Name: La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: lesempio di bovini cellule endoteliali corneali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Impara a studiare la comunicazione intercellulare attraverso i canali gap junction e gli emicanali misurando la propagazione delle onde di calcio in monostrati di cellule endoteliali corneali bovine primarie.

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Il lavoro di ricerca svolto in laboratorio è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca - Fiandre (FWO; numeri di sovvenzione G.0545.08 e G.0298.11), il Interuniversitario attrazione polacchi Programma (Politica Scienza belga, numero di concessione P6/28 e P7/13) ed è incorporato in una comunità di ricerca FWO supportato. CDH è un borsista post-dottorato della Fondazione di Ricerca - Fiandre (FWO). Gli autori sono molto grati a tutti i membri attuali e precedenti del Laboratorio di Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), il laboratorio del Dr. Leybaert (Ghent University) e di Dr. Vinken (VUB) che ha fornito utili discussioni, ottimizzato procedure o sono stati coinvolti nello sviluppo di strumenti per lo studio della hemichannels connessina.

1. Isolamento di cellule endoteliali corneali Prima di iniziare: Isolare le cellule dagli occhi freschi, ottenuti da un macello locale, il più presto possibile dopo enucleare l&#39;occhio. Assicurarsi che l&#39;occhio è stato enucleato da una mucca di massimi 18 mesi di età, a cinque minuti post mortem e conservate in soluzione salina bilanciata di Earle - soluzione di iodio 1% a 4 ° C per il trasporto al laboratorio. <ol><li> Prendete l&#39;occhio di soluzione salina bilanciata del Earle - soluzione di iodio 1% e metterlo in una capsula di Petri (100 x 20 mm). </li><li> Sterilizzare l&#39;occhio con una soluzione contenente 70% di etanolo e sciacquare con soluzione salina bilanciata di Earle contenente 1% di iodio. </li><li> Da questo punto in poi, lavorare in una cappa sterile. Sezionare con cura la cornea dall&#39;occhio e metterla in una piastra di Petri (35 x 10 mm) contenente soluzione salina bilanciata di Earle, con lo strato di cellule epiteliali verso l&#39;alto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo sti tessuto dell&#39;iridell attaccato alla cornea, se necessario. </li><li> Trasferire la cornea di soluzione salina bilanciata di Earle contenente un&#39;altra piastra di Petri con lo strato di cellule endoteliali verso l&#39;alto e lavare due volte con soluzione salina bilanciata di Earle. </li><li> Trasferire la cornea con lo strato endoteliale rivolta verso l&#39;alto ad una clessidra, che è un piatto a forma di coppa, e coprire con terreno di crescita. Il mezzo di crescita consiste Medio Dulbecco Modified Eagle contenente 25 glucosio mM, 10% di siero fetale bovino, 6,6% di L-glutammina, 2,5 ug / ml di amfotericina-B e 1% miscela antibiotico-antimicotico contenente 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mcg / ml di streptomicina, e 25 ug / ml di amfotericina B. </li><li> Rimuovere il terreno con una pipetta di aspirazione. </li><li> Applicare 300 microlitri di una soluzione di tripsina (0,5 g / L) per lo strato endoteliale della cornea (tutti i passaggi che includono tripsina sono fatte utilizzando la stessa concentrazione). </li><li> Posizionare la clessidra contenente la cornea in una capsula di Petri coperta e metterlo nel incubator per 30 min a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule endoteliali lontano dalla cornea con un incendio lucidato a gancio pipetta Pasteur di vetro in una cappa sterile. </li><li> Succhiare la soluzione contenente le cellule endoteliali ed aggiungerlo alla fiasche di coltura (25 cm 2) contenenti 4 ml di terreno di coltura. </li><li> Applicare 300 ml di terreno di crescita alla cornea e ripetere la raschiatura e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al pallone cultura. </li><li> Ripetere questo passaggio finale (1.11) ancora una volta. </li><li> Posizionare la cultura flaconi contenenti le cellule endoteliali corneali nel mezzo di coltura in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo due giorni, aggiungere 6 ml di terreno di coltura. </li><li> Aggiornare il terreno di crescita ogni due giorni. </li></ol> 2. Colture Cellulari <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con soluzione salina bilanciata di Earle, quando viene raggiunta la confluenza (entro about 10 giorni dopo