Introduzione alla microscopia a fluorescenza

La fluorescenza è un fenomeno che si verifica quando una sostanza assorbe la luce a una data lunghezza d’onda ed emette luce ad un’altra lunghezza d’onda. La fluorescenza si verifica come un elettrone, che è stato eccitato in uno stato energetico più alto e più instabile, si rilassa al suo stato suolo ed emette un fotone di luce. La luce responsabile dell’eccitazione, o lo spostamento dell’elettrone in uno stato di energia più elevato, è di lunghezza d’onda più corta e di energia superiore rispetto all’emissione di fluorescenza, che ha una lunghezza d’onda più lunga, un’energia inferiore e un colore diverso.

La microscopia a fluorescenza combina le proprietà di ingrandimento del microscopio ottico con la tecnologia di fluorescenza che consente l’eccitazione e la rilevazione delle emissioni da fluorofori a composti chimici fluorescenti. Con la microscopia a fluorescenza, gli scienziati possono osservare la posizione di specifici tipi di cellule all’interno di tessuti o molecole all’interno delle cellule.

I componenti principali del microscopio fluorescente si sovrappongono notevolmente al microscopio ottico tradizionale. Tuttavia le 2 principali differenze sono il tipo di sorgente luminosa e l’utilizzo degli elementi filtranti specializzati.

La microscopia a fluorescenza richiede una sorgente luminosa molto potente come una lampada ad arco allo xeno o al mercurio come quella mostrata qui. La luce emessa dalla lampada ad arco di mercurio è 10-100 volte più luminosa della maggior parte delle lampade ad incandescenza e fornisce luce in una vasta gamma di lunghezze d’onda, dall’ultravioletto all’infrarosso. Questa fonte di luce ad alta potenza è la parte più pericolosa della configurazione del microscopio a fluorescenza in quanto guardare direttamente nella luce non filtrata può danneggiare seriamente le retine e la cattiva gestione delle lampadine può farle esplodere.

Il principio alla base della microscopia a fluorescenza è semplice. Quando la luce lascia la lampada ad arco, viene diretta attraverso un filtro eccitante, che seleziona la lunghezza d’onda di eccitazione.

Questa luce viene riflessa verso il campione da uno specchio speciale chiamato specchio dicroico, progettato per riflettere la luce solo alla lunghezza d’onda di eccitazione. La luce riflessa passa attraverso l’obiettivo dove viene focalizzata sul campione fluorescente. Le emissioni del campione sono a loro volta, passate indietro attraverso l’obiettivo – dove avviene l’ingrandimento dell’immagine – e ora attraverso lo specchio dicroico.

Questa luce viene filtrata dal filtro barriera, che seleziona per la lunghezza d’onda di emissione e filtra la luce contaminante dalla lampada ad arco o da altre fonti che vengono riflesse dai componenti del microscopio. Infine, l’emissione fluorescente filtrata viene inviata a un rilevatore dove l’immagine può essere digitalizzata o trasmessa all’oculare per la visualizzazione ottica.

Il filtro eccitante, lo specchio dicroico e il filtro barriera possono essere assemblati insieme in un componente noto come cubo del filtro. Diversi cubi di filtro possono essere modificati durante la visualizzazione del campione per cambiare la lunghezza d’onda di eccitazione e una serie di diaframmi può essere utilizzata per modificare l’intensità dell’eccitazione.

Quando si tratta di eseguire la microscopia a fluorescenza, il fluoroforo può essere importante quanto il microscopio stesso e il tipo di fluoroforo che viene ripreso determina la lunghezza d’onda di eccitazione utilizzata e la lunghezza d’onda di emissione rilevata. Le lunghezze d’onda di eccitazione contengono una piccola gamma di energie che possono essere assorbite dal fluoroforo e causarne la transizione in uno stato eccitato. Una volta eccitato, è possibile una vasta gamma di emissioni, o transizioni di nuovo allo stato di energia inferiore, con conseguente spettro di emissione.

