Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare gli effetti dei cambiamenti nel rapporto e nella tempistica relativa degli input sinaptici eccitatori e inibitori sull'attività di picco dei neuroni utilizzando cellule gangliari retiniche come neuroni modello. Ciò si ottiene applicando un patch al corpo cellulare di una cellula gangliare in un'intera retina montata, utilizzando una pipetta di vetro riempita con una soluzione intracellulare che assomiglia alla composizione ionica fisiologica e al giallo di Lucifero per identificare morfologicamente il tipo di cellula come secondo passaggio utilizzando il morsetto dinamico, una serie di forme d'onda di conduttanza eccitatoria e inibitoria vengono iniettate nel corpo cellulare, che producono un cambiamento nel potenziale di membrana come risposta. Successivamente, varie forme d'onda di conduttanza ottenute da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo, o in presenza di farmaci, vengono iniettate nel corpo cellulare al fine di ottenere le corrispondenti risposte neuronali.

I risultati mostrano gli effetti delle variazioni del rapporto tra eccitazione e inibizione sull'attività di spiking delle cellule gangliari retiniche basate sull'iniezione di correnti composte da conduttanze eccitatorie e inibitorie tramite registrazioni dinamiche clamp. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il current clamp o il voltage clamp, è che fornisce uno strumento interattivo attraverso il quale il rapporto e la tempistica relativa delle conduttanze sinaptiche eccitatorie e inibitorie possono essere iniettati nei neuroni per studiare l'influenza sulle risposte cellulari. Questa metodologia può fornire informazioni sulla funzione dei circuiti retinici e di qualsiasi altra rete neuronale nel sistema nervoso centrale.

Iniziare questa procedura impostando il sistema di riperfusione con 250 millilitri di mezzo di mira ossigenato carbossidico nella configurazione elettrofisiologica. Quindi, spalmare uniformemente un sottile strato di grasso sottovuoto sul fondo della camera di perfusione. Sigillalo con un vetrino coprioggetti e assicurati che sia ermetico.

Quindi posizionare una piccola quantità di grasso sulle estremità superiore e inferiore della camera. Il grasso manterrà la griglia in posizione e impedirà che prema troppo forte sulla retina. Ora fissa la camera sulla piattaforma e allinea entrambe le aperture dopo.

Sacrificare un animale per lussazione cervicale dopo essere stato anestetizzato con isof fluoro. Rimuovi rapidamente i suoi occhi con un paio di piccole forbici ricurve. Lavarli accuratamente con liquido extracellulare ossigenato per auto in un piccolo becher e metterli in una capsula di Petri riempita con liquido extracellulare ossigenato.

Sotto il microscopio da dissezione, praticare un foro di inserimento utilizzando un ago calibro 19 nella cornea a circa due millimetri dal bordo di entrambi gli occhi. Questo importante passaggio dovrebbe essere rapido per consentire l'ossigenazione di entrambe le redini. Dopodiché, rimuovi una cornea con un piccolo paio di forbici dell'iride tagliando parallelamente al suo bordo.

Quindi, rimuovere l'iride e il cristallino con un paio di pinze sottili e ripetere le procedure per l'altro occhio. Trasferire una conchiglia oculare in un becher contenente la soluzione extracellulare ossigenata carbox. Con la lama del bisturi, tagliare a metà una conchiglia oculare separare delicatamente la retina dall'epitelio pigmentato utilizzando una sonda da dissezione smussata o estraendola delicatamente.

Quindi tieni il bordo del tessuto retinico distaccato vicino all'aura Serta con un paio di pinze sottili e afferra l'aura serta con un altro paio di pinze sottili. Tiralo verso il centro della retina. Questo è un processo delicato e può richiedere alcuni tentativi.

In caso di successo, l'aura Serta, il corpo ciliare e l'umor vitreo verranno rimossi e la curvatura della retina sarà ridotta. Quindi, taglia i bordi e poi trasferisci la retina nella camera di perfusione con le cellule gangliari rivolte verso l'alto. Tenere il fazzoletto in posizione posizionando la griglia sulle palline di grasso.

Conservare il tessuto rimanente con l'altra conchiglia oculare nella soluzione extracellulare ossigenata carbox per un uso successivo, montare la camera di registrazione al microscopio verticale. Regolare immediatamente la perfusione continua della retina con la soluzione extracellulare ossigenata carbox A una velocità compresa tra tre e cinque millilitri al minuto a 35,5 gradi Celsius, assicurarsi che l'elettrodo di messa a terra sia in posizione. Ora accendi la fonte di luce del microscopio e porta la sua messa a fuoco sui corpi cellulari delle cellule gangliari attraverso il 40 x dell'obiettivo.

Individuare il centro del supporto del foro per la registrazione. In questa fase, fissare una pipetta di vetro da cinque a otto mega ohm nel suo supporto e spostarla al microscopio utilizzando un manipolatore microm sotto un obiettivo 40x. Abbassare lentamente la pipetta fino a formare una piccola fossetta sulla superficie della membrana limitante interna.