l&#39;isolamento). </li><li> Aggiungere 1,5 ml di soluzione di tripsina per le cellule per staccarli e mettere il pallone in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per 3-4 min. </li><li> Aggiungere 12 ml di mezzo di crescita. Pipettare le medie tre volte dentro e fuori per disperdere le cellule e contare le cellule. </li><li> Seed le cellule con una frazione variabile a seconda della densità cellulare e metterle in incubatrice. Preparare due vetrini ben a camera (con una superficie di 4,2 cm 2) con una conta cellulare di 165.000 cellule (densità cellulare 39.286 per cm 2). Preparare 80 centimetri due fiasche di coltura per un nuovo passaggio ad una densità di 6.250 per cm 2, e aggiungere mezzo di coltura fresco fino ad un volume totale di 25 ml. </li><li> Aggiornare la media ogni due giorni. </li><li> Confluenza dello strato di cellule viene raggiunto dopo 3 o 4 giorni. Utilizzare le cellule per gli esperimenti. </li><li> Quando confluenza dello strato di cellule nelle beute viene raggiunto, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6. Colture cellulari fino al passaggio 2 può essere utilizzato fo esperimenti. </li></ol> 3. La stimolazione meccanica per indurre Saluto di calcio <ol><li> Caricare le cellule nella diapositiva camerata con 10 mM Fluo-4:00 in PBS per 30 min a 37 ° C, mentre scuotendo delicatamente. </li><li> Rimuovere il Fluo-04:00 soluzione, lavare le cellule cinque volte con tampone fosfato salino, incubare le cellule con PBS e lasciare le celle per almeno 5 minuti a temperatura ambiente prima della misurazione. </li><li> Eccitano a 488 nm con Argon laser e uso divisore di fascio 488 HFT, raccogliere l&#39;emissione di fluorescenza a 530 nm usando un filtro di emissione longpass LP 505, fissato il foro stenopeico al minimo. Utilizzare un olio di immersione obiettivo 40X (Aria, 1.2 NA). In esperimenti con ARL-67156, utilizzare un obiettivo 10X (Aria, 0.3 NA). </li><li> Ricerca di un campo in cui le cellule sono confluenti sul microscopio confocale. </li><li> Posizionare la pipetta in modo che sia a 45 ° rispetto alla slitta incamerata e toccando la membrana cellulare.Provocare un corto (≈ 1 sec) stimolazione meccanica ad una singola cella. La stimolazione meccanica consiste di una deformazione acuta, di breve durata della cella toccando brevemente meno dell&#39;1% della membrana cellulare con una micropipetta di vetro (diametro in punta &lt;1 um) accoppiato ad un cristallo piezoelettrico nanopositioner, operato tramite un amplificatore che è montato su un micro-manipolatore. Le micropipette di vetro sono realizzati con un estrattore microelettrodo. Assicurarsi che il nanopositioner è gestito da una tensione compresa tra 0,2 e 1,5 V durante la stimolazione meccanica. Una tensione superiore a 1,5 V può provocare danni alle cellule. Per ciascun tipo di cellula e condizione la tensione ottimale per la stimolazione meccanica senza danno cellulare deve essere accuratamente determinato applicando una serie di tensioni partire dal basso (0,2 V) ad alto (1,5 V) tensione. La tensione è una misura per la forza della stimolazione poiché questa tensione determina la sollecitazione meccanica e la tensione che vengono applicati alla membrana cellulare. Glivigore della stimolazione meccanica può essere calcolata moltiplicando la sollecitazione meccanica con la zona. Poiché sia l&#39;area (&lt;3,14 micron 2) e le sollecitazioni meccaniche sono molto bassi, la forza della stimolazione meccanica è basso. (Si noti che quando una cellula è danneggiata, le perdite di fluorescenza fuori della cellula e la cellula diventa scuro.) </li><li> Misurare le variazioni spaziali in [Ca 2 +] i in seguito a stimolazione meccanica con il microscopio confocale. </li><li> Raccogliere e conservare le immagini. </li><li> Disegnare una regione poligonale di interesse per definire la superficie totale di cellule responsive (area attiva, AA) usando il software del microscopio confocale. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, si descrive un metodo semplice per misurare intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde in monostrati di cellule endoteliali corneali bovina primarie, fornendo una stimolazione meccanica localizzato e controllato utilizzando una micropipetta. Cellule stimolate meccanicamente rispondono con un aumento locale della IP intracellulare 3 e Ca 2 +, che sono entrambi essenziali molecole di segnalazione intracellulare che guidano intercellulare Ca 2 +-propagazione</...

