Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare gli effetti delle variazioni nel rapporto e nella tempistica relativa degli input sinaptici eccitatori e inibitori sull'attività di spiking dei neuroni, utilizzando come modelli i neuroni gangliari retinici. Questo obiettivo viene raggiunto mediante il posizionamento di un'ampolla di vetro riempita con una soluzione intracellulare che riproduce la composizione ionica fisiologica e con yellow Lucifer sul corpo cellulare di una cellula gangliare all'interno di una retina montata in toto. Come secondo passaggio, si utilizza la tecnica del dynamic clamp per iniettare nel corpo cellulare forme d'onda di conduttanza eccitatorie e inibitorie, che generano una variazione del potenziale di membrana come risposta. Successivamente, diverse forme d'onda di conduttanza ottenute da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo o in presenza di farmaci vengono iniettate nel corpo cellulare al fine di ottenere le corrispondenti risposte neuronali.

I risultati mostrano gli effetti delle variazioni nel rapporto tra eccitazione e inibizione sull'attività di spiking delle cellule gangliari retiniche, basati sull'iniezione di correnti composte da conduttanze eccitatorie e inibitorie tramite registrazioni con clamp dinamico. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il clamp di corrente o il clamp di tensione è che essa fornisce uno strumento interattivo mediante il quale il rapporto e il tempo relativo tra conduttanze sinaptiche eccitatorie e inibitorie possono essere iniettati nei neuroni per indagare l'influenza sulle risposte cellulari. Questa metodologia può fornire informazioni sul funzionamento dei circuiti retinici così come di qualsiasi altra rete neuronale nel sistema nervoso centrale.

Iniziare questa procedura configurando il sistema di ripresa con 250 millilitri del mezzo AIMSS ossigenato e carbonatato nell'allestimento elettrofisiologico. Successivamente, stendere uno strato sottile di grasso da vuoto in modo uniforme sulla parte inferiore della camera di perfusione. Sigillarla con un coprioggetto e assicurarsi che sia ermetica.

Quindi applicare una piccola quantità di grasso sulle estremità superiore e inferiore della camera. Il grasso manterrà la griglia in posizione e impedirà che prema troppo sulla retina. Ora fissare la camera sulla piattaforma e allineare entrambe le aperture successivamente.

Sacrificare un animale mediante dislocazione cervicale dopo averlo anestetizzato con isoflurano. Rimuovere rapidamente gli occhi con un paio di forbici curve piccole. Lavare accuratamente gli occhi con fluido extracellulare ossigenato al car in un piccolo becher e posizionarli in una piastra di Petri riempita con fluido extracellulare ossigenato al car.

Sotto il microscopio stereoscopico, praticare un foro di inserzione utilizzando un ago da 19 gauge nella cornea, a circa due millimetri dal bordo, in entrambi gli occhi. Questo passaggio importante deve essere eseguito rapidamente per consentire l'ossigenazione di entrambi i rein a. Successivamente, rimuovere una cornea con un piccolo paio di forbici per iride tagliando parallelamente al suo bordo.

Successivamente, rimuovere l'iride e il cristallino con un paio di pinzette fini e ripetere le procedure per l'altro occhio. Trasferire una coppa oculare in un becher contenente soluzione extracellulare ossigenata e arricchita di anidride carbonica. Con la lama del bisturi, tagliare delicatamente la coppa oculare a metà e separare la retina dall'epitelio pigmentato utilizzando una sonda da dissezione smussata o staccandola delicatamente.

Quindi tenere il bordo del tessuto retinico staccato vicino all'aura Serta con una pinzetta fine e afferrare l'aura serta con un'altra pinzetta fine. Tirarla verso il centro della retina. Questo è un processo delicato e potrebbe richiedere alcuni tentativi.

Se l'aurora riesce, il corpo ciliare e l'umor vitreo verranno rimossi e la curvatura della retina sarà ridotta. Successivamente, tagliare i bordi e quindi trasferire la retina nella camera di perfusione con le cellule gangliari rivolte verso l'alto. Trattenere il tessuto al suo posto posizionando la griglia sulle palline di grasso.

Conservare il tessuto rimanente con l'altro cupola oculare nella soluzione extracellulare ossigenata con anidride carbonica per un successivo utilizzo; posizionare la camera di registrazione sotto un microscopio eretto. Regolare immediatamente la perfusione continua della retina con soluzione extracellulare ossigenata con anidride carbonica a un flusso di tre-cinque millilitri al minuto a 35,5 gradi Celsius, assicurandosi che l'elettrodo di messa a terra sia correttamente posizionato. Accendere ora la sorgente luminosa del microscopio e mettere a fuoco i corpi cellulari delle cellule gangliari attraverso l'obiettivo 40x.

Individuare il centro del supporto del foro per la registrazione. In questo passaggio, fissare una pipetta di vetro con una resistenza di cinque-otto megaohm nel suo supporto e spostarla sotto il microscopio utilizzando un micromanipolatore con un obiettivo da 40x. Abbassare lentamente la pipetta fino a quando non forma una piccola depressione sulla superficie della membrana limitante interna.

Avanzare con attenzione la pipetta in avanti finché non raccoglie una piccola quantità di tessuto, quindi spostarla verso l'alto e/o lateralmente per strappare un piccolo foro ed esporre i corpi cellulari dei neuroni gangliari. A questo punto, riempire una pipetta pulita con otto-dieci microlitri di una soluzione intracellulare a base di potassio contenente Lucifer yellow. Inserirla nel supporto collegato allo stadio di testa dell'amplificatore, assicurandosi che l'elettrodo di argento clorurato sia immerso.

Selezionare una cellula con un corpo cellulare di grandi dimensioni. Abbassare lentamente la punta della pipetta applicando una pressione positiva per creare una piccola depressione sulla superficie della membrana. Quindi fermarsi e rilasciare la pressione per ottenere un sigillo giga.

Una volta ottenuta una giga resistenza, applicare delicatamente una pressione negativa per rompere la membrana e ottenere una configurazione del clampaggio del patch intero sulla cellula. Questa procedura rappresenta una fase delicata. Se viene applicata una pressione negativa eccessiva, il collegamento diventa permeabile.

Se la quantità è troppo scarsa, la membrana rimane integra. Nel tempo, Lucifer yellow riempirà la cellula, permettendo la visualizzazione della sua morfologia se stabile. Questa configurazione dovrebbe durare almeno 30 minuti.

Eseguire ora un test di tensione-corrente da meno 75 millivolt a più 35 millivolt ogni 10 millivolt utilizzando Patch Master ed eseguire successivamente ulteriori test, ma solo se è presente una corrente sodica superiore a un nanoampere. Successivamente, aprire LabVIEW ed eseguire il programma personalizzato Neuro Acuma.

Impostare il numero di ripetizioni a otto. Quindi impostare i potenziali di inversione delle conduttanze eccitatorie e inibitorie rispettivamente a zero e a meno 75 millivolt. Selezionare una coppia corrispondente di conduttanze eccitatorie e inibitorie per il test e nel pannello inferiore appariranno il tracciato verde della conduttanza eccitatoria e il tracciato rosso della conduttanza inibitoria.

Successivamente, tornare al patch master e selezionare la modalità di clamp di corrente. Passare immediatamente l'amplificatore alla modalità di clamp di corrente in neuro acuma. Premere il pulsante di registrazione.

La risposta cellulare con scarica afasica di potenziali d'azione apparirà nel pannello superiore. Successivamente, iniettare corrente nella cellula con bassa conduttanza. Se inizialmente si osserva una risposta minima o nulla, aumentare la corrente a piccoli incrementi finché non si ottiene una risposta intensa.

L'iniezione di una corrente eccessiva può uccidere la cellula. Al termine dei test, selezionare una nuova coppia di forme d'onda di conduttanza e ripetere le procedure per tutte le coppie di conduttanze fisiologiche e artificiali.

Dopo la registrazione, ritirare con attenzione la pipetta in modo che il corpo cellulare rimanga integro. Successivamente, fissare immediatamente il tessuto con paraformaldeide al 4% per 30 minuti, seguito da tre lavaggi di 10 minuti ciascuno con tampone fosfato 0,1 M, quindi refrigerare ed eseguire la colorazione immunoistochimica il giorno seguente o entro una settimana, quando si è pronti. Eseguire la colorazione contro le cellule gangliari riempite con Lucifer yellow a temperatura ambiente utilizzando un anticorpo primario anti-Lucifer yellow di origine coniglio IgG a un diluizione di uno a 10.000 per cinque giorni.

Quindi, al sesto giorno, lasciare in incubazione overnight con l'anticorpo secondario caprino anti-coniglio IgG, aggiungere una diluizione di uno a 500. Alla fine, montare in umido la retina in un mezzo conservante per fluorescenza. Posizionare il coprioggetto e sigillare con vernice per unghie. Acquisire immagini confocali della morfologia cellulare utilizzando un microscopio confocale Leica SPECT due.

Di seguito sono riportate le risposte di una cellula gangliare all'iniezione di conduttanze eccitatorie e inibitorie. Le forme d'onda ottenute dagli esperimenti di controllo sono indicate rispettivamente in verde e rosso. Ecco invece le risposte all'iniezione di forme d'onda di conduttanza registrate dopo l'applicazione in bagno di tetrodotossina. Di seguito sono mostrate le risposte di un'altra cellula gangliare a diverse coppie di forme d'onda di conduttanza.

I rapporti tra la conduttanza eccitatoria e la conduttanza inibitoria sono stati modificati da uno a zero fino a uno a due. All'aumentare del grado di inibizione, la risposta della cellula è diminuita; qui vengono mostrate le risposte di una cellula gangliare allo stesso livello di eccitazione, in cui l'insorgenza dell'inibizione è stata variata. Delta T rappresenta la differenza temporale tra l'insorgenza delle conduttanze inibitoria ed eccitatoria.

Quando il ritardo dell'inibizione si riduceva, la risposta della cellula diventava più debole. Questa procedura è una tecnica potente che aiuta a rivelare le interazioni tra l'input sinaptico eccitatorio e quello inibitorio alla base dell'output neuronale.