pozzetto. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di Cipro Dina Lucifer e substrato in ogni pozzetto e rilevare l'attività CL utilizzando un luminometro per rilevare le attività della luciferasi della lucerna e della luciferasi alla vaniglia; prima, è necessario preparare i lisati cellulari.

Rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule capovolgendo ogni piastra e smaltendo il mezzo nel lavandino. Rimuovere il mezzo residuo tamponando delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. Aggiungere 30 microlitri di un x tampone di lisi passiva in ogni pozzetto contenente cellule.

Posizionare le piastre su un agitatore orbitale regolato a velocità media per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, aggiungere 20 microlitri del reagente per il saggio della luciferasi in ogni pozzetto contenente cellule e misurare immediatamente l'attività della luciferasi di firefly utilizzando il luminometro. Successivamente, aggiungere il reagente stop and glow per inibire l'attività della luciferasi di firefly e quindi misurare l'attività della luciferasi.

Prima della moltiplicazione, la robustezza delle tre diverse piattaforme di screening è stata valutata singolarmente. Le linee cellulari di cancro del colon-retto indicate sono state trasfettate con le otto costruzioni reporter che codificano per la luciferasi di XTCF PP 53 ta Luke o ALK uno insieme a pool di siRNA diretti contro WINT beta-Catenina P 53 o KAS, rispettivamente. I genotipi rilevanti per il percorso di ciascuna linea cellulare sono indicati.

La robustezza di ciascuna piattaforma di screening è stata valutata in base alla riproducibilità di questi effetti indotti sulla relativa via di trasduzione del segnale. Come mostrato in questi risultati rappresentativi, la betaina e gli siRNA non hanno alcun effetto sull'attività del reporter otto XTCF nelle cellule RKO. A differenza delle cellule DLD uno e HCT uno 16, che sono rispettivamente carenti nella via A PC, nella proteina soppressore ed esprimono una forma attivata di beca tenin.

In seguito, è stato dimostrato che questi reporter possono essere utilizzati contemporaneamente per misurazioni simultanee dell'attività genica delle vie di trasduzione del segnale di wind beta-catenin, P53 e KRAS, impiegando i pool di IRNA indicati in questi grafici. Le attività relative della luciferasi sono riportate sull'asse Y, mentre gli siRNA diretti contro il gene di interesse indicato sono riportati sull'asse X. Ad esempio, un pool di siRNA diretto contro beta-catenin riduce l'attività della via di segnalazione di wind beta-catenin, senza influenzare in modo significativo le vie di P53 e KRAS.

Nel tentativo di sviluppare un sistema di reporter multiplo, è fondamentale ottimizzare la linea cellulare di interesse per la regione di trasfezione e per l'intensità del segnale del reporter.