Comunicazione e di segnalazione intercellulare sono essenziali per il coordinamento dei processi fisiologici in risposta ad agonisti extracellulari al tessuto e il livello di 1,2 intera-organo. Il modo più diretto di comunicazione intercellulare è creato dalla presenza di giunzioni. Giunzioni gap sono placche di canali gap junction, che sono i canali proteici formati da docking testa a testa di due connessine (Cx) hemichannels delle celle adiacenti 3,4 (Figura 1). Giunzioni permettono il passaggio di piccole molecole di segnalazione con un peso molecolare di meno di 1,5 kDa, comprese Ca 2 + 3 o 5 IP, causando e modulando Ca 2 +-liberazione dalle riserve intracellulari delle cellule vicine 6 (Figura 2). Canali gap junction sono strettamente regolati dalle interazioni delle proteine ​​intra-ed intermolecolari e da processi di segnalazione cellulare, come la modifica redox efosforilazione 7. GJs facilitano la risposta coordinata delle celle collegate, agendo quindi come un prodotto chimico e sincizio elettrico. Per esempio, la diffusione di potenziale cardiaco di tutti i miociti atriali e ventricolari è mediato da canali GJ Cx basate 85. Cxs non solo hanno un ruolo come canali giunzioni gap, ma anche formano hemichannels spaiati, così funzionando come canali in membrane similmente a canali ionici regolari 8-10 (Figura 1). Hemichannels partecipano segnalazione paracrina tra cellule adiacenti controllando lo scambio di ioni e molecole di segnalazione tra l&#39;ambiente intra ed extracellulare. In molti tipi di cellule (come le cellule epiteliali, cellule osteoblastiche, astrociti, cellule endoteliali, ecc) e di organi (come il cervello, il fegato, la retina, coclea e il sistema vascolare), intercellulare Ca 2 +-onde sono fondamentali per il coordinamento delle risposte pluricellulari <sup&gt; 11. Aumenti di Ca2 + intracellulare livelli in una certa cella non sono limitati a questa cella, ma propagano alle cellule vicine circostanti, stabilendo così un intercellulare Ca 2 +-wave 12,13. Questi intercellulare Ca 2 +-onde sono importanti per il normale regolazione fisiologica di strati di cellule come un sincizio e loro disregolazione è stato associato a processi fisiopatologici 11. Nel endotelio corneale e l&#39;epitelio, diversi gruppi di 14-24, compreso il nostro 25-33, hanno studiato i meccanismi ei ruoli della comunicazione intercellulare. In cellule non eccitabili, come le cellule endoteliali corneali, due distinte modalità di comunicazione intercellulare verificano 28,29, cioè gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Gap giunzionale comunicazione intercellulare comporta uno scambio diretto di molecole di segnalazione tramite gap giunzioni 7. Gap giunzionecomunicazione intercellulare zionale è fondamentale per mantenere l&#39;omeostasi dei tessuti, il controllo della proliferazione cellulare, e stabilendo una risposta sincronizzata allo stress extracellulare 10,34,35. In un certo numero di patologie, gap accoppiamento giunzione è ridotta a causa di CXS difettosi, e con la presente colpisce gap giunzionale comunicazione intercellulare 36. Questo sottolinea l&#39;importanza e l&#39;influenza del gap giunzionale comunicazione intercellulare negli organismi multicellulari. In contrasto gap giunzionale comunicazione intercellulare, comunicazione intercellulare paracrina non dipende apposizione cellula-cellula, in quanto comporta il rilascio di messaggeri extracellulari diffusibili (Figura 2). Diversi tipi di molecole di segnalazione vengono rilasciati nello