Far avanzare con cautela la pipetta in avanti fino a quando non cattura una piccola quantità di tessuto, quindi spostarla verso l'alto e/o lateralmente per praticare un piccolo foro per esporre i corpi cellulari delle cellule ganglionari. Ora riempi una pipetta pulita con 8-10 microlitri, una soluzione intracellulare a base di potassio con giallo Lucifero. Inserirlo nel supporto, fissato allo stadio principale dell'amplificatore, e assicurarsi che l'elettrodo di cloruro d'argento clorurato sia sommerso.

Selezionare una cella con un corpo cellulare grande. Abbassare lentamente il puntale della pipetta con una pressione positiva per fare una piccola fossetta sulla superficie della membrana. Quindi fermarsi e rilasciare la pressione per ottenere una tenuta giga.

Una volta ottenuta una tenuta giga, applicare delicatamente una pressione negativa per rompere la membrana al fine di ottenere una configurazione del morsetto patch dell'intera cella. Questa procedura è un passaggio delicato. Se viene applicata troppa pressione negativa, il collegamento perde.

Se troppo poco, la membrana rimane intatta. Nel tempo, il giallo di Lucifero riempirà la cellula, consentendo la visualizzazione della morfologia della cellula se stabile. Questa configurazione dovrebbe durare 30 minuti o più.

Ora esegui un test di tensione di corrente da meno 75 millivolt a 35 millivolt positivi ogni 10 millivolt utilizzando il patch master e procedi con i test successivi. Solo se è presente una corrente di sodio superiore a un nano ampere. Quindi, apri la vista laboratorio ed esegui il programma di neuro acuma scritto personalizzato.

Imposta il numero di ripetizione su otto. Quindi impostare i potenziali di inversione delle conduttanze eccitatorie e inibitorie rispettivamente a zero e meno 75 millivolt. Seleziona una coppia corrispondente di conduttanze eccitatorie e inibitorie per il test e la traccia di conduttanza eccitatoria verde e la traccia di conduttanza inibitoria rossa appariranno nel pannello inferiore.

Successivamente, torna al patch master e seleziona la modalità current clamp. Commutare immediatamente l'amplificatore in modalità pinza amperometrica in neuro acuma. Premere il pulsante di registrazione.

La risposta cellulare con esplosione afasica di potenziali d'azione apparirà sul pannello superiore. Quindi iniettare corrente nella cella con bassa conduttanza. Innanzitutto, se si osserva una risposta scarsa o nulla, aumentare la corrente in piccoli incrementi fino a quando non produce una risposta forte.

Un'iniezione di corrente eccessiva può uccidere la cella. Una volta completati i test. Selezionare una nuova coppia di forme d'onda di conduttanza e ripetere le procedure per tutte le coppie di conduttanze fisiologiche e artificiali.

Dopo la registrazione, ritrarre con cura la pipetta in modo che il corpo cellulare rimanga intatto. Successivamente, fissare immediatamente il tessuto e il 4% di para formaldeide per 30 minuti, seguiti da tre lavaggi di 10 minuti con tampone fosfato molare 0,1, conservare in frigorifero ed eseguire la colorazione degli anticorpi il giorno successivo o entro una settimana quando è pronto. Colorare contro le cellule gangliari riempite di giallo Lucifero a temperatura ambiente con un primario di coniglio giallo anti Lucifero IgG a una diluizione da uno a 10.000 per cinque giorni.

Quindi il sesto giorno, pernottando con la capra secondaria anti coniglio IgG, aggiungere una diluizione di uno a 500 Alla fine montare a umido la retina in un mezzo di conservazione fluorescente. Posizionare il vetrino coprioggetto e sigillare con lo smalto per unghie. Scatta immagini confocali della morfologia cellulare utilizzando un microscopio confocale Leica SPECT two.

Ecco le risposte di una cellula gangliare all'iniezione di conduttanza eccitatoria e inibitoria Forme d'onda ottenute dagli esperimenti di controllo indicati rispettivamente in verde e rosso. Ed ecco le risposte all'iniezione di forme d'onda di conduttanza registrate dopo l'applicazione del bagno di tetrodatossina. Ecco le risposte di un'altra cellula gangliare a varie coppie di bracci di forme d'onda di conduttanza.

I rapporti tra la conduttanza eccitatoria e la conduttanza inibitoria sono stati modificati da uno a zero a uno a due. All'aumentare del grado di inibizione, la risposta della cellula diminuiva, ed ecco le risposte di una cellula gangliare allo stesso livello di eccitazione in cui variava l'inizio dell'inibizione. Delta T rappresenta la differenza di tempo tra l'insorgenza delle conduttanze inibitorie ed eccitatorie.

Man mano che il ritardo di inibizione si riduceva, la risposta della cellula diventava più debole. Questa procedura è una tecnica potente che aiuta a rivelare le interazioni tra l'ecci tre e l'input inibitorio della sinape che genera l'output neuronale.