Preparazione del campione istologico per microscopia ottica
L'istologia è lo studio di cellule e tessuti, che è tipicamente aiutato dall'uso di un microscopio ottico. La preparazione dei campioni istologici può…
L'istologia è un termine che si riferisce allo studio dell'anatomia microscopica di tessuti e cellule. Una corretta preparazione istologica del campione per la microscopia ottica è essenziale per ottenere risultati di qualità da campioni di tessuto.
Ci sono 3 passaggi principali comuni a quasi tutte le procedure istologiche. In primo luogo, il campione viene fissato, al fine di preservare il tessuto e rallentare la degradazione dei tessuti. Successivamente, il campione viene immerso in un materiale, o supporto di incorporamento, che ha proprietà meccaniche simili a se stesso. Una volta incorporato, il campione viene sezionato, o tagliato, in fette sottili utilizzando un preciso strumento di taglio noto come microtomo. Questo video descrive questi passaggi generali e alcuni dei concetti ad essi correlati.
La fissazione dei tessuti è un passaggio critico che preserva i componenti cellulari e tissutali e mantiene la loro struttura. Dopo la morte cellulare, gli enzimi presenti in natura vengono rilasciati dagli organelli cellulari e iniziano a degradare le proteine in tutta la cellula e la matrice extracellulare, distruggendo così la struttura della cellula. La fissazione impedisce tale degradazione inibendo direttamente la capacità di questi enzimi digerire le proteine e rendendo irriconoscibili i siti di scissione enzimatica.
I due principali meccanismi di fissazione sono il cross-linking e la coagulazione. Il cross-linking comporta la formazione di legami covalenti sia all'interno delle proteine che tra di esse, che provoca l'irrigidimento dei tessuti e quindi la resistenza alla degradazione. La coagulazione è causata dalla disidratazione delle proteine attraverso l'uso di alcoli o acetone, che deformano la struttura terziaria delle proteine, in modo che le regioni idrofobiche, o che temono l'acqua, spostino la superficie proteica. La fissazione coagulativa può aiutare a incorporare mezzi, come la cera di paraffina, penetrare nel tessuto.
Uno dei fissativi più comunemente usati è la formalina, che è formaldeide disciolta in acqua. Durante la fissazione, la formaldeide si attacca alle ammine primarie, come quelle che si trovano sulle catene laterali degli amminoacidi lisina e glutammina per formare una reticolazione stabile chiamata ponte di methelene. Questo processo è intrinsecamente lento e può richiedere fino a 1-2 giorni.
Prima della fissazione dovrebbero essere fatte alcune considerazioni. Innanzitutto, considera la diffusività del campione. I fissativi diffonderanno una distanza attraverso i tessuti ad una velocità correlata al coefficiente di diffusione per il fissativo moltiplicato per la radice quadrata del tempo. Un fissativo che impiega 1 ora per penetrare 1 mm nel campione impiegherà 25 ore per penetrare 5 mm. Una volta che la formalina ha raggiunto il centro del tessuto, deve verificarsi il davanzale di reazione reticolante. Pertanto, la dimensione del campione dovrebbe essere limitata a 4 mm di spessore per una fissazione completa in un ragionevole lasso di tempo.
In secondo luogo, considerare il volume e il pH del fissativo. Il rapporto fissativo/volume del campione deve essere almeno 40:1 in modo che il reagente non si esaurisca facilmente nel tempo. Mentre alcuni fissativi sono progettati per funzionare a un pH acido, la formalina funziona meglio se tamponata con fosfato per mantenere un pH neutro, in modo che non venga prodotto acido in eccesso, causando artefatti nei tessuti.
Il prossimo passo nella preparazione istologica è l'incorporamento, che comporta il supporto di campioni in mezzi che hanno una rigidità meccanica simile al campione stesso. La scelta del giusto supporto di incorporamento è fondamentale, perché se è troppo rigido o troppo debole, possono verificarsi difetti durante il sezionamento. Di gran lunga, il mezzo più comune utilizzato per l'incorporamento è la cera di paraffina.