spazio extracellulare dalle cellule segnalazione. La molecola viene quindi trasportato alla cellula bersaglio dove viene rilevato da una proteina recettore specifico. Successivamente il complesso recettore-segnale induce una risposta cellulare, cheviene terminato dalla rimozione del segnale, inattivazione o desensibilizzazione. Usciti lipofile messaggeri di segnalazione extracellulare penetrano la membrana e agiscono sui recettori intracellulari. In contrasto, messaggeri idrofile non attraversano la membrana plasmatica della cellula rispondere, ma agiscono come un ligando che si lega a proteine ​​recettori di superficie espresse, che poi trasmettere il segnale per l&#39;ambiente intracellulare. Tre grandi famiglie di proteine ​​recettori di superficie delle cellule partecipano a questo processo: canale ionico-linked, enzyme-linked, e G-proteine ​​legate. La molecola messaggero rilasciato può agire sui recettori della stessa cella (autocrina), su cellule bersaglio in prossimità (paracrina) o su cellule bersaglio distanti che richiedono il sistema circolatorio (endocrino). In molti tipi cellulari, tra endotelio corneale 28,29, ATP è uno dei principali fattori paracrini idrofili, che guidano la propagazione di intercellulare Ca 2 +-onde 37-40. During deformazione meccanica, ipossia, infiammazione o stimolazione da vari agenti, ATP possono essere rilasciati dalle cellule sane 41-44 in risposta alle sollecitazioni di taglio, allungamento, o rigonfiamento osmotico 44,45. Meccanismi ATP-rilascio diverse sono state postulate, tra esocitosi vescicolare 44 e una pletora di meccanismi di trasporto, come ad esempio cassette (ABC) trasportatori ATP-binding, plasmalemmal canali anionici voltaggio-dipendenti, 46 canali del recettore P2X7 47,48, così come connessina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracellulare può essere rapidamente idrolizzato ad ADP, AMP, adenosina 54,55 da ectonucleotidases che sono presenti nell&#39;ambiente extracellulare. L&#39;ATP extracellulare rilasciato e il suo metabolita ADP 56 si diffonderanno in diffusione. La successiva interazione di questi nucleotidi con recettori purinergici nelle cellule vicine è stata implicata nella propagation di intercellulare Ca 2 +-onde 28,37,51. Due differenti classi di recettori purinergici sono presenti: adenosina è il ligando naturale principale per P1-recettori purinici, mentre sia purina (ATP, ADP) e pirimidine (UTP, UDP) nucleotidi agiscono su più recettori purinici P2-57. Comunicazione intercellulare può essere indagato con metodi diversi, come carico raschiare, il trasferimento di colore, uncaging locale di agonisti come IP 3 e Ca 2 +, la stimolazione meccanica, ecc. Qui si descrive lo studio di Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda suscitata da stimolazione meccanica di una singola cellula. Il vantaggio di studiare Ca 2 +-propagazione delle onde di stimolazione meccanica è che fornisce un facile strumento per quantificare la diffusione del Ca 2 +-onda nel tempo e permette confrontando quantitativamente diversi pretrattamenti delle cellule. Nell&#39;endotelio corneale, questi intercellulare Ca 2 +-onde consentire un corisposta coordinata dal monostrato, con la presente in qualità di un possibile meccanismo di difesa del non-rigenerativa dell&#39;endotelio corneale aiutando l&#39;endotelio a resistere alle sollecitazioni extracellulari durante l&#39;intervento chirurgico intraoculare, o in caso di esposizione di mediatori infiammatori durante rigetto immunitario o uveite 58,59.

