Name: Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Impara l'analisi dell'imaging ottico multimodale per la distribuzione di nanoparticelle HerDox in tumori HER2+. Questo metodo permette di valutare il targeting e la penetrazione tumorale in vivo.

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Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni a LKM-K dal National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 e R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe ringrazia C. Rey, M. M-Kauwe e D. Revetto per il supporto continuo.

1. Consegna sistemica in vivo <ol><li> Mescolare abbastanza Herdox con soluzione salina sterile per equiparare 0,2 ml di una dose mg / kg 0,004 di Herdox per iniezione per 6-8 settimane vecchio mouse cuscinetti sottocutanei tumori xenotrapianto fianco bilaterali nu / nu. </li><li> Disegnare delicatamente il composto Herdox in una siringa da insulina 3/10 cc con ago 29G, evitando le bolle. </li><li> Anestesia è indotta da una breve esposizione isoflurano in una camera di induzione dotato di un sistema di evacuazione fumi gas (portate ossigeno: 0.5-1 L / min, concentrazione isoflurano: 3-4% (o inferiore). </li><li> Iniettare l&#39;intero contenuto nella vena della coda di un topo anestetizzato (0,2 ml per iniezione). IV iniezione può essere eseguita in un ambiente sobrio, topo non anestetizzati. </li><li> Ripetere iniezioni sullo stesso topo per sei giorni più sequenziali, una volta al giorno. </li></ol> 2. Fluorescence Imaging in vivo L&#39;accumulo di Herdox fluorescenza nei tumori puòessere rivelabile con l&#39;ultimo giorno di iniezione (giorno 7) con un imager multimodale. Le procedure sotto comportano l&#39;impiego di un macro-sistema di illuminazione e rilevazione personalizzata (Figura 1) 8. <ol><li> Accendere il Multimode In Imager ottico in vivo. </li><li> Selezionare un filtro passa-banda di emissione (590 nm ± 30 nm) adatto per doxorubicina rivelazione a fluorescenza. </li><li> Accendere Argon-Krypton laser e inserire un filtro passa-banda di eccitazione (488 nm ± 10 nm) nel percorso ottico laser. </li><li> Accendere il sistema di anestesia e quindi posizionare il mouse nella camera di anestetizzante (tassi di flusso di ossigeno: 0,5-1 L / min, concentrazione isoflurano: 3-4% (o inferiore) dotati di un sistema di evacuazione dei gas. </li><li> Passa il mouse dalla camera anestetizzante per la camera di imaging del Multimode In Imager ottica vivo quando il mouse è anestetizzato. </li><li> Posizionare un musetto sopra il naso del mouse e aprire il flusso di somministrare anestesia continuaSia durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine (tassi di flusso di ossigeno: 0,5-1 L / min, la concentrazione di isoflurano: 2-3% (o inferiore). </li><li> Acquisire immagini di fluorescenza utilizzando un tempo di esposizione di 5-15 sec. </li><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini e di elaborazione tra cui la correzione del fondo o di regolazione del contrasto. </li></ol> 3. Fluorescence Imaging ex vivo Herdox fluorescenza può essere ripreso in tumori e organi specifici (tra cui il fegato, reni, milza, cuore e muscolo scheletrico) raccolte da topi sacrificati a 24 ore dopo il (Giorno 7) ultima iniezione di Herdox. <ol><li> Accendere il Multimode In Imager ottico in vivo. </li><li> Selezionare un filtro passa-banda di emissione (580 nm ± 20 nm) per il rilevamento di fluorescenza doxorubicina. </li><li> Accendere Argon-Krypton laser e inserire un filtro passa-banda di eccitazione (488 nm ± 10 nm) nel percorso ottico laser. </li><li> Luogo tumori e organi specifici disposti su un piatto di Petri nella camera di imaging of il Multimode In Imager ottico in vivo. </li><li> Acquisire immagini di fluorescenza dei tessuti utilizzando un tempo di esposizione di 5-15 sec. Un esempio di acquisizione iniziale immagine di fluorescenza è mostrato in Figura 2a. Ripetere la stessa utilizzando un vuoto Petri-piatto, che fungerà da sfondo (Figura 