Name: Lacquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 1 s
Description: Scopri come acquisire filmati time-lapse a fluorescenza di lievito in crescita e analizzare serie temporali di espressione a livello di singola cellula. Questo metodo integra tracciamento automatico del lignaggio con cura manuale per garantire dati accurati sulla dinamica cellulare.

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Ringraziamo Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren per i commenti sul software. Questo lavoro è stato finanziato da GM95733 (a NM), BBBE 103316 e fondi di avvio del MIT (a NM).

<ol><li>Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).</li>
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<li>Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+temporally+controlled+gene+expression+and+long-term+fluorescent+imaging+in+unperturbed+dividing+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells.</a> PloS One. 3 (1), e1468(2008).</li>
<li>Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+quantification+of+molecules+and+rates+using+open-source+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry.</a> Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Sys.+Man.+Cyber%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Goranov, A. I., Cook, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+cell+growth+is+governed+by+cell+cycle+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The rate of cell growth is governed by cell cycle stage.</a> Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).</li>
<li>To, T. -L., Maheshri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+Can+Induce+Bimodality+in+Positive+Transcriptional+Feedback+Loops+Without+Bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability.</a> Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).</li>
<li>O'Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PHO4+nuclear+localization+by+the+PHO80-PHO85+cyclin-CDK+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex.</a> Science. 271 (5246), 209-212 (1996).</li>
<li>Raser, J. M., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stochasticity+in+eukaryotic+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stochasticity in eukaryotic gene expression.</a> Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il protocollo di cui sopra descrive un metodo semplice per ottenere e analizzare i dati di fluorescenza di serie storiche con limitata esperienza in microfluidica o nello sviluppo di software. Esso permette di ottenere in time-lapse film di fluorescenza di cellule di lievito singoli; estrarre dimensioni delle cellule pertinenti e misure di espressione; monitoraggio curato e assegnazioni lignaggio, e analizzare il comportamento delle cellule intere nel tempo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibili in...