<table><tbody><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (Glutamax)</td><td>Sonde Invitrogen-Gibco-Molecolari (Karlsruhe, Germania)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Miscela antibiotica-antimicotica</td><td>Sonde Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Germania)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sonde Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Germania)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germania)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germania)</td><td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-dietil-b,g-dibromometilene-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apirasi VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apirasi VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>Sintesi <td></td><td></td><td>peptidica personalizzata</td></tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>Sintesi <td></td><td></td><td>peptidica personalizzata</td></tr><tr><td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td><td>Sintesi</td><td></td><td></td>peptidica personalizzata</tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (senso: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>Il siRNA ricotto è stato acquistato presso Eurogentec (Luik, Belgio)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (senso: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>Il siRNA ricotto è stato acquistato presso Eurogentec (Luik, Belgio)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA scramble: sequenza criptata di siCx43-1 (senso: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td><td>Il siRNA ricotto è stato acquistato presso Eurogentec (Luik, Belgio)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Germania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Due vetrini a camera</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Danimarca)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germania)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; nanoposizionatore a cristallo elettrico (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Germania)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplifier</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Germania)</td><td>E463 HVPZT-amplifier</td><td></td></tr><tr><td>Tubi di vetro (sostituzione del vetro 3,5 nanolitri)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; estrattore per lectrode </td><td>Zeitz Instrumente (München, Germania)</td><td>WZ DMZ-Estrattore</td><td></td> universale</tr></tbody></table>

la stimolazione meccanica indotta calcio wave propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Comunicazione intercellulare è essenziale per il coordinamento dei processi fisiologici tra le cellule in una varietà di organi e tessuti, compreso il cervello, fegato, retina, coclea e vascolare. In impostazioni sperimentali, intercellulare Ca 2 +-onde possono essere provocato applicando uno stimolo meccanico a una singola cella. Ciò conduce al rilascio delle molecole di segnalazione intracellulare IP 3 e Ca 2 + che avviare la propagazione del Ca 2 +-onda concentricamente dal cellulare stimolata meccanicamente alle cellule vicine. I principali meccanismi molecolari che controllano intercellulare Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda sono forniti da gap canali di giunzione attraverso il trasferimento diretto di IP 3 e dal hemichannels attraverso il rilascio di ATP. Identificazione e caratterizzazione delle proprietà e la regolazione dei diversi connessina e isoforme pannexin come canali gap junction e hemichannels sono consentiti dalla quantification della diffusione del intercellulare Ca 2 +-onda, siRNA, e l&#39;uso di inibitori di canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca 2 +-onda in monostrati di cellule endoteliali corneali primarie caricato con Fluo4-AM in risposta ad uno stimolo meccanico controllata e localizzata provocata da un acuto deformazione, di breve durata della cellula come risultato di toccare la membrana cellulare con una micropipetta di vetro micromanipolatore controllato con un diametro di punta di meno di 1 um. Abbiamo anche descrivono l&#39;isolamento delle specie bovina cellule endoteliali corneali primarie e il suo utilizzo come sistema modello per valutare l&#39;attività Cx43-hemichannel come la forza guidato per intercellulare Ca 2 +-onde attraverso il rilascio di ATP. Infine, si discute l&#39;uso, i vantaggi, i limiti e le alternative di questo metodo nel contesto di apertura di canale di giunzione e di ricerca hemichannel.

Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione e il protocollo viene dimostrato viene eseguita sotto la guida e l&#39;approvazione della cura degli animali e del Comitato utilizzo del KU Leuven. Nelle cellule endoteliali corneali bovina (BCEC), giunzioni gap funzionali sono espresse e sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrine contribuiscono in modo significativo alla com...

Intercellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Onde sono guidati da canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Onde in monostrati di cellule in risposta ad uno stimolo meccanico unicellulare locale e la sua applicazione per investigare le proprietà e la regolazione dei canali gap junction e hemichannels.