Prima dell'incorporazione della paraffina, i campioni devono essere disidratati sostituendo l'acqua nel tessuto con etanolo, prima, seguita da xileni e infine cera di paraffina riscaldata. Una volta che la cera si è infiltrata nel campione, viene accuratamente posizionata e circondata con cera aggiuntiva usando uno stampo per formare un blocco. Successivamente, i campioni vengono attaccati a una cassetta di tessuto per il sezionamento.
Il sezionamento è il processo di taglio di fette sottili di un campione da un blocco di incorporamento. Le sezioni sono solitamente dell'ordine di 4-10 μm di spessore per l'uso con microscopia ottica.
Per tagliare le sezioni, una lama di metallo, vetro o diamante viene prima fissata su un microtomo. Il campione viene quindi inserito in un porta campioni. Successivamente, il campione viene avanzato sulla superficie di taglio e disegnato attraverso la lama per creare una fetta di spessore desiderato. Le sezioni si accumuleranno come nastri sottili che possono essere posizionati su vetrini.
Dopo il sezionamento, i campioni vengono posizionati su diapositive. Per i campioni incorporati di paraffina, le fette vengono prima poste in un bagno d'acqua riscaldata e poi sollevate dall'acqua sullo scivolo e lasciate asciugare.
Il tessuto biologico ha pochissimo contrasto intrinseco, quindi dopo l'istologia, i vetrini sono solitamente macchiati con coloranti o anticorpi che evidenziano la morfologia o proteine specifiche. La macchia più comune eseguita è ematossilina ed eosina, o H & E. Poiché è così comune, molte macchine automatizzate sono state realizzate per macchiare in modo riproducibile numerose sezioni con H & E. L'ematossilina colora i nuclei delle cellule blu e l'eosina colora il citoplasma rosa rivelando la morfologia cellulare dei tessuti.
Uno svantaggio della fissazione è che il cross-linking delle proteine può rendere più per l'etichettatura degli anticorpi per trovare i loro siti di legame. Piuttosto che usare la fissazione per preservare i campioni, è possibile utilizzare il congelamento rapido dei tessuti o il congelamento a scatto, seguito da una tecnica di sezionamento chiamata criosezione
I campioni di tessuto sono incorporati e orientati in uno speciale mezzo di congelamento chiamato OCT, o mezzo di temperatura di taglio ottimale e quindi rapidamente congelati. Come altri supporti di incorporamento, lo Strumento di personalizzazione di Office corrisponde alla rigidità del campione.
Un criomicrotomo o criostato, viene utilizzato per tagliare sezioni congelate e questo strumento mantiene una temperatura interna di -20 ° C per mantenere la lama di taglio e i campioni freschi. A differenza delle sezioni incorporate in paraffina, le sezioni congelate possono essere sollevate direttamente su una slitta di vetro caricata positivamente immediatamente dopo la sezionamento.
Un altro modo per evitare la fissazione è tramite l'incorporamento dell'agar, in cui i campioni sono coperti con agarosio liquido appena preparato. Quando l'agarose si raffredda, blocca il tessuto in posizione e l'agarose in eccesso può essere tagliato via.
I vibrotomi, un'altra alternativa al microtomo, hanno una lama che vibra e si muove attraverso il campione incorporato nell'agarose. I vibrotomi vengono utilizzati per creare sezioni spesse dell'ordine di 50-1000 μm da campioni incorporati di agarose.
I campioni vengono in genere rimossi dall'agarose prima della colorazione e quindi posizionati su un vetrino circondato da una sostanza come il grasso sottovuoto che impedisce al coverslip di schiacciare il campione. Sono meglio visualizzati utilizzando la microscopia confocale per ottenere immagini ad alta risoluzione di ogni sezione spessa.
Hai appena visto il video di JoVE sulla preparazione del campione istologico per la microscopia ottica.
