Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

L'obiettivo generale del seguente protocollo è quello di consentire l'interrogazione su scala genomica della funzione genica monitorando simultaneamente più letture cellulari. In questa dimostrazione, i reporter basati su Firefly RAN e Cipro Dina Luciferase sono utilizzati per monitorare rispettivamente l'attività del percorso di P 53 WINT e KRAS. Questi tre reporter sono sottoposti a transsezione con irna che ha come bersaglio un gene di interesse in HCT 16 cellule, una linea cellulare di cancro del colon-retto.

Successivamente, le attività della luciferasi della lucciola e della vaniglia vengono misurate nei lisati cellulari mentre l'attività della luciferasi Cipro DEA. Nella coltura viene misurato un enzima secreto. Si ottengono risultati medi che mostrano la riproducibilità del sistema di analisi e la capacità di rivelare azioni condivise e uniche dei geni all'interno di questi tre percorsi rilevanti per il cancro.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i microraggi o i pry multicolori, è che è un modo economico, universale ed economico di osservare gli output cellulari di trascrizione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nella ricerca sul cancro, come lo sviluppo di strategie terapeutiche a bersaglio molecolare. Sebbene il nostro protocollo transfetto transitorio si sforzi IL e un impegno iniziale minimo per l'impostazione dello schermo, probabilmente aumenterà bene la variabilità del segnale, che può essere contrastata osservando i rapporti di segnalazione invece di esaminare i guasti assoluti dai pozzetti Per iniziare questa procedura, lavare cinque piastre quadrate da 10 centimetri di HCT confluente all'80-90% una 16 celle con PBS, quindi raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione per ciascuna piastra.

Utilizzare un millilitro di soluzione di tripsina seguito da neutralizzazione con 10 millilitri di DMEM contenente il 2% di FBS e l'1% di penicillina. La streptomicina trasferisce le cellule sospese in una provetta conica da 50 millilitri e centrifuga a circa 130 G per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di terreno.

Contare il numero di cellule con un contacellule e quindi preparare una soluzione cellulare con 10-5 cellule per millilitro. Conservare 150 millilitri di sospensione cellulare per la fase successiva utilizzando una piastra dosatrice di liquidi automatizzata multigoccia. 100 microlitri o 10 cellule al quarto in ogni pozzetto di una piastra di coltura a 96 pozzetti.

La sospensione della cella in questo caso dovrebbe essere sufficiente per la placcatura 1296. Le piastre a pozzetti incubano le piastre con cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore con il 5% di anidride carbonica mentre preparano la miscela di trasfezione. Il DNA del costrutto reporter di alta qualità utilizzato qui è stato isolato utilizzando kit di preparazione MIDI standard e diluito a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro.

Per ogni reporter, preparare 100 microlitri di soluzione madre di costrutto reporter combinando i seguenti 30 microlitri di P 53, FL, 30 microlitri di otto X-T-C-F-R-L, 30 microlitri di alce, un G, quattro, sei microlitri di U-A-S-C-L e quattro microlitri di H, due oh. Ciò si tradurrà in una miscela di DNA con un rapporto finale di uno a uno a 0,2 dei reporter e una concentrazione finale di DNA di 0,3 milligrammi per millilitro. Quindi, preparare miscele di trasfezione I-R-N-A-D-N-A sufficienti per la sezionazione 1296.

Le piastre a pozzetti diluiscono 80 microlitri della soluzione madre del costrutto reporter in otto millilitri di tampone EC dal kit di effetto QIAGEN per ottenere una soluzione di DNA con una concentrazione finale di tre microgrammi per millilitro di piastra. 20 microlitri di soluzione di DNA in ciascun pozzetto di una piastra PCR a 96 pozzetti. Il numero di piastre da 96 pozzetti dipenderà dal numero di piscine di irna da testare.

Ad esempio, in questo caso, avremo bisogno di 4 piastre da 96 pozzetti per valutare. 384 diversi pool di sir a utilizzando un gestore di liquidi automatizzato per bioma trasferiscono due microlitri di ogni siRNA a cinque micromolari al pozzetto corrispondente della piastra PCR contenente lo stock di DNA diluito. Quindi, aggiungere un microlitro di soluzione potenziante a ciascun pozzetto della piastra DNA siRNA.