Analisi di singole cellule di espressione genica ha favorito la nostra comprensione di molti aspetti della regolazione genica. Istantanee statiche di espressione reporter fluorescente mediante citometria di flusso o microscopia forniscono utili informazioni sulla distribuzione di espressione singola cellula, ma non hanno la storia e l&#39;evoluzione dei dati di serie storiche necessarie per informare direttamente le dinamiche di espressione genica. Fluorescenza time-lapse microscopia presenta un mezzo per ottenere entrambe le misure monocellulari e la loro storia. Varie tecniche sperimentali e analitiche sono state sviluppate per ottenere e quantificare i film d&#39;espressione reporter fluorescente, conferendo così intuizioni funzioni di regolazione genica (vedi 1 per una rassegna) come variazione cella-a-cella 2,3, formazione persister batterica 4, trascrizione iniziazione e di allungamento 5, trascrizionale scoppio 6,7, ciclo cellulare dipendenza da 8,9, e ereditabilità 10. Tuttavia, OBTaining cella singola serie temporale fluorescenza di qualità comporta notevoli difficoltà tecniche coltura un monostrato di cellule in un ambiente controllabile e quantificazione in high-throughput dei film fluorescenza acquisiti. Qui, descriviamo una procedura per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di S. cerevisiae con nessuna esperienza richiesta nella produzione di dispositivi di coltura cellulare o in fase di sviluppo del software (Figura 1). In primo luogo, abbiamo dettagliatamente un protocollo di esempio per generare in tempo fluorescenza i film di serie per il lievito in erba esprimere uno o più giornalisti fluorescenti. Sebbene camere di coltura microfluidica personalizzati sono stati costruiti e impiegati con successo in precedenza 11-13, utilizziamo un dispositivo microfluidica disponibile in commercio da CellAsic (Hayward, CA). Le cellule del sistema limita a crescita monostrato e permette il controllo continuo dell&#39;ambiente di perfusione. Il protocollo di microscopia che presentiamo è un semplice mezzo per ottenere flfilm senza di lievito in erba, ma qualsiasi protocollo modificato sperimentale (un dispositivo cultura personalizzata, condizioni di media alternativi, ecc.) che producono dati di filmati fluorescenza simili di cellule di lievito singoli possono essere sostituiti. Successivamente, abbiamo delineare l&#39;analisi dei filmati utilizzando una interfaccia grafica utente (GUI) basata su software in MATLAB (Mathworks, Natick, MA), soprannominata la GUI per analisi rapide del Tempo fluorescenza Series (INNESTI), per estrarre i dati di serie temporali per singole cellule. INNESTI ha caratteristiche simili al versatile, software open-source pacchetto Cell-ID 14 in segmentazione e monitoraggio delle cellule e nell&#39;estrazione intensità di fluorescenza e di informazioni geometriche. Tuttavia, innesti fornisce importanti funzionalità aggiuntive. In primo luogo, offre un facile editing interattivo di segmentazione e monitoraggio dei risultati per verificare l&#39;accuratezza dei dati, piuttosto che solo gating statistica dei valori anomali regione tracce dopo l&#39;analisi. Inoltre, si estende l&#39;analisi ai automatically designato lignaggio e punti del ciclo cellulare di interesse di lievito in erba. Determinare quando madre e figlia si dividono per formare due regioni di cellule indipendenti, è fondamentale per la determinazione delle cellule insieme (madre compresa qualsiasi gemma collegato) misurazioni durante tutto il ciclo cellulare 8. La suite si compone di tre moduli per eseguire queste operazioni. I primi segmenti regioni cellulari basati sul contrasto tra le immagini in campo chiaro mirate e vago, e permette all&#39;utente di definire e verificare visivamente i parametri di segmentazione. Le seconde tracce (. Utilizzando Blair e MATLAB implementazione di Dufresne della Crocker et al IDL di routine, disponibili presso: <a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/" target="_blank">http://physics.georgetown.edu/MATLAB/</a> ) e le misure regioni cellulari attraverso il tempo; assegna automaticamente lignaggi, e consente l&#39;ispezione visiva e correzione di errori. Una semplice interfaccia grafica complotto è incluso per le proprietà cella singola query. Il terzo modulo attribuisce gemma emergere e divisione TImes, ed emette dati cellula intera serie temporali nonché le loro derivate prime e seconde tempo (come discusso in 9). Il modulo di analisi emette i dati come file di testo delimitato da spazi per studio successivo nel software statistico di scelta. Così, il pacchetto consente all&#39;utente di estrarre dati di serie temporali di elevata qualità mediante un&#39;interfaccia grafica. Abbiamo usato questo metodo per stimare i tassi di trascrizione in tempo reale in singole cellule di lievito in erba in funzione del ciclo cellulare 9. Mentre i moduli sono stati ottimizzati per il lievito in erba, i parametri o, se necessario, il codice liberamente disponibile può essere adattato per altri organismi e tipi di immagine. Segmentazione, tracking, e lignaggio algoritmi di assegnazione possono essere specifiche per i tipi di immagini assegnato e l&#39;organismo in questione. Gli algoritmi esistenti potrebbero essere sostituiti, ma conservano ancora l&#39;interfaccia grafica che permette l&#39;ispezione di facile visiva e la correzione degli errori di segmentazione e monitoraggio che invariabilmente occupantir con qualsiasi algoritmo.

<table><tbody><tr><td>Y04C Piastra di perfusione di lievito</td><td>CellAsic</td><td>Y04C-02</td><td></td></tr><tr><td>ONIX Piattaforma di perfusione microfluidica</td><td>CellAsic</td><td>EV-262</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.40 Obiettivo DIC a olio</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera EMCCD Cascade II</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampada ad arco ad alogenuri metallici Lumen 200</td><td>PRIOR Scientific Cubo</td><td></td><td></td></tr> di <tr><td>filtro dicroico passa-banda triplo e set di filtri di eccitazione ed emissione</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>set #89006</td><td>Utilizzato per il controller YFP (Venere/Citrino), CFP (Ceruleo), RFP (mCherry/tdTomato)</td></tr><tr><td>MAC 5000 e ruote portafiltri</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2011a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>La versione a 64 bit gestisce file di dati di grandi dimensioni in modo migliore di quella a 32 bit</td></tr></tbody></table>

l&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e analisi dinamica singola cella utilizzando innesti

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescenza time-lapse microscopia è diventato un potente strumento per lo studio di molti processi biologici a livello di singola cellula. In particolare, i film che descrivono la dipendenza temporale di espressione genica fornire una conoscenza delle dinamiche della sua regolazione, tuttavia, ci sono molte sfide tecniche per ottenere e analizzare i film di fluorescenza di singole cellule. Descriviamo qui un semplice protocollo utilizzando un dispositivo cultura microfluidica disponibile in commercio per produrre tali dati, e una, interfaccia MATLAB basata utente grafica (GUI) basata su software per quantificare le immagini di fluorescenza. I segmenti software e cellule tracce, consente all&#39;utente di curare visivamente errori nei dati, e assegna automaticamente lignaggio e tempi di divisione. La GUI analizza ulteriormente la serie temporale di produrre tracce cellule intere e le loro derivate prime e seconde tempo. Mentre il software è stato progettato per S. cerevisiae, la sua modularità e versatilità dovrebbero permettere tØ fungere da piattaforma per lo studio di altri tipi di cellule con poche modifiche.