Ora dovresti capire i passaggi necessari per la preparazione del campione per portare da un pezzo di tessuto a una sezione macchiabile. Come sempre, grazie per aver guardato!
L'istologia è un termine che si riferisce allo studio dell'anatomia microscopica di tessuti e cellule. Una corretta preparazione istologica del campione per la microscopia ottica è essenziale per ottenere risultati di qualità da campioni di tessuto.
Ci sono 3 passaggi principali comuni a quasi tutte le procedure istologiche. In primo luogo, il campione viene fissato, al fine di preservare il tessuto e rallentare la degradazione dei tessuti. Successivamente, il campione viene immerso in un materiale, o supporto di incorporamento, che ha proprietà meccaniche simili a se stesso. Una volta incorporato, il campione viene sezionato, o tagliato, in fette sottili utilizzando un preciso strumento di taglio noto come microtomo. Questo video descrive questi passaggi generali e alcuni dei concetti ad essi correlati.
La fissazione dei tessuti è un passaggio critico che preserva i componenti cellulari e tissutali e mantiene la loro struttura. Dopo la morte cellulare, gli enzimi presenti in natura vengono rilasciati dagli organelli cellulari e iniziano a degradare le proteine in tutta la cellula e la matrice extracellulare, distruggendo così la struttura della cellula. La fissazione impedisce tale degradazione inibendo direttamente la capacità di questi enzimi digerire le proteine e rendendo irriconoscibili i siti di scissione enzimatica.
I due principali meccanismi di fissazione sono il cross-linking e la coagulazione. Il cross-linking comporta la formazione di legami covalenti sia all'interno delle proteine che tra di esse, che provoca l'irrigidimento dei tessuti e quindi la resistenza alla degradazione. La coagulazione è causata dalla disidratazione delle proteine attraverso l'uso di alcoli o acetone, che deformano la struttura terziaria delle proteine, in modo che le regioni idrofobiche, o che temono l'acqua, spostino la superficie proteica. La fissazione coagulativa può aiutare a incorporare mezzi, come la cera di paraffina, penetrare nel tessuto.
Uno dei fissativi più comunemente usati è la formalina, che è formaldeide disciolta in acqua. Durante la fissazione, la formaldeide si attacca alle ammine primarie, come quelle che si trovano sulle catene laterali degli amminoacidi lisina e glutammina per formare una reticolazione stabile chiamata ponte di methelene. Questo processo è intrinsecamente lento e può richiedere fino a 1-2 giorni.
Prima della fissazione dovrebbero essere fatte alcune considerazioni. Innanzitutto, considera la diffusività del campione. I fissativi diffonderanno una distanza attraverso i tessuti ad una velocità correlata al coefficiente di diffusione per il fissativo moltiplicato per la radice quadrata del tempo. Un fissativo che impiega 1 ora per penetrare 1 mm nel campione impiegherà 25 ore per penetrare 5 mm. Una volta che la formalina ha raggiunto il centro del tessuto, deve verificarsi il davanzale di reazione reticolante. Pertanto, la dimensione del campione dovrebbe essere limitata a 4 mm di spessore per una fissazione completa in un ragionevole lasso di tempo.
In secondo luogo, considerare il volume e il pH del fissativo. Il rapporto fissativo/volume del campione deve essere almeno 40:1 in modo che il reagente non si esaurisca facilmente nel tempo. Mentre alcuni fissativi sono progettati per funzionare a un pH acido, la formalina funziona meglio se tamponata con fosfato per mantenere un pH neutro, in modo che non venga prodotto acido in eccesso, causando artefatti nei tessuti.
Il prossimo passo nella preparazione istologica è l'incorporamento, che comporta il supporto di campioni in mezzi che hanno una rigidità meccanica simile al campione stesso. La scelta del giusto supporto di incorporamento è fondamentale, perché se è troppo rigido o troppo debole, possono verificarsi difetti durante il sezionamento. Di gran lunga, il mezzo più comune utilizzato per l'incorporamento è la cera di paraffina.