2b). </li><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini e di elaborazione tra cui la correzione del fondo o di regolazione del contrasto. Un esempio di una immagine corretta viene mostrata in Figura 2c, risultante dalla sottrazione della Figura 2b dalla Figura 2a. </li></ol> 4. In situ Imaging confocale dei Tumori In situ confocale permette rilevazione e l&#39;analisi di accumulazione tumore Herdox a livello cellulare. <ol><li> Accendere una Leica SPE microscopio confocale. </li><li> Selezionare 488 nm luce laser per l&#39;eccitazione della doxorubicina e di emissione lunghezze d&#39;onda (560-620 nm) per la doxorubicinarivelazione della fluorescenza. </li><li> Selezionare un obiettivo 40X o 63X e olio di immersione goccia sulla lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Estrarre i tumori freschi da topi eutanasia che in precedenza ricevuto trattamenti Herdox e finto come descritto nella procedura 2. </li><li> Luogo tumori su una piastra di Petri in ghiaccio per evitare il degrado del tessuto, e poi trasferire i tumori in una camera T Delta per l&#39;imaging confocale. </li><li> Acquisire le immagini confocale dei tumori a profondità focali sequenziali (dimensione del passo: 1 micron, spessore: 20 micron). Un esempio di immagini in sequenza-acquisite lungo l&#39;asse z è mostrato in Figura 3, pannello sinistro. </li><li> Eseguire intensità massima z-proiezione delle immagini. Una proiezione massima intensità di z-stack immagini è mostrato in Figura 3, pannello di destra. </li><li> Calcola significare intensità di fluorescenza della massima intensità Z -. Immagini di proiezione media intensità di fluorescenza delle immagini sopra il campo di vista generale sono stati calcolared usando ImageJ. </li></ol> 5. Ratiometrica Spectral Imaging e analisi Spectral Imaging ratiometrica e analisi consente la discriminazione tra Dox fluorescenza e autofluorescenza. <ol><li> Accendere una scansione laser a fluorescenza microscopio confocale. </li><li> Acquisire 15 immagini dei tumori Herdox-trattati e non a una profondità specificata nel range spettrale di 510-650 nm, con un passo di 10 nm, e eccitazione a 488 nm luce utilizzando un microscopio confocale Leica SPE. </li><li> Preparare una soluzione 100 mM di doxorubicina. </li><li> Eseguire l&#39;imaging spettrale della soluzione di doxorubicina 100 micron per ottenere la firma spettrale pura di Dox fluorescenza (campo spettrale: 510-650 nm, una dimensione del passo: 10 nm). Risultati tipici di acquisizione immagine da immagini spettrali e conseguente spettro di fluorescenza tracciati come un grafico sono mostrati in Figura 4. </li><li> Acquisire la firma spettrale autofluorescenza da un&#39;immagine cUbe (campo spettrale: 510-650 nm, una dimensione del passo: 10 nm) ottenuta da imaging spettrale di tumori non trattati. Risultati tipici di acquisizione immagine da immagini spettrali e conseguente spettro di fluorescenza tracciati come un grafico sono mostrati in Figura 5. </li><li> Genera quattro firme spettrali di riferimento (autofluorescenza puro, 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescenza, 0.2. Doxorubicina +0,8. Autofluorescenza, 0.3.doxorubin +0,7. Autofluorescenza) utilizzando il programma che abbiamo sviluppato 9. Una tipica curva che mostra quattro firme spettrali di riferimento è mostrato in Figura 6. </li><li> Eseguire la classificazione spettrale delle immagini come definito dalle firme spettrali di riferimento attraverso la misura di distanza euclidea che utilizzano il programma che precedentemente sviluppato 9. </li><li> Eseguire unmixing spettrale lineare di quelle immagini utilizzando un programma spettrale unmixing (plug-in in ImageJ) abbiamo sviluppato 7, 10, per il confronto con la rappresentazione spettrale raziometrico e analisi. Un indirizzo example di separare fluorescenza Herdox da autofluorescenza da unmixing spettrale lineare è mostrato in Figura 7. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
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</ol>