Un esperimento condotto con successo e analizzato produrrà serie temporali per lo più continua di cellule intere singole con realisticamente assegnato emergere bocciolo e tempi di divisione. Come esempio, abbiamo eseguito il protocollo di cui sopra con un ceppo di lievito aploidi esprimendo una copia integrata della proteina fluorescente Cerulean (PCP) guidato dal promotore costitutivo ADH1 osservare come la crescita e l&#39;espressione globale può variare nel tempo in cellule singole (Tabella ...

Vi presentiamo un semplice protocollo per ottenere filmati di microscopia a fluorescenza di crescita cellule di lievito, e un pacchetto software basato su GUI per estrarre i dati cella singola serie storica. L&#39;analisi include lignaggio automatico e l&#39;assegnazione a divisione di tempo integrato con ispezione visiva e curation manuale dei dati rilevati.

L&#39;acquisizione di fluorescenza filmati time-lapse di lievito in erba e Analisi Dinamica singola cella utilizzando innesti

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere filmati a fluorescenza di singole cellule di lievito in crescita ed estrarre serie temporali di espressione del reporter per ciascuna cellula. Questo viene raggiunto innanzitutto coltivando un monocstrato di cellule in una camera microfluidica. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire microscopia a fluorescenza in time-lapse per uno o più reporter.Successivamente, i filmati vengono elaborati utilizzando il pacchetto software graft per tracciare e misurare le cellule nel tempo. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le misurazioni cellulari e gli assegnamenti delle linee cellulari ed esportare le serie temporali dell'espressione del reporter per ogni cellula intera. Infine, un tasso di trascrizione istantaneo, dedotto dalle serie temporali di espressione, viene utilizzato per mostrare le variazioni nella trascrizione sia durante il ciclo cellulare sia in risposta a livelli variabili dei fattori di trascrizione.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della regolazione genica, ad esempio con quale rapidità diversi promotori rispondono all'aggiunta improvvisa o alla sottrazione di un fattore di trascrizione attivo. Quanto varia questa risposta tra una popolazione di cellule e come diverse caratteristiche cellulari, tra cui la morfologia e la fase del ciclo cellulare, influenzano la risposta? Inoltre, questo metodo può esaminare gli effetti di aggiunte e sottrazioni multiple di un fattore di trascrizione attivo sull'espressione genica.Preparare cellule di lievito in crescita in condizioni di stato stazionario ricche di nutrienti, a una densità adatta per il caricamento nel dispositivo microfluidico come descritto nel protocollo testuale. Quindi preparare una piastra di coltura microfluidica Y zero four C da cell ASIC lavando le pozzette con acqua sterile dopo aver rimosso la soluzione di trasporto, utilizzando il sistema di perfusione onyx: far scorrere acqua attraverso le pozzette da uno a sei a sei PSI per cinque minuti per lavare i canali, quindi far scorrere il liquido dalla pozzetta di caricamento otto a sei PSI per 10 secondi. Rimuovere l'acqua da tutte le pozzette e sostituirla con 250 microlitri di mezzo SC nelle pozzette di ingresso, da uno a sei, e con 50 microlitri della coltura cellulare preparata nella pozzetta di caricamento delle cellule.Sigillare il manifold in onice alla piastra con il pozzetto otto e iniziare a primeare i canali e la camera di coltura facendo fluire il liquido dai pozzi di ingresso da uno a sei a 6 PSI per due minuti. Successivamente, far fluire il mezzo di partenza dal solo pozzetto di ingresso contenente questo mezzo per almeno cinque minuti. Mantenere il flusso a 6 PSI in modo continuo fino all'allestimento al microscopio, quindi fissare la piastra al supporto dello stage con del nastro adesivo per evitarne lo spostamento durante l'esperimento, migliorando così il tracciamento cellulare durante l'analisi dei dati; dopo aver preparato il microscopio come descritto nel protocollo testuale, applicare alcune gocce di liquido ad immersione sull'obiettivo e montare saldamente il dispositivo microfluidico.Sulla fase del microscopio invertito, focalizzare il terzo più a sinistra della prima camera di coltura utilizzando uno dei marcatori di posizione integrati. Spegnere il flusso dal pozzetto di ingresso del mezzo e dal pozzetto di caricamento delle cellule numero otto a sei PSI in impulsi di cinque secondi. Spostare la fase per osservare la camera di coltura alla ricerca di cellule.Aumentare il tempo di