Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare sottogruppi di cellule B precursori dal sangue del cordone ombelicale. Ciò si ottiene isolando prima le cellule mononucleate dal sangue del cordone ombelicale mediante centrifugazione a gradiente di densità. Nella seconda fase, gli antigeni della superficie cellulare vengono marcati con anticorpi coniugati con biotina per esaurire magneticamente le cellule non B rimanenti.

Successivamente, le cellule B isolate vengono marcate in fluorescenza con anticorpi contro gli antigeni di superficie cellulare CD 19, CD 34 e CD 45. Nella fase finale, le cellule vengono ordinate mediante citometria a flusso per recuperare i sottogruppi di cellule B precursori. In definitiva, è possibile acquisire cellule in numero e qualità sufficienti per l'utilizzo in saggi a valle che richiedono DNA e RNA di alta qualità.

Un vantaggio della strategia di smistamento cellulare rispetto ai metodi alternativi è che la nostra strategia richiede meno tempo sul citometro a flusso e solo tre anticorpi fluorescenti riducono notevolmente il costo dell'esperimento. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la varietà di metodi disponibili per preparare le cellule del sangue del cordone ombelicale per la citometria a flusso e la complessità della preparazione del citometro a flusso. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle cellule B precursori sane, può essere applicato anche ad altri tipi di cellule presenti nel sangue del cordone ombelicale come le cellule T o agli studi su malattie che coinvolgono cellule ematopoietiche come la leucemia o il linfoma.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché è difficile descrivere le tecniche corrette necessarie per elaborare il sangue e le cellule del cordone ombelicale in modo da massimizzare la vitalità cellulare e ridurre la presenza di detriti contaminanti. Per isolare le cellule mononucleate dal sangue del cordone ombelicale, diluire prima otto millilitri di aliquote di sangue del cordone ombelicale con 24 millilitri di DPBS. Quindi sovrapporre lentamente ogni miscela di sangue diluito sopra 15 millilitri di watt ALI di fipa plus in provette coniche da 50 millilitri, facendo attenzione a mantenere gli strati separati.

Quindi, centrifugare il sangue per 40 minuti a 400 volte G e 20 gradi Celsius mentre le cellule vengono separate da un'etichetta a gradiente di densità, sette provette a fondo rotondo da cinque millilitri con l'ID del campione, la data e qualsiasi altra informazione appropriata come indicato nella tabella. Dopo la separazione, le cellule mononucleate rimarranno nell'interfaccia plasma fi opaque plus, mentre i granulociti e gli eritrociti sedimenteranno ora aspirando gli strati plasmatici superiori, evitando il contatto con gli strati cellulari mononucleati. Quindi utilizzare una pipetta di vetro da 10 millilitri per raccogliere con cura gli strati di cellule mononucleate da tre delle provette da 50 millilitri in un'unica nuova provetta da 50 millilitri.

Riempi questa nuova provetta con PBS, mescola delicatamente la sospensione cellulare e poi lava le cellule due volte per 10 minuti a 300 volte G e 20 gradi Celsius. Dopo il primo lavaggio, risospendere il pellet e trasferirlo in un unico tubo conico da 50 millilitri. Dopo il secondo lavaggio, sospendere delicatamente il pellet cellulare in 200 microlitri di PBS, trasferire un microlitro della sospensione cellulare in un millilitro di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per il conteggio.

Quindi lavare le celle nel tubo da 50 millilitri con altro PBS, rimuovendo completamente il surnatante senza disturbare il pellet. Per isolare le cellule B dalle cellule mononucleate, prima Resus sospende il pellet appena lavato in 160 microlitri di quattro gradi Celsius. Tampone DGA E-D-T-A-P-B-S appena preparato.

Quindi mescolare 40 microlitri del kit di isolamento delle cellule B, il cocktail di anticorpi bio ITIN con la sospensione cellulare. Dopo aver incubato le cellule per 10 minuti a quattro gradi Celsius, lavare via l'anticorpo libero in un millilitro di quattro gradi Celsius, tampone E-D-T-A-P-B-S per 10 milioni di cellule. Quindi risospendere il pellet cellulare in 320 microlitri di tampone a quattro gradi Celsius E-D-T-A-P-B-S.

Ora mescola 80 microlitri di microsfere anti biotina con la sospensione cellulare dopo un'incubazione di 15 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare nuovamente le celle mentre le celle girano. Posizionare una colonna LS nel campo magnetico di un separatore max e far gocciolare tre millilitri di tampone di quattro gradi Celsius E-D-T-A-P-B-S attraverso la colonna.

Quindi risospendere fino a 100 milioni di cellule lavate in 500 microlitri di quattro gradi Celsius, tampone E-D-T-A-P-B-S. Quindi pipettare la sospensione cellulare sulla colonna raccogliendo le cellule non marcate che passano attraverso la colonna in una provetta conica da 50 millilitri. Aggiungere altri due millilitri di tampone E-D-T-A-P-B-S alle pareti del tubo conico originale, un millilitro alla volta, quindi mescolare delicatamente e pipettare ogni volta la sospensione cellulare residua sulla colonna per essere certi di recuperare tutte le cellule.

Infine riempire la provetta conica contenente le cellule non marcate con PBS. Dopo la centrifugazione, le cellule rimuovono con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi sospendere delicatamente le cellule in 200 microlitri di tampone E-D-T-A-P-B-S.

Inizia la marcatura degli anticorpi. Passare trasferendo prima un microlitro della sospensione cellulare nella provetta non colorata precedentemente etichettata. Aggiungere 500 microlitri di tampone E-D-T-A-P-B-S al tubo e conservarlo in ghiaccio.

Spegni tutte le luci e poi aggiungi 20 microlitri ciascuno di anticorpi CD 19, CD 34 e CD 45 per 1 milione di cellule nella sospensione cellulare rimanente. Mescolate bene e mettete il tubo al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire 40 microlitri della sospensione cellulare marcata con anticorpi nelle sette provette marcate A e D.

Lavare le celle in un millilitro di PBS e poi risospendere il pallet in 100 microlitri di tampone legante. Aggiungere sette microlitri di sette A a d a queste cellule e poi incubarle al buio per 10 minuti a temperatura ambiente mentre le cellule vengono marcate con sette A a d completare il tubo delle cellule marcate con anticorpi con PBS, lavare le cellule marcate con anticorpi e quindi risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone E-D-T-A-P-B-S. Trasferire ora l'intero volume della sospensione cellulare marcata con anticorpo nella provetta marcata CD 19 positivo CD 34 positivo CD 45 positivo.

Sciacquare la provetta con un ulteriore millilitro di tampone E-D-T-A-P-B-S e trasferire la sospensione cellulare residua nella provetta CD 19 positiva CD 34 positiva CD 45 positiva. Infine, aggiungere 300 microlitri di tampone legante alle sette provette A e D per selezionare le cellule utilizzando il citometro a flusso MO XDP. Per prima cosa imposta il flusso MO per l'ordinamento, esegui i controlli di compensazione appropriati e quindi crea un protocollo che includa i grafici, come illustrato in questa figura.

Assicurarsi che il sistema di evacuazione dell'aerosol sia sempre in funzione, quindi utilizzare il campione non colorato per impostare la tensione e il guadagno per i grafici di dispersione in avanti e lateralmente. Identificare le popolazioni di fluorescenza negative. Impostare la soglia su un valore inferiore o uguale all'1% in modo che il DNA contenente detriti non contamini i campioni recuperati.

Esegui circa 50.000 eventi del campione CD 19 positivo CD 34 positivo CD 45 positivo. Per impostare la strategia di gating come appena dimostrato back gating, la popolazione non allocata CD 19 positiva CD 34 positiva sul grafico di dispersione laterale rispetto a quella in avanti. Per garantire che l'andatura linfocitaria includa potenziali cellule pro B.

Utilizzare questo campione per impostare anche la popolazione di fluorescenza negativa per la colorazione a sette a. Successivamente, eseguire i sette campioni per determinare la vitalità del campione, selezionare solo le cellule da un campione con una vitalità maggiore o uguale al 95% all'inizio, poiché le cellule morte si colorano indiscriminatamente e possono contaminare le popolazioni di ordinamento, ora impostate decisioni di ordinamento per raccogliere per le popolazioni CD 19 positivo, CD 34 positivo, CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45, CD basso 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45 medio e CD 19 positivo. CD 34 negativo CD 45 alto.

Includere le porte di discriminazione dei linfociti e del doppietto nelle decisioni di tutte le popolazioni per prevenire gli intasamenti. Nella punta di selezione, filtrare il campione positivo CD 19, CD 34, CD 45 positivo attraverso un colino cellulare da 40 micron immediatamente prima della cernita. Quindi posizionare le provette di raccolta etichettate rivestite con il 2% di FBS in PBS in un portaprovette imballato con ghiaccio e smistare le cellule nella provetta di raccolta appropriata subito dopo il completamento della cernita.

Estrarre il DNA tra la variazione del campione gioca un ruolo nel successo della cellula, ordinarla in un buon ordine. C'è un'alta percentuale di cellule nell'andatura linfocitaria. I campioni con buone percentuali di successo contengono bassi livelli di detriti contaminanti, come evidenziato dal basso numero di eventi che cadono al di sotto e a sinistra della popolazione di linfociti gated.

I campioni con scarse percentuali di successo contengono alti livelli di detriti contaminanti. I campioni scadenti mostrano un marcato aumento di questi eventi. Le cellule selezionate a flusso e il successivo DNA isolato da ciascun sottogruppo di cellule B precursori sono di quantità e qualità per eseguire analisi a valle.

Abbiamo utilizzato abitualmente questo DNA in Myra per arricchire dal DNA metilato il DNA, isolato da CD 19 positivo, CD 34 cellule positive, CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45 cellule basse, CD 19 positivo, CD 34 negativo, CD 45 cellule medie e CD 19 positivo, CD 34. Le cellule negative CD 45 sono state sonicate in alto per un totale di nove minuti, purificate in colonna e quindi visualizzate su un gel all'1%aros con colorazione in gel di acido nucleico verde cibernetico in questa corsia. È stata eseguita anche una scala di controllo a 100 coppie di basi dopo Myra utilizzando il metodo del motivo attivo collector ultra kit PCR con i geni di controllo SLC 25 A 37 metilato e APC di controllo non metilato uno per confermare l'arricchimento del DNA metilato.

La maggiore amplificazione dell'SLC 25. A 37 conferma l'arricchimento del DNA metilato nei sottogruppi di cellule B precursori Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 10 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di trattare la cellula molto delicatamente e di utilizzare la quantità ottimizzata di anticorpi in modo da ridurre al minimo la generazione di detriti contaminanti Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il sequenziamento di nuova generazione, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali geni sono metilati e quali sottogruppi di cellule B precursori. Non dimenticare che lavorare con cellule umane vive può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come l'esecuzione di un sistema di evacuazione dell'aerosol devono essere prese in ogni momento quando si esegue questa procedura.