L&#39;autore, Daniel Farkas, è Presidente di Spectral Imaging Molecolare. Gli autori restanti avere interessi in gioco.

Dox fluorescenza può essere rilevabile in vivo utilizzando la termocamera multimode quando i tumori sono sottocutaneo. Tuttavia, la dose terapeuticamente efficace di Herdox (0,004 mg / kg) è al di sotto della soglia di rilevamento dopo una singola dose. Al contrario, dopo 7 iniezioni giornaliere (1x/day per 7 giorni), l&#39;accumulo tumore e ritenzione della particella è sufficiente per consentire la visualizzazione di Dox fluorescenza. È critico quando si lavora con Dox o qualsiasi...

Tumore-targeting della chemioterapia ha il potenziale per eliminare le cellule tumorali a dosi inferiori rispetto ai farmaci mirati perché più della terapia erogata può accumulare la destinazione prevista in luogo della distribuzione di tessuto non tumorale. Come quest&#39;ultima situazione sarebbe diluire la efficacia del farmaco e quindi richiedono dosi più elevate per essere efficace, tumore-targeting ha sia vantaggi terapeutici e di sicurezza oltre il trattamento non mirati standard. Targeting chemioterapia di incapsulamento in nanoparticelle auto-assemblati permette al farmaco di rimanere chimicamente non modificato in contrasto con i farmaci che sono covalentemente legati a molecole di targeting. Come tale collegamento ha il potenziale per alterare l&#39;attività sia del farmaco e la molecola di guida; assemblaggio non covalente permette potenza del farmaco da conservare. Abbiamo precedentemente dimostrato che il romanzo a tre componenti, complesso auto-assemblati, Herdox, rivolge HER2 + tumori <em&gt; In vivo e suscita l&#39;ablazione del tumore-crescita, risparmiando il tessuto normale, compreso il cuore 1. Herdox è formato attraverso interazioni non covalenti tra la proteina recettoriale cellula-penetrazione, HerPBK10, e l&#39;agente chemioterapico, doxorubicina (Dox), tramite una piccola linker acido nucleico. HerPBK10 lega il recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER) e attiva endocitosi mediata da recettore 2-4, mentre endosomal penetrazione membrana viene realizzato attraverso incorporazione della adenovirus-derivato penton base di capside proteico 4-6. Un dominio carica positivamente sulla proteina permette acido nucleico legante 4, 5, attraverso il quale può essere trasportato Dox DNA-intercalato per la somministrazione mirata. Elettrofila, intercalazione, e possibilmente interazioni oligomerizzazione di proteine ​​facilitano l&#39;auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm che sono stabili nel sangue e sotto lo stoccaggio prolungato a temperature diverse 1. Preferenziale mira a LEI2 + cellule tumorali è facilitata dalla maggiore affinità ligando quando HER2 è elevata. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la consegna sistematica delle rese Herdox accumulo preferenziale nei tumori oltre tessuto non tumorale e in confronto a untargeted Dox 1, e la penetrazione nelle cellule tumorali in vivo 7. Abbiamo osservato che Herdox rilasci Dox dopo l&#39;entrata delle cellule tumorali, permettendo l&#39;accumulo di Dox nel nucleo 1. Tumore-accumulo sembra essere correlata con il livello recettoriale, come tumori esprimenti HER2-relativamente bassi accumulano meno Herdox rispetto a quelli con livelli relativamente più elevati HER2 1. Inoltre, la concentrazione effettiva morte cellulare presenta una correlazione inversa con HER2 visualizzazione su linee cellulari tumorali esprimenti differenti livelli di HER2 superficie cellulare 1. Herdox mostra un vantaggio terapeutico e di sicurezza oltre Dox non mirati, come l&#39;uccisione del tumore si verifica in più di dosi 10 volte inferiore rispetto a decomprimeregramme incentrato farmaco e non produce effetti avversi riscontrabili su cuore (rilevata mediante ecocardiografia e istologici macchia) o il fegato (riconosciuto mediante TUNEL macchia) dei tessuti, in contrasto untargeted Dox 1. Nonostante la sua derivazione da una proteina del capside virale, HerPBK10 presenta nessun immunogenicità rilevabile a livelli terapeutici 2. Mentre gli anticorpi preesistenti a tutto adenovirus possono riconoscere HerPBK10, non sono in grado di prevenire vincolante 2 cellule. Volume del tumore misurata nel tempo è un metodo standard di valutazione dell&#39;efficacia terapeutica delle terapie mirate, ed è stato impiegato per valutare l&#39;efficacia terapeutica di Herdox. Integrando questo approccio con in vivo e ex vivo imaging di fluorescenza intensità ci ha permesso di valutare meglio gli obiettivi di efficienza 7. Abbiamo specificatamente integrato in situ confocale di tumori asportati con analisi spettrale di Dox fluorescenza per verificare che non Herdoxt accumulato solo a tumori in vivo, ma penetrato nelle cellule tumorali e Dox consegnato nel citoplasma e nel nucleo 7. Analisi spettrale inoltre ci ha permesso di distinguere Dox fluorescenza da autofluorescenza 7. Qui mostriamo più in dettaglio il nostro approccio per la valutazione Herdox in vivo dopo la consegna sistemica, e, soprattutto, per valutare il targeting attraverso metodi di imaging multimodali e di analisi.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocale a scansione laser a fluorescenza</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><<tr><td>em>In Vivo Optical Imager</td><td>Spectral Molecular Imaging Multimode</td><td>In Vivo Optical Imager</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich</td><td></td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>Topo nudo (NU/NU), femmina, 6-8 settimane</td><td>Charles River</td><td>Codice ceppo 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 cellule tumorali umane HER2+</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina da 3/10 cc U-100 con ago da 29G x 1/2" Ultra-FineIV fissato in modo permanente</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T chamber </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi delle targeted proteina virale nanoparticelle distribuito her2 + tumori