Prima dell'incorporazione della paraffina, i campioni devono essere disidratati sostituendo l'acqua nel tessuto con etanolo, prima, seguita da xileni e infine cera di paraffina riscaldata. Una volta che la cera si è infiltrata nel campione, viene accuratamente posizionata e circondata con cera aggiuntiva usando uno stampo per formare un blocco. Successivamente, i campioni vengono attaccati a una cassetta di tessuto per il sezionamento.
Il sezionamento è il processo di taglio di fette sottili di un campione da un blocco di incorporamento. Le sezioni sono solitamente dell'ordine di 4-10 μm di spessore per l'uso con microscopia ottica.
Per tagliare le sezioni, una lama di metallo, vetro o diamante viene prima fissata su un microtomo. Il campione viene quindi inserito in un porta campioni. Successivamente, il campione viene avanzato sulla superficie di taglio e disegnato attraverso la lama per creare una fetta di spessore desiderato. Le sezioni si accumuleranno come nastri sottili che possono essere posizionati su vetrini.
Dopo il sezionamento, i campioni vengono posizionati su diapositive. Per i campioni incorporati di paraffina, le fette vengono prima poste in un bagno d'acqua riscaldata e poi sollevate dall'acqua sullo scivolo e lasciate asciugare.
Il tessuto biologico ha pochissimo contrasto intrinseco, quindi dopo l'istologia, i vetrini sono solitamente macchiati con coloranti o anticorpi che evidenziano la morfologia o proteine specifiche. La macchia più comune eseguita è ematossilina ed eosina, o H & E. Poiché è così comune, molte macchine automatizzate sono state realizzate per macchiare in modo riproducibile numerose sezioni con H & E. L'ematossilina colora i nuclei delle cellule blu e l'eosina colora il citoplasma rosa rivelando la morfologia cellulare dei tessuti.
Uno svantaggio della fissazione è che il cross-linking delle proteine può rendere più per l'etichettatura degli anticorpi per trovare i loro siti di legame. Piuttosto che usare la fissazione per preservare i campioni, è possibile utilizzare il congelamento rapido dei tessuti o il congelamento a scatto, seguito da una tecnica di sezionamento chiamata criosezione
I campioni di tessuto sono incorporati e orientati in uno speciale mezzo di congelamento chiamato OCT, o mezzo di temperatura di taglio ottimale e quindi rapidamente congelati. Come altri supporti di incorporamento, lo Strumento di personalizzazione di Office corrisponde alla rigidità del campione.
Un criomicrotomo o criostato, viene utilizzato per tagliare sezioni congelate e questo strumento mantiene una temperatura interna di -20 ° C per mantenere la lama di taglio e i campioni freschi. A differenza delle sezioni incorporate in paraffina, le sezioni congelate possono essere sollevate direttamente su una slitta di vetro caricata positivamente immediatamente dopo la sezionamento.
Un altro modo per evitare la fissazione è tramite l'incorporamento dell'agar, in cui i campioni sono coperti con agarosio liquido appena preparato. Quando l'agarose si raffredda, blocca il tessuto in posizione e l'agarose in eccesso può essere tagliato via.
I vibrotomi, un'altra alternativa al microtomo, hanno una lama che vibra e si muove attraverso il campione incorporato nell'agarose. I vibrotomi vengono utilizzati per creare sezioni spesse dell'ordine di 50-1000 μm da campioni incorporati di agarose.
I campioni vengono in genere rimossi dall'agarose prima della colorazione e quindi posizionati su un vetrino circondato da una sostanza come il grasso sottovuoto che impedisce al coverslip di schiacciare il campione. Sono meglio visualizzati utilizzando la microscopia confocale per ottenere immagini ad alta risoluzione di ogni sezione spessa.
Hai appena visto il video di JoVE sulla preparazione del campione istologico per la microscopia ottica.
Ora dovresti capire i passaggi necessari per la preparazione del campione per portare da un pezzo di tessuto a una sezione macchiabile. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.