La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l'esempio di bovini cellule endoteliali corneali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare la comunicazione intercellulare tramite canali giunzionali e canali HEMI mediante la quantificazione della diffusione dell'onda calcica intercellulare indotta da stimolazione meccanica in monolayer di cellule endoteliali corneali primarie. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando le cellule endoteliali corneali primarie da occhi bovini freschi. Come secondo passaggio, due o tre giorni dopo il semina in camere portaoggetti, il monolayer confluenziale di cellule viene caricato con il colorante fluorescente sensibile al calcio fluo-4 AM. Successivamente, applichiamo uno stimolo meccanico localizzato e controllato a una singola cellula del monolayer al fine di indurre un'onda calcica intercellulare, che viene visualizzata al microscopio confocale.

I risultati mostrano la diffusione della propagazione dell'onda di calcio intercellulare. L'inibizione finale dei canali giunzionali e dei canali emi viene utilizzata per chiarire le proprietà e la regolazione delle diverse isoforme di Conex e Panex che formano i canali giunzionali e i canali emi. Il vantaggio principale della propagazione dell'onda di calcio intercellulare indotta da stimolazione meccanica è che fornisce un metodo semplice e affidabile per esaminare il contributo e le proprietà dei canali di connessione e di passaggio in modo non invasivo.

Inoltre, il metodo si basa sulle molecole e sulle cascate di segnalazione fisiologiche presenti nei sistemi cellulari studiati. Infine, è facilmente adattabile a una varietà di sistemi cellulari, inclusi le cellule primarie e i modelli cellulari che esprimono in modo ectopico determinate isoforme di connessione o di PanIN. Questo metodo può fornire informazioni sulla funzione e sulla regolazione dinamica dei canali delle giunzioni a cappuccio (cap junction channels) e dei canali HEMI mediati da connessione e da PanIN, attraverso l'uso di silenziamento mediato da RNA di interferenza (siRNA) delle isoforme endogene di connessione o di PanIN e l'impiego di inibitori selettivi dei canali delle giunzioni a cappuccio e dei canali HEMI.

Questo sistema non è certamente limitato alle sole cellule endoteliali corneali. È adattabile a qualsiasi tipo cellulare e anche a tessuti più complessi. La procedura utilizza un occhio appena enucleato proveniente da una mucca non più vecchia di 18 mesi e prelevato entro cinque minuti dal decesso.

È stato trasportato in laboratorio in soluzione salina bilanciata di Earl e soluzione al 1% di iodio a quattro gradi Celsius. Per prima cosa, trasferire l'occhio in una piastra di Petri da 100 millimetri per 20 millimetri. Successivamente, risciacquare l'occhio con EBSS contenente il 1% di iodio.

Quindi sterilizzarlo con una soluzione contenente 70% di etanolo da questo punto in avanti. Lavorare in una cappa sterile. Dissezionare con attenzione la cornea dall'occhio e posizionarla in una piastra di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri contenente EBSS, con il strato di cellule epiteliali rivolto verso l'alto.

Rimuovere con attenzione qualsiasi residuo di tessuto irideo ancora attaccato alla cornea. Se necessario, trasferire la cornea in un altro contenitore di EBSS con il strato di cellule endoteliali rivolto verso l'alto, quindi risciacquare due volte con EBSS. Successivamente, posizionare la cornea con il strato endoteliale rivolto verso l'alto in un recipiente a forma di clessidra e coprire con il mezzo di crescita.

Per risciacquare, rimuovere il mezzo con una pipetta a depressione. Applicare 300 microlitri di soluzione di tripsina a 0,5 grammi per litro sullo strato endoteliale della cornea. Posizionare l'orologio di vetro contenente la cornea in una piastra di Petri coperta e trasferire nell'incubatrice per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo aver recuperato l'orologio, rimuovere delicatamente le cellule endoteliali dalla cornea utilizzando una pipetta di vetro a forma di uncino lucidata alla fiamma. Aspirare la soluzione contenente le cellule endoteliali e aggiungerla a un flacone da coltura quadrato da 25 centimetri contenente quattro millilitri di mezzo di coltura. Successivamente, applicare 300 microlitri di mezzo di crescita sulla cornea.

Ripetere il raschiamento e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al flacone da coltura. Ripetere questa operazione un’altra volta, quindi posizionare i flaconi da coltura contenenti le cellule endoteliali corneali nel mezzo di crescita nell’incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Due giorni dopo, aggiungere sei millilitri di mezzo di coltura e rinnovare il mezzo di crescita ogni due giorni.

Le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza entro sette-dieci giorni dall'isolamento al passaggio. Prima di tutto, aspirare il mezzo di coltura e quindi risciacquare due volte con EBSS. Quindi aggiungere due millilitri di tripsina in soluzione alle cellule e posizionare il flacone nell'incubatrice per tre-quattro minuti.

Quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo di crescita e pipettare il mezzo tre volte avanti e indietro per disperdere le cellule. Successivamente, contare le cellule utilizzando un emo, citometro o un contatore cellulare automatico. Aggiungere 165.000 cellule in due camere di coltura.