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare la comunicazione intercellulare tramite canali giunzionali e canali HEMI mediante la quantificazione della diffusione dell'onda calcica intercellulare indotta da stimolazione meccanica in monolayer di cellule endoteliali corneali primarie. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando le cellule endoteliali corneali primarie da occhi bovini freschi. Come secondo passaggio, due o tre giorni dopo il semina in camere portaoggetti, il monolayer confluenziale di cellule viene caricato con il colorante fluorescente sensibile al calcio fluo-4 AM. Successivamente, applichiamo uno stimolo meccanico localizzato e controllato a una singola cellula del monolayer al fine di indurre un'onda calcica intercellulare, che viene visualizzata al microscopio confocale.I risultati mostrano la diffusione della propagazione dell'onda di calcio intercellulare. L'inibizione finale dei canali giunzionali e dei canali emi viene utilizzata per chiarire le proprietà e la regolazione delle diverse isoforme di Conex e Panex che formano i canali giunzionali e i canali emi. Il vantaggio principale della propagazione dell'onda di calcio intercellulare indotta da stimolazione meccanica è che fornisce un metodo semplice e affidabile per esaminare il contributo e le proprietà dei canali di connessione e di passaggio in modo non invasivo.Inoltre, il metodo si basa sulle molecole e sulle cascate di segnalazione fisiologiche presenti nei sistemi cellulari studiati. Infine, è facilmente adattabile a una varietà di sistemi cellulari, inclusi le cellule primarie e i modelli cellulari che esprimono in modo ectopico determinate isoforme di connessione o di PanIN. Questo metodo può fornire informazioni sulla funzione e sulla regolazione dinamica dei canali delle giunzioni a cappuccio (cap junction channels) e dei canali HEMI mediati da connessione e da PanIN, attraverso l'uso di silenziamento mediato da RNA di interferenza (siRNA) delle isoforme endogene di connessione o di PanIN e l'impiego di inibitori selettivi dei canali delle giunzioni a cappuccio e dei canali HEMI.Questo sistema non è certamente limitato alle sole cellule endoteliali corneali. È adattabile a qualsiasi tipo cellulare e anche a tessuti più complessi. La procedura utilizza un occhio appena enucleato proveniente da una mucca non più vecchia di 18 mesi e prelevato entro cinque minuti dal decesso.È stato trasportato in laboratorio in soluzione salina bilanciata di Earl e soluzione al 1% di iodio a quattro gradi Celsius. Per prima cosa, trasferire l'occhio in una piastra di Petri da 100 millimetri per 20 millimetri. Successivamente, risciacquare l'occhio con EBSS contenente il 1% di iodio.Quindi sterilizzarlo con una soluzione contenente 70% di etanolo da questo punto in avanti. Lavorare in una cappa sterile. Dissezionare con attenzione la cornea dall'occhio e posizionarla in una piastra di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri contenente EBSS, con il strato di cellule epiteliali rivolto verso l'alto.Rimuovere con attenzione qualsiasi residuo di tessuto irideo ancora attaccato alla cornea. Se necessario, trasferire la cornea in un altro contenitore di EBSS con il strato di cellule endoteliali rivolto verso l'alto, quindi risciacquare due volte con EBSS. Successivamente, posizionare la cornea con il strato endoteliale rivolto verso l'alto in un recipiente a forma di clessidra e coprire con il mezzo di crescita.Per risciacquare, rimuovere il mezzo con una pipetta a depressione. Applicare 300 microlitri di soluzione di tripsina a 0,5 grammi per litro sullo strato endoteliale della cornea. Posizionare l'orologio di vetro contenente la cornea in una piastra di Petri coperta e trasferire nell'incubatrice per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Dopo aver recuperato l'orologio, rimuovere delicatamente le cellule endoteliali dalla cornea utilizzando una pipetta di vetro a forma di uncino lucidata alla fiamma. Aspirare la soluzione contenente le cellule endoteliali e aggiungerla a un flacone da coltura quadrato da 25 centimetri contenente quattro millilitri di mezzo di coltura. Successivamente, applicare 300 microlitri di mezzo di crescita sulla cornea.Ripetere il raschiamento e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al flacone da coltura. Ripetere questa operazione un’altra volta, quindi posizionare i flaconi da coltura contenenti le cellule endoteliali corneali nel mezzo di crescita nell’incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Due giorni dopo, aggiungere sei millilitri di mezzo di coltura e rinnovare il mezzo di crescita ogni due giorni.Le cellule dovrebbero raggiungere la confluenza entro sette-dieci giorni dall'isolamento al passaggio. Prima di tutto, aspirare il mezzo di coltura e quindi risciacquare due volte con EBSS. Quindi aggiungere due millilitri di tripsina in soluzione alle cellule e posizionare il flacone nell'incubatrice per tre-quattro minuti.Quindi aggiungere 12 millilitri di mezzo di crescita e pipettare il mezzo tre volte avanti e indietro per disperdere le cellule. Successivamente, contare le cellule