caricamento e la pressione del flusso fino a raggiungere la densità cellulare desiderata, ma evitare il sovraccarico e l'occlusione della barriera più a sinistra, dove il mezzo fresco entra nella camera. Iniziare il flusso dal pozzetto di ingresso del mezzo contenente il mezzo iniziale a sei PSI. In Metamorph o in altro software di automazione e controllo della microscopia.Impostare un'acquisizione multidimensionale per eseguire più immagini in diverse posizioni dello stage nel tempo. Impostare il numero di punti temporali e l'intervallo tra di essi. Quindi selezionare diverse posizioni dello stage con circa 10 cellule ciascuna.Configurare l'acquisizione in modo che, per ogni posizione dello stage e per ogni punto temporale, il programma focalizzi l'immagine in campo chiaro della luce trasmessa utilizzando il metodo di messa a fuoco automatica integrato in Metamorph, implementando l'autofocus come un journal scritto personalmente all'inizio di ogni posizione dello stage. Questo approccio offre un maggiore controllo sulla precisione della messa a fuoco. Impostare inoltre il programma per acquisire l'immagine in campo chiaro a più uno micron rispetto al piano focale e per acquisire un'immagine sfocata in campo chiaro a meno quattro micron rispetto al piano focale.Utilizzare dei journal personalizzati per modificare il fuoco secondo necessità tra le immagini. Infine, impostare il programma. Acquisire un'immagine in scala di grigi per ogni reporter fluorescente al piano focale.Utilizzando impostazioni ottimizzate per un'acquisizione rapida con foto-sbiadimento minimo. Preparare il programma di flusso per l'esperimento nel software di controllo Onyx. Quindi avviare contemporaneamente il programma di acquisizione in Metamorph e il programma di flusso nel software di controllo Onyx.Eseguire il file M di formattazione dati in MATLAB per aprire l'interfaccia grafica utente (GUI) di inserimento dati. Nella parte superiore, specificare o cercare la cartella contenente i file immagine per impostare la directory dei dati, quindi utilizzare l'interfaccia grafica per specificare i tipi di dati e i file immagine registrati durante l'esperimento. Procedere quindi selezionando i parametri di segmentazione come descritto nel protocollo testuale.La scelta dei parametri appropriati per la segmentazione di immagini in campo chiaro può risultare difficile e ha un effetto significativo sulla qualità dei dati risultanti in serie temporale. Ci concentriamo sull'identificazione di tutte le regioni cellulari, privilegiando la sovrasegmentazione piuttosto che la sottosegmentazione delle regioni. Durante l'ispezione visiva dei dati, le regioni sovrasegmentate possono essere unite per formare regioni cellulari complete, ma le regioni sottosegmentate non possono essere suddivise successivamente.Impostare i diversi parametri di segmentazione e verificare la qualità della segmentazione facendo clic su Test con successo. Le regioni segmentate saranno verdi con bordi magenta. Assicurarsi di utilizzare il cursore per controllare più punti temporali nel filmato quando la segmentazione è soddisfacente.Selezionare "done" per ripristinare i parametri di segmentazione nell'interfaccia grafica dei dati. Dopo aver selezionato i parametri del colore come descritto nel testo, premere il pulsante "auto threshold" per determinare automaticamente la soglia. Utilizzando il metodo di Tzu, l'immagine evidenzierà le aree conservate al di sopra della soglia.La soglia può essere regolata manualmente utilizzando la casella di modifica. Utilizzare la barra di scorrimento per verificare che la soglia sia appropriata per tutti i punti temporali. Una volta soddisfatti, premere fine.Per ripristinare la soglia nel formato dati gui, premere aggiungi e segmenta. Per creare la maschera di colore, premere formato dati per leggere i file immagine, elaborare i dati e creare un file dot mat nella cartella specificata. Questo file fungerà da input per l'interfaccia grafica di elaborazione della serie temporale.Eseguire il file M della serie temporale del processo in MATLAB per aprire l'interfaccia grafica di tracciamento. Dopo aver aperto l'interfaccia, impostare innanzitutto l'altezza della camera. Questo valore indica l'altezza della camera in cui le cellule sono intrappolate.Viene utilizzato come vincolo per approssimare il volume cellulare come un ellissoide tridimensionale in base all'asse maggiore e all'asse minore della regione cellulare. Impostare quindi i micrometri per pixel. Questo è il fattore di conversione utilizzato per calibrare la distanza da pixel a