Lasciare che la reazione dell'enhancer avvenga a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi aggiungere tre microlitri di reagente di trasfezione ad effetto in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Per fermare la formazione del complesso di trasfezione, aggiungere 10 microlitri di DMEM contenenti il 2% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina a ciascun pozzetto della piastra PCR.

Recuperare dall'incubatore le piastre da 1296 pozzetti contenenti HCT 16 cellule. Trasferire 10 microlitri della miscela di trasfezione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente le cellule, poiché ogni trasfezione verrà eseguita in triplice copia. La stessa miscela sarà applicata ad altre due piastre da 96 pozzetti contenenti cellule.

Incubare le cellule con miscele di trasfezione a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato con il 5% di anidride carbonica per 36 ore. 36 ore dopo la trasfezione delle cellule. Le attività della luciferasi sono pronte per la misurazione.

Poiché questo studio incorpora più reporter, uno secreto nel terreno di coltura e altri due espressi nel citoplasma cellulare. Le misurazioni saranno ottenute sia dal terreno di coltura che da un lisato cellulare per rilevare l'attività della luciferasi Cipro dina o CL nella coltura. Piastra replica media.

20 microlitri di terreno di coltura su una piastra bianca opaca a 96 pozzetti. Utilizzando la goccia multipla, aggiungere 20 microlitri di tampone per il saggio CL a ciascun pozzetto. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di Cipro Dina Lucifer e substrato a ciascun pozzetto e rilevare l'attività CL utilizzando un luminometro per rilevare le attività della luciferasi della lucciola e della luciferasi della vaniglia, i lisati cellulari devono prima essere prodotti.

Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule capovolgendo ciascuna piastra e gettando il terreno in un lavandino. Rimuovere il terreno rimanente picchiettando delicatamente la piastra capovolta su carta assorbente. Aggiungere 30 microlitri di un tampone di lisi passiva a ciascun pozzetto di cellule.

Posizionare le piastre su una piattaforma a bilanciere impostata a velocità media per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, aggiungere 20 microlitri del reagente del saggio della luciferasi a ciascun pozzetto di cellule e misurare immediatamente l'attività della luciferasi della lucciola utilizzando il luminometro. Quindi, aggiungere il reagente stop and glow per estinguere l'attività della luciferasi della lucciola e quindi misurare l'attività della luciferasi.

Prima del multiplexing, la robustezza delle tre diverse piattaforme di screening è stata valutata individualmente. Le linee cellulari di cancro del colon-retto indicate sono state trasfettate con gli otto costrutti reporter codificanti XTCF, PP 53 ta Luke o ALK one Firefly Luciferase insieme a pool di siRNA che hanno come bersaglio WINT beta-catenina P 53 o KAS, rispettivamente. Sono indicati i genotipi rilevanti per la via di ciascuna linea cellulare.

La forza di ciascuna piattaforma di screening è stata valutata in base alla riproducibilità di questi effetti indotti sulla relativa via di trasduzione del segnale. Come mostrato in questi risultati rappresentativi, la betaina e i siRNA non hanno alcun effetto sull'attività degli otto reporter XTCF nelle cellule RKO. A differenza delle cellule DLD 1 e HCT one 16, che sono rispettivamente carenti nella via A PC, la proteina soppressore ed esprimono una forma attivata di beca tenina.

Successivamente, è stato dimostrato che questi reporter potrebbero essere utilizzati insieme per misurazioni simultanee dell'attività genica delle vie di trasduzione del segnale del vento beta-catenina P 53 e KRAS utilizzando i pool IRNA indicati in questi grafici. Le attività relative della luciferasi sono mostrate sull'asse Y e i siRNA che hanno come bersaglio il gene di interesse indicato sono mostrati sull'asse X. Ad esempio, un pool di siRNA che ha come bersaglio la beta-catenina riduce l'attività della via della beta-catenina nel vento, senza influenzare in modo significativo le vie P 53 e KRA S.

Durante il tentativo di sviluppare un sistema reporter multiplex, è importante ottimizzare la linea cellulare di interesse per la regione di trasfezione e l'intento del segnale reporter.