La differenza tra il picco della curva di assorbimento o di eccitazione e il picco della curva di emissione è nota come Spostamento di Stoke. Maggiore è la distanza in questo spostamento, più facile è separare le due diverse lunghezze d’onda. Inoltre, qualsiasi spettro sovrapposto deve essere rimosso dai componenti del cubo del filtro per ridurre lo sfondo e migliorare la qualità dell’immagine.

L’esposizione del fluoroforo all’eccitazione prolungata lo causerà a fotosbianche, che è un indebolimento o una perdita di fluorescenza. Per ridurre il fotosableching, è possibile aggiungere un mezzo di montaggio anti-dissolvenza alla diapositiva e sigillare i bordi con lo smalto per unghie. La diapositiva deve anche essere mantenuta al buio quando non viene considerata.

Per iniziare l’imaging a fluorescenza, accendere la sorgente luminosa allo xeno o al mercurio e lasciarla riscaldare fino a 15 minuti in modo che raggiunga un’illuminazione costante.

Quindi, posiziona il campione sul palco e fissalo in posizione. Quindi, accendere la sorgente di luce bianca del microscopio. Concentrati sul tuo campione utilizzando l’obiettivo con la potenza più bassa regolando le manopole di messa a fuoco grossolane e fini. Quindi, utilizzare le manopole di regolazione del palco per trovare l’area di interesse.

Quindi, spegnere la fonte di luce bianca e le luci della stanza non necessarie per ridurre lo sfondo.

Selezionare il cubo filtrante corretto per il colorante che si sta immaginando e aprire l’otturatore per illuminare il campione.

Infine, effettuare regolazioni precise della messa a fuoco e dirigere la luce di uscita verso la termocamera. Probabilmente sarà necessario apportare modifiche al tempo di esposizione per ogni diverso fluoroforo o colorante fluorescente utilizzato. Tuttavia, è importante mantenere costante il tempo di esposizione quando si confrontano le caratteristiche con lo stesso colorante su campioni diversi.

Per creare l’immagine di più coloranti sullo stesso campione, modificare il cubo del filtro in modo che corrisponda a ciascun fluoroforo e registrare la nuova immagine.

Dopo che ogni colorante nel campione è stato ripreso, le singole immagini possono essere sovrapposte e unite.

Molti tipi diversi di esperimenti possono fare uso della microscopia fluorescente e coinvolgono diversi tipi di fluorofori Una delle applicazioni più comuni della microscopia fluorescente è l’imaging di proteine che sono state etichettate con anticorpi che sono attaccati o “coniugati” a composti fluorescenti. Qui, un anticorpo verso le proteine di superficie leptospirali è stato rilevato utilizzando un anticorpo secondario coniugato ad alexafluor-488, che fluoresce verde quando eccitato.

Un altro modo per evidenziare una caratteristica specifica con la fluorescenza è quello di integrare il codice per una proteina fluorescente come la proteina fluorescente verde, o GFP, nel DNA di un organismo. Il gene per la GFP è stato originariamente isolato dalle meduse e può essere espresso, o prodotto, da cellule in coltura in risposta a trigger specifici o come parte di un tipo di cellula specifico come le cellule tumorali mostrate incandescenti in questa immagine

Un’altra applicazione dell’imaging a fluorescenza è la microscopia a fluorescenza speckle che è una tecnologia che utilizza assemblaggi macromolecolari etichettati fluorescentmente come la rete F-actina vista qui, per studiare la cinetica del movimento e del turnover di questa importante proteina citoscheletrico.

Una tecnica avanzata nota come recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento, o FRAP, viene eseguita intenzionalmente fotosbiancando una piccola regione di un campione al fine di monitorare la velocità di diffusione delle molecole etichettate fluorescentmente nella regione fotosbiancata.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla microscopia a fluorescenza.

In questo video abbiamo imparato a conoscere il concetto di fluorescenza, come la microscopia a fluorescenza differisce dalla microscopia ottica e come prendere un’immagine di fluorescenza attraverso l’ambito. Abbiamo anche imparato a conoscere alcune applicazioni di base e avanzate che utilizzano la fluorescenza. Grazie per aver guardato e non dimenticare che mentre il fotosbiancamento sembra fantastico sui tuoi denti non è così buono per i tuoi campioni.