micrometro nelle immagini, in modo che l'area della sezione trasversale e il volume possano essere calibrati rispettivamente in micrometri quadrati e micrometri cubi.Successivamente, utilizzare il pannello dei filtri per impostare i parametri minimo e massimo al fine di eliminare le regioni indesiderate nella maschera. L'area è la dimensione della regione in pixel. ECC è il fattore di eccentricità, che risulta più circolare quando il valore si avvicina a zero.E SF è il fattore di forma, che risulta più circolare quando il valore si avvicina a uno; fare clic per caricare le immagini nel pannello di input/output del file e selezionare il file di dati dot mat di interesse generato dall'interfaccia grafica format data. La maschera della regione verrà applicata a ogni canale colore ed eseguite diverse misurazioni. Il file di dati viene quindi salvato dopo aver selezionato il parametro di tracciamento delle cellule come descritto nel testo.Fare clic su traccia cellule per seguire le regioni da un fotogramma al successivo utilizzando gli OID delle regioni per assegnare le linee discendenti ai nuovi gemmuli che compaiono e per salvare i dati; modificare i parametri nelle finestre a comparsa secondo necessità. Le linee discendenti vengono assegnate automaticamente minimizzando le distanze tra i gemmuli presunti e le madri potenziali. In ogni fotogramma.Fare clic sul pulsante sopra il pannello delle informazioni della cellula selezionata e correggere manualmente le regioni mal segmentate e gli errori nelle assegnazioni di ID o di linea utilizzando i vari strumenti grafici o i tasti di scelta rapida descritti nel protocollo testuale, al fine di curare correttamente i dati. Unire eventuali regioni sovrasegmentate, eliminare le regioni che non comprendono l'intera cellula e verificare che le relazioni tra cellula madre e gemmazione siano correttamente assegnate. Inoltre, eliminare eventuali ID verdi unendo le regioni.Correzione dell'id, assegnazione della regione a una madre, assegnazione di nessuna madre o eliminazione della regione. Poiché i dati del gemmulo verranno aggiunti a quelli della madre durante l'analisi finale. Non unire una regione di gemmulo alla sua madre.Ispezionare visivamente i dati per ogni fotogramma fino all'ultimo momento di interesse. Non è necessario esaminare l'intera serie temporale. Se i fotogrammi successivi non vengono utilizzati, assicurarsi di salvare le modifiche una volta completata l'ispezione delle regioni cellulari nell'intervallo temporale di interesse; a questo punto i dati per tutti i canali di fluorescenza e le loro variazioni nel tempo sono pronti per essere esportati.Utilizza l'analisi delle serie temporali per esaminare le serie temporali relative a cellule intere nel tempo. Calcola le informazioni sul ciclo cellulare ed esegui le derivate. Si aprirà una finestra che consente la selezione delle misurazioni di interesse e l'inserimento dei parametri di analisi. Inserisci l'ultimo punto temporale curato nell'interfaccia grafica.I parametri predefiniti di smoothing e assegnazione del ciclo cellulare funzionano bene per ceppi aploidi e diploidi acquisiti a intervalli di cinque minuti, ma potrebbero richiedere aggiustamenti per ottenere i migliori risultati. Una volta impostati tutti i parametri, selezionare "analizza" per esportare i dati delle serie temporali a livello di singola cellula come descritto nel protocollo testuale. Un esperimento correttamente eseguito e analizzato produrrà principalmente serie temporali continue per singole cellule intere, con tempi di comparsa e divisione assegnati in modo realistico, per un ceppo di lievito halo che esprime una copia integrata della proteina fluorescente Ian o della CFP sotto il controllo del promotore costitutivo di DH uno. Le misurazioni su cellule intere nel tempo sono state ottenute dall'analisi delle serie temporali.Le immagini in campo chiaro mostrano la cellula madre segmentata in blu e i suoi gemmuli in verde. Con l'intera cellula contigua delineata in rosso, emerge una dipendenza dal ciclo cellulare sia per il volume che per l'espressione. In questo caso, le regioni tratteggiate indicano quando la cellula si trova in fase S/G2/M e presenta una gemma; la gemmazione inizia alla transizione da G1 a S, rappresentata dal passaggio dal bianco al grigio.L'ombreggiatura e la divisione cellulare avvengono nella transizione da M a G1, con passaggio da ombreggiatura grigia a bianca dopo la formazione del gemmulo. Il volume totale combinato aumenta più rapidamente rispetto a prima, ma l'emergenza mentre la concentrazione proteica