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

La nanoparticella HER2 + tumore-mirato, Herdox, espone accumulo tumore preferenziale e ablazione del tumore-crescita in un modello animale di cancro HER2 +. Herdox è formato da non covalente auto-assemblaggio di un tumore mirato proteina penetrazione cella con l&#39;agente chemioterapico, doxorubicina, tramite una piccola linker acido nucleico. Una combinazione di elettrofilo, intercalazione, e le interazioni oligomerizzazione facilitare l&#39;auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm. Herdox esibisce la stabilità nel sangue e nella conservazione prolungata a temperature diverse. Consegna sistemica di Herdox in topi portatori di tumore provoca la morte delle cellule tumorali, senza effetti negativi rilevabili a tessuto non tumorale, tra il cuore e il fegato (che subiscono danni segnata da doxorubicina non mirati). HER2 elevazione facilita il targeting di cellule che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico umano, quindi tumori che presentavano livelli elevati di HER2 mostrano maggiore accumulo di Herdox rispetto alle cellule exprescantare livelli inferiori, sia in vitro che in vivo. L&#39;imaging di fluorescenza combinata con l&#39;analisi confocale e spettrale situ ha permesso di verificare in vivo del tumore targeting e la penetrazione delle cellule tumorali di Herdox dopo la consegna sistemica. Qui dettaglio i nostri metodi per la valutazione targeting tumorale tramite l&#39;imaging multimodale dopo la consegna sistemica.

La figura 1 mostra il vivo ottico prototipo imager, che è stato costruito a scopo di acquisizione di immagini in modalità multiple, tra intensità di fluorescenza, spettrale, durata, 2-fotone, confocale intra-vitale, e di imaging bioluminescenza in. Inoltre, la telecamera sensibile elevata raffreddata e linee laser ad alta potenza incorporato in questo sistema rese superiori contrasto immagini di fluorescenza rispetto ai sistemi di imaging ottico commerciali 11, in particolar...

Questo articolo descrive le procedure per l&#39;analisi di immagini ottiche delle nanoparticelle tumore-mirato, Herdox. In particolare, l&#39;uso dettagliato del dispositivo di imaging multimodale per la rilevazione del tumore orientare e valutare la penetrazione del tumore è descritta qui.

Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è rilevare e analizzare la somministrazione sistemica in vivo del nanoparticella bersaglio-tumorale HeroX mediante imaging ottico multimodale. In primo luogo, la nanoparticella viene iniettata nella vena della coda di un topo portatore di tumore e vengono acquisite immagini di fluorescenza utilizzando un sistema di imaging ottico multimodale. Dopo l'eutanasia, il tumore e gli organi vengono prelevati ed esaminati nuovamente per rilevare le particelle fluorescenti all'interno delle cellule tumorali.Viene quindi eseguita l'immagine confocale in situ. L'analisi delle immagini ottenute dimostra un indirizzamento e una penetrazione quantificabili dei suoi doc nei tumori dopo somministrazione sistemica. Un aspetto vantaggioso delle tecniche di imaging multimodale rispetto alle tecniche esistenti, come la modalità di imaging singola, è la capacità di fornire informazioni multiple e complementari che possono migliorare l'analisi e la quantificazione del rilascio nel tumore.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della somministrazione di farmaci, ad esempio se un farmaco mirato venga non solo consegnato ai tumori, ma penetri effettivamente nelle cellule tumorali. A illustrare la procedura sarà la dottoressa Yun Wang, già ricercatrice post-dottorato nel mio laboratorio, e Janet Markman, attuale studentessa laureanda in questo protocollo. Soggetti di età compresa tra le sei e le otto settimane.Si utilizzano nuovi topi portatori di tumori xeno-graftati sottocutanei bilaterali nei fianchi. Preparare la somministrazione sistemica mescolando una quantità sufficiente di HeroX con soluzione salina sterile in modo da ottenere 0,2 millilitri di una dose di HeroX pari a 0,004 milligrammi per chilogrammo per iniezione. Aspirare delicatamente 0,2 millilitri della miscela di HeroX in una siringa per insulina da tre decimi di cc dotata di un ago da 29 gauge.Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria dopo l'anestesia. Iniettare l'intera miscela nella vena della coda subito dopo l'iniezione. Premere la coda per prevenire la fuoriuscita di sangue dal sito di iniezione.Dopo l'arresto dell'emorragia, pulire il sito di iniezione con un bastoncino sterile e riportare il topo nella gabbia. Ripetere l'iniezione sullo stesso topo per altri sei giorni consecutivi. Una volta al giorno, l'accumulo di fluorescenza di HeroX nei tumori può essere rilevato l'ultimo giorno di iniezione.Giorno sette, utilizzando un multimodal imager. Le procedure descritte qui impiegano un sistema di imaging ottico con capacità di intensità di fluorescenza, fluorescenza spettrale, tempo di vita e imaging confocale intravitale. Qui è mostrato il prototipo di imager ottico in vivo.La telecamera ad alta sensibilità raffreddata e le linee laser ad alta potenza incorporate in questo sistema producono immagini fluorescenti con un contrasto superiore rispetto ai sistemi ottici di imaging commerciali, specialmente per il rilevamento in vivo della fluorescenza della doxorubicina. Accendere l'imager ottico multimodale in vivo nel software. Selezionare un filtro passa-banda di emissione adatto al rilevamento della fluorescenza della doxorubicina.Accendere il laser e posizionare un filtro passa-banda di eccitazione nel percorso ottico del laser. Dopo aver anestetizzato un topo nella camera di anestesia con isoflurano, trasferirlo nella camera di imaging del multimodal imager ottico in vivo. Posizionare un cono nasale sul naso del topo e aprire il flusso per somministrare anestesia continua.Durante l'acquisizione delle immagini, acquisire le immagini di fluorescenza utilizzando un tempo di esposizione compreso tra cinque e 15 secondi. La fluorescenza del composto può essere rilevata in tumori e organi specifici, tra cui fegato, rene, milza, cuore e muscolo scheletrico, prelevati da topi sacrificati 24 ore dopo l’ultimo giorno di iniezione. Accendere l'imager ottico in vivo multifunzione.Come in precedenza, posizionare quindi i tumori e gli organi specifici disposti su una piastra di Petri. All'interno della camera di imaging del multimodal imager ottico in vivo, acquisire immagini di fluorescenza dei tessuti utilizzando un tempo di esposizione compreso tra cinque e 15 secondi. Ripetere quindi le stesse acquisizioni utilizzando una piastra di Petri vuota, che fungerà da fondo successivamente all'acquisizione.Eseguire l'analisi e l'elaborazione delle immagini, inclusa la correzione del fondo o l'aggiustamento del contrasto. L'immagine confocale in situ consente la rilevazione e l'analisi dell'accumulo tumorale del gruppo a livello cellulare. Utilizzando un microscopio confocale.Selezionare la luce laser a 488 nanometri per l'eccitazione della doxorubicina e lunghezze d'onda di emissione comprese tra 560 e 620 nanometri. Per la rilevazione della fluorescenza della doxorubicina, selezionare un obiettivo 40 x o 63 x e posizionare una goccia di olio di immersione su di esso. Posizionare i tumori prelevati dal topo sacrificato su una piastra di Petri per evitare il degrado del tessuto.Trasferire quindi i tumori in una camera delta T per l'acquisizione confocale. Acquisire immagini confocali dei tumori a profondità focali sequenziali con un incremento di un micron e uno spessore di 20 micron. Di seguito è mostrato un esempio di immagini acquisite sequenzialmente lungo l'asse Z.Generare proiezioni Z di intensità massima delle immagini. Successivamente, utilizzando ImageJ o un programma simile, calcolare le intensità medie di fluorescenza delle immagini di proiezione Z ad intensità massima per il rapporto dell'intero campo visivo. L'imaging spettrale e l'analisi metrica permettono di discriminare tra doxorubicina, fluorescenza e autofluorescenza.Utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con fluorescenza, acquisire 15 immagini dei tumori trattati e non trattati con HeroX a una profondità specifica nell'intervallo spettrale compreso tra 510 e 650 nanometri, con incrementi di 10 nanometri e con eccitazione a luce di 488 nanometri, usando un microscopio confocale Leica SPE. Successivamente, preparare una soluzione di doxorubicina a 100 micromolare in soluzione salina. Eseguire l'imaging spettrale della soluzione di doxorubicina a 100 micromolare.Per ottenere la firma spettrale pura della fluorescenza della doxorubicina. Acquisire la firma spettrale dell'autofluorescenza dal cubo di immagini mediante l'acquisizione di tumori non trattati. Una volta raccolti tutti i dati, generare firme spettrali di riferimento, eseguire la classificazione spettrale delle immagini ed effettuare l'unmixing spettrale lineare di tali immagini per ottenere una valutazione quantitativa dell'accumulo della doc in tumori.Le immagini fluorescenti confocali sono state ottenute a diverse profondità focali in situ, seguite da una proiezione Z dell'intensità massima delle immagini e dall'acquisizione dell'intensità media della fluorescenza nell'immagine proiettata. L'elevata fluorescenza tumorale mostrata in questa immagine è tipica dopo la somministrazione sistemica di her docs ed è indicativa di un indirizzamento preferenziale al tumore. La fluorescenza rilevata nel muscolo scheletrico è atipica e potrebbe derivare da anomalie nella procedura di iniezione.Qualitativamente, questa immagine presenta un basso segnale di fondo. Per l'analisi quantitativa, viene effettuata una correzione del fondo utilizzando una capsula vuota, come mostrato qui. L'immagine corretta risultante presenta un segnale di fondo più elevato ai bordi rispetto all'originale, poiché l'immagine di fondo ha intensità più basse ai bordi dell'immagine.Le immagini sovrapposte mostrate a sinistra sono rappresentative delle scansioni confocali del tessuto tumorale ottenute a profondità sequenziali di un micron. L'immagine a destra mostra la composizione delle immagini sovrapposte a sinistra. L'immagine composita contiene le informazioni sull'accumulo di HeroX nelle profondità Z indicate per ogni pixel, e pertanto la media delle intensità di fluorescenza riflette quantitativamente l'accumulo complessivo di herd doc nei tumori a diverse profondità.Per distinguere la fluorescenza del farmaco dall'autofluorescenza nei tumori e discriminare quantitativamente i due segnali con metriche di rapporto di specificità elevate, si esegue l'analisi spettrale mediante imaging. Questa immagine mostra le firme spettrali pure della doxorubicina.L'intensità della fluorescenza dell'area delimitata tratteggiata alle lunghezze d'onda di emissione indicate produce un istogramma che mostra il profilo della doxorubicina nello spettro di lunghezza d'onda compreso tra 510 e 650 nanometri. Qui vengono mostrate le firme spettrali pure per l'autofluorescenza. La fluorescenza emessa da un tumore non trattato alle lunghezze d'onda di emissione indicate produce una pendenza che rappresenta il profilo di emissione dell'autofluorescenza. Riferimento.Le firme spettrali sono state inoltre create mescolando diversi rapporti delle firme spettrali pure. Utilizzando il programma, abbiamo sviluppato ciascun riferimento. La firma spettrale rappresenta qui la fluorescenza relativa delle sue docks accumulate nei tumori rispetto all'autofluorescenza.Dopo aver ottenuto le firme spettrali dei marcatori e della autofluorescenza, i segnali dei marcatori vengono separati mediante l'analisi spettrale lineare. L'immagine mostra l'immagine mista di autofluorescenza e marcatori prima dell'analisi spettrale e l'immagine dei marcatori separati dopo l'analisi spettrale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come combinare l'intensità della fluorescenza, il comfort del veicolo e le modalità di imaging spettrale per migliorare l'analisi e la quantificazione del rilascio tumorale.Non dimenticare che lavorare con la doxorubicina può essere pericoloso e che durante questa procedura è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di doppi guanti e la frequente sostituzione dei guanti.

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