utilizzando un emo, citometro o un contatore cellulare automatico. Aggiungere 165.000 cellule in due camere di coltura.Successivamente, preparare delle fiasche da coltura quadrate da 75 centimetri quadrati per un nuovo passaggio a una densità di 6.250 cellule per centimetro quadrato e aggiungere mezzo di coltura fresco fino a un volume totale di 25 millilitri; quindi posizionare le fiasche e le camere porta-oggetti nell'incubatore. Il mezzo viene rinnovato ogni due giorni e la confluenza dello strato cellulare dovrebbe essere raggiunta entro tre o quattro giorni. Per prima cosa, caricare le cellule nella camera porta-oggetti con 10 micromoli di flu oh 4:00 AM in soluzione salina fosfato tampone per 30 minuti a 37 gradi Celsius con agitazione delicata mentre le cellule sono in incubazione in flu oh 4:00 AM; accoppiare una micropipetta di vetro con un diametro della punta inferiore a un micrometro a un nano-posizionatore piezoelettrico e collegarla a un amplificatore montato su un micromanipolatore.Impostare la tensione del nano posizionatore tra 0,2 e 1,5 volt. Rimuovere la soluzione delle 4:00. Quindi lavare le cellule cinque volte con soluzione salina fosfato tampone, e successivamente incubare le cellule con PBS per almeno cinque minuti a temperatura ambiente prima della misurazione.Eccitare a 488 nanometri con laser ad argon e utilizzare un divisore di fascio HFT 48. Raccogliere l'emissione fluorescente a 530 nanometri mediante un filtro di emissione passa-alto LP 505, con lo spillo regolato al minimo; qui viene utilizzato un obiettivo ad immersione in olio 40x. Posizionare la camera portaoggetti sul palco di un microscopio confocale e individuare un'area con cellule confluenti.Successivamente, spostare il micromanipolatore per posizionare la micropipetta di vetro in modo che tocchi la membrana cellulare con un angolo di 45 gradi. Utilizzare il micromanipolatore per toccare brevemente meno dell'1% della membrana della singola cellula con la micropipetta di vetro ed esercitare una stimolazione meccanica della durata di un secondo sulla cellula. Quindi misurare i cambiamenti spaziali nella concentrazione degli ioni calcio a seguito della stimolazione meccanica, raccogliendo e memorizzando le immagini al microscopio confocale.Infine, disegnare una regione di interesse poligonale per definire la superficie totale delle cellule responsivi utilizzando il software del microscopio confocale. I transitori di calcio indotti da stimolazione meccanica sono mostrati in diversi punti temporali in condizioni di controllo in cellule endoteliali corneali bovine mediante immagini fluorescenti rappresentative con pseudocolore; le intensità di fluorescenza prima della stimolazione sono mostrate nella prima immagine. La freccia bianca nella seconda immagine identifica la cellula stimolata meccanicamente.L'onda di calcio si propaga attraverso sei strati cellulari adiacenti con un'area totale di cellule raggiunte dall'onda, che corrisponde a un'area attiva di 62.870 micrometri quadrati. Il grafico a linee mostra l'andamento nel tempo del valore di fluorescenza normalizzato o NF nella cellula meccanicamente stimolata indicata con ms e il valore medio di NF negli strati cellulari adiacenti da uno a cinque, indicati nel grafico come MB uno a MB cinque. Queste immagini mostrano cambiamenti significativi nella diffusione delle onde di calcio intercellulari dopo il trattamento con nucleotidi esogeni nel grafico a sinistra e dopo il trattamento con inibitori dell'ecto-nucleotidasi nel grafico a destra. In particolare, il grafico a sinistra mostra una diminuzione significativa dell'area attiva dopo il trattamento di cellule endoteliali corneali bovine con l'Aras Aase sei e l'Aase sette esogene, che idrolizzano l'ATP e l'ADP, inibendo così la via di comunicazione intercellulare pericrina.L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 in presenza rispetto all'assenza di ace. Il grafico a destra mostra un aumento significativo dell'area attiva dopo il trattamento dei BCEC con un inibitore selettivo delle ecto-nucleotidasi, A RL 6 7 1 56, potenziando così la via di comunicazione intercellulare pericrina. L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 in presenza rispetto all'assenza di a RL Una volta acquisita.Questa tecnica può essere eseguita in cinque a dieci minuti per un singolo esperimento in una singola condizione, quando viene effettuata correttamente. Eseguire un'intera serie di esperimenti, dai quali è possibile confrontare diverse condizioni, richiede un giorno per trarre conclusioni statistiche. Devono essere utilizzati esperimenti indipendenti effettuati in giorni diversi e da diversi lotti di cellule isolate.La misurazione e la quantificazione della propagazione dell'onda di calcio intracellulare permettono l'identificazione e la caratterizzazione della regolazione biologica cellulare di diverse connessioni e isoforme di canali giunzionali di tipo GAB e canali EMI. Desidero inoltre sottolineare che questo metodo non deve essere considerato isolato, ma dovrebbe essere integrato con altri approcci molecolari e funzionali che vanno dal trasferimento dietetico al rilascio di TP e all'elettrofisiologia.

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