Flybar: Amministrazione alcol a Flies

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare i comportamenti indotti dall'alcol in Drosophila, utilizzando un apparato economico e facilmente assemblabile, particolarmente adatto alla ricerca per studenti universitari o ricercatori nuovi agli studi circadiani. Ciò viene realizzato innanzitutto assemblando la barra per moscerini, che consente confronti simultanei tra più gruppi di moscerini.

Il passo successivo della procedura consiste nel coltivare *Drosophila* in cicli luce-buio specificati e raccogliere insetti di età corrispondente per l'esperimento. Successivamente, gli insetti vengono esposti a concentrazioni definite di vapore di alcol e vengono raccolti i dati. In definitiva, misurando la perdita del riflesso di deambulazione o la sedazione è possibile evidenziare differenze nella sensibilità all'alcol tra i gruppi, in base all'ora del giorno o alla genetica.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché i passaggi di osservazione sono difficili da apprendere a causa delle difficoltà nel rilevare il comportamento e della scarsa illuminazione rossa, nonché nel determinare quali mosche abbiano perso il riflesso di scrittura e quali no. Montare innanzitutto la barra porta-mosche. Iniziare assemblando il flusso d'aria.

Collegare un breve tratto di tubo flessibile in silicone a un prelievo d'aria dell'edificio o a un aeratore per acquari per fornire il flusso d'aria. Suddividere il flusso d'aria con un connettore a Y. Collegare il primo ramo a un regolatore.

Regolerà la quantità totale di aria che attraversa il sistema. Collegare il secondo ramo a un connettore rapido. Questo permetterà di interrompere il flusso d'aria secondo necessità, senza alterare la portata d'aria calibrata.

Aggiungere un connettore a Y e collegare ciascun tubo ramificato a un regolatore di flusso d'aria. Quindi collegare ciascun regolatore a un misuratore di flusso d'aria. Ora sezionare pipette di vetro da un millilitro e piegare ciascun pezzo formando un angolo retto.

Questi funzioneranno come tubi rigidi ad angolo nella configurazione. Inserire la pipetta di vetro dritta per l'ingresso dell'aria attraverso un foro e farla protrudere nel liquido fino a un centimetro sopra il fondo. Inserire un tratto di tubo di vetro ad angolo nell'altro foro fino a quando entra appena nella bottiglia.

Utilizzare queste uscite per unire il flusso d'aria da ciascuna bottiglia in un connettore a Y. Mediante tubi flessibili, collegare i misuratori di flusso d'aria alla sezione dritta di una pipetta. Questi fungeranno da ingressi d'aria per le due bottiglie contenenti soluzione.

Acqua o alcol, mantenere entrambe le bottiglie delle soluzioni in un bagno d'acqua regolato a due gradi superiore alla temperatura ambiente. Chiudere le bottiglie con tappi di gomma che presentano due fori con tubi di silicone. Collegare l'altro estremo della Y a una bottiglia con un tappo di gomma a due fori.

La corrente d'aria proveniente da questo flacone di miscelazione fornirà alcol e acqua sotto forma di vapore ai vial di osservazione. Suddividere la corrente d'aria in uscita dal flacone di miscelazione due o tre volte per ottenere quattro o otto flussi d'aria più piccoli, uno per ciascun vial di osservazione.

Continuare a utilizzare tubi di silicone. Le provette di osservazione sono provette per Drosophila vuote sigillate con un tappo di gomma a due fori, uno per l'ingresso e uno per l'uscita del vapore di alcol. Tubi di vetro si adattano ai fori del tappo.

Coprire le estremità del tubo di vetro con una rete. Fissare la rete in posizione utilizzando un piccolo pezzo di tubo di plastica flessibile. Inserire questo tubo nel primo foro fino a che non si estende per circa metà della lunghezza della provetta.

Se necessario, utilizzare nastro in teflon per ottenere un accoppiamento stretto. Inserire il secondo tubo di vetro con la rete fino a quando non risulti allineato con il bordo interno del tappo di gomma. Mescolare le frazioni appropriate dei due flussi d'aria passati attraverso alcol o acqua.

Monitorare continuamente la pressione dell'aria ed effettuare le regolazioni necessarie per mantenere la miscela desiderata di alcol e vapore acqueo nella bottiglia di miscelazione. Per questo tipo di esperimento, assicurarsi sempre che l'ambiente sia adeguatamente ventilato. Per ridurre al minimo le variazioni tra le repliche, è necessario prestare la massima attenzione alle condizioni di allevamento delle mosche.

Le mosche devono essere allevate in condizioni di bassa densità con un'accurata sincronizzazione in modo che mosche della stessa età e dello stesso gruppo possano essere confrontate tra loro. Avvicinarsi alle mosche al crepuscolo. Raccogliere animali appena schiusi e conservarli per 24 ore in provette contenenti una piccola quantità di alimento con alta concentrazione di agar, nello stesso momento.

Il giorno successivo, suddividere le mosche raccolte in gruppi di circa 30 mosche ciascuno utilizzando un aspiratore e trasferire i gruppi in provette fresche per testare la modulazione circadiana del comportamento. Preparare un numero sufficiente di gruppi per testare ciascuna condizione in sei punti temporali equidistanti durante la giornata di test, al fine di valutare il comportamento modulato dal ritmo circadiano. Inoltre, mantenere le mosche in oscurità costante a 25 gradi Celsius per due giorni prima del test.

Indipendentemente dal disegno sperimentale, almeno un'ora prima del saggio comportamentale, trasferire le mosche nella stanza sperimentale illuminata esclusivamente da luce rossa tenue. Eseguire gli esperimenti in luce rossa tenue in modo che la stimolazione luminosa non alteri i risultati. Prima dell'esperimento, far passare aria attraverso il sistema per almeno 10 minuti e calibrare i flussi d'aria.

Sotto l'osservazione delle provette. Posizionare un foglio di carta bianca per aumentare la visibilità dei moscerini grazie a un maggiore contrasto. Una volta stabilizzato il flusso d'aria, scollegare il connettore rapido e caricare un gruppo di 30 moscerini in ciascuna provetta di osservazione.

Per ogni esecuzione della barra delle mosche, testare ciascuna condizione sperimentale. Ciò aumenterà la robustezza dell'esperimento e ridurrà al minimo l'impatto delle variazioni giornaliere. Una volta caricati tutti i provette di osservazione, ricollegare il flusso d'aria e avviare i cronometri.

Utilizzare un timer per tenere traccia del tempo totale di esposizione all'alcol e l'altro per contare intervalli di cinque minuti durante tutta la durata della prova. Monitorare i flussi d'aria ed effettuare le regolazioni necessarie in modo che rimangano costanti. In generale, i flussi d'aria si stabilizzano ogni cinque minuti utilizzando una lampada a luce rossa.

Contare il numero di moscerini che hanno perso il riflesso di scrittura. Mantenere la lampada ad almeno 12 pollici dai flaconi. Dare un colpetto deciso al flacone e contare quanti moscerini non riescono a rialzarsi entro circa quattro secondi.

Questi insetti possono ancora muovere le zampe e le ali, ma non saranno in grado di rialzarsi. Se la mosca non muove alcun arto, è completamente sedata. Questo può essere considerato un criterio distinto rispetto all'assenza del riflesso di scrittura.

La sessione durerà circa un'ora; al termine, contare il numero totale di moscerini in ogni provetta utilizzando il protocollo descritto. È stata misurata una modulazione circadiana della sensibilità all'alcol. La mancanza del riflesso di scrittura è stata valutata in sei punti temporali durante il secondo giorno di buio in Canton S; il momento della giornata ha avuto un effetto significativo sul tempo.

La metà delle mosche non è riuscita a scrivere autonomamente. La percentuale di mosche dei cantoni sedate dopo 40 minuti con vapore al 30% di alcol è stata misurata al quinto giorno soggettivo CT e alla notte CT 17.

È stato riscontrato che un numero significativamente inferiore di moscerini è stato sedato durante la fase soggettiva del giorno rispetto alla notte. L'analisi di una serie temporale ha evidenziato differenze nel riflesso di scrittura e nella sedazione quando moscerini Canton S sono stati confrontati con moscerini portatori della mutazione white 1 1 1 8. Nel background Canton S, i moscerini white 1 1 1 8 hanno mostrato un migliore riflesso di scrittura in risposta ai vapori di etanolo rispetto ai Canton S. Sono state inoltre osservate differenze tra i mutanti white 1 1 1 8 e i moscerini di tipo selvatico nella velocità di sedazione.

La differenza è molto probabilmente dovuta ai livelli alterati di nemici biogenici associati alla mutazione white 1 1 1 8. Pertanto, è necessario controllare le risposte comportamentali causate dalla mutazione white 1 1 1 8 presente in molte linee transgeniche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come somministrare alcol alle mosche utilizzando il fly barn.

È essenziale che le mosche vengano raccolte in modo metodico e che le osservazioni effettuate alla luce rossa fioca siano standardizzate il più possibile.