Successivamente, preparare delle fiasche da coltura quadrate da 75 centimetri quadrati per un nuovo passaggio a una densità di 6.250 cellule per centimetro quadrato e aggiungere mezzo di coltura fresco fino a un volume totale di 25 millilitri; quindi posizionare le fiasche e le camere porta-oggetti nell'incubatore. Il mezzo viene rinnovato ogni due giorni e la confluenza dello strato cellulare dovrebbe essere raggiunta entro tre o quattro giorni. Per prima cosa, caricare le cellule nella camera porta-oggetti con 10 micromoli di flu oh 4:00 AM in soluzione salina fosfato tampone per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione delicata mentre le cellule sono in incubazione in flu oh 4:00 AM; accoppiare una micropipetta di vetro con un diametro della punta inferiore a un micrometro a un nano-posizionatore piezoelettrico e collegarla a un amplificatore montato su un micromanipolatore.

Impostare la tensione del nano posizionatore tra 0,2 e 1,5 volt. Rimuovere la soluzione delle 4:00. Quindi lavare le cellule cinque volte con soluzione salina fosfato tampone, e successivamente incubare le cellule con PBS per almeno cinque minuti a temperatura ambiente prima della misurazione.

Eccitare a 488 nanometri con laser ad argon e utilizzare un divisore di fascio HFT 48. Raccogliere l'emissione fluorescente a 530 nanometri mediante un filtro di emissione passa-alto LP 505, con lo spillo regolato al minimo; qui viene utilizzato un obiettivo ad immersione in olio 40x. Posizionare la camera portaoggetti sul palco di un microscopio confocale e individuare un'area con cellule confluenti.

Successivamente, spostare il micromanipolatore per posizionare la micropipetta di vetro in modo che tocchi la membrana cellulare con un angolo di 45 gradi. Utilizzare il micromanipolatore per toccare brevemente meno dell'1% della membrana della singola cellula con la micropipetta di vetro ed esercitare una stimolazione meccanica della durata di un secondo sulla cellula. Quindi misurare i cambiamenti spaziali nella concentrazione degli ioni calcio a seguito della stimolazione meccanica, raccogliendo e memorizzando le immagini al microscopio confocale.

Infine, disegnare una regione di interesse poligonale per definire la superficie totale delle cellule responsivi utilizzando il software del microscopio confocale. I transitori di calcio indotti da stimolazione meccanica sono mostrati in diversi punti temporali in condizioni di controllo in cellule endoteliali corneali bovine mediante immagini fluorescenti rappresentative con pseudocolore; le intensità di fluorescenza prima della stimolazione sono mostrate nella prima immagine. La freccia bianca nella seconda immagine identifica la cellula stimolata meccanicamente.

L'onda di calcio si propaga attraverso sei strati cellulari adiacenti con un'area totale di cellule raggiunte dall'onda, che corrisponde a un'area attiva di 62.870 micrometri quadrati. Il grafico a linee mostra l'andamento nel tempo del valore di fluorescenza normalizzato o NF nella cellula meccanicamente stimolata indicata con ms e il valore medio di NF negli strati cellulari adiacenti da uno a cinque, indicati nel grafico come MB uno a MB cinque. Queste immagini mostrano cambiamenti significativi nella diffusione delle onde di calcio intercellulari dopo il trattamento con nucleotidi esogeni nel grafico a sinistra e dopo il trattamento con inibitori dell'ecto-nucleotidasi nel grafico a destra. In particolare, il grafico a sinistra mostra una diminuzione significativa dell'area attiva dopo il trattamento di cellule endoteliali corneali bovine con l'Aras Aase sei e l'Aase sette esogene, che idrolizzano l'ATP e l'ADP, inibendo così la via di comunicazione intercellulare pericrina.

L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 in presenza rispetto all'assenza di ace. Il grafico a destra mostra un aumento significativo dell'area attiva dopo il trattamento dei BCEC con un inibitore selettivo delle ecto-nucleotidasi, A RL 6 7 1 56, potenziando così la via di comunicazione intercellulare pericrina. L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 in presenza rispetto all'assenza di a RL Una volta acquisita.

Questa tecnica può essere eseguita in cinque a dieci minuti per un singolo esperimento in una singola condizione, quando viene effettuata correttamente. Eseguire un'intera serie di esperimenti, dai quali è possibile confrontare diverse condizioni, richiede un giorno per trarre conclusioni statistiche. Devono essere utilizzati esperimenti indipendenti effettuati in giorni diversi e da diversi lotti di cellule isolate.

La misurazione e la quantificazione della propagazione dell'onda di calcio intracellulare permettono l'identificazione e la caratterizzazione della regolazione biologica cellulare di diverse connessioni e isoforme di canali giunzionali di tipo GAB e canali EMI. Desidero inoltre sottolineare che questo metodo non deve essere considerato isolato, ma dovrebbe essere integrato con altri approcci molecolari e funzionali che vanno dal trasferimento dietetico al rilascio di TP e all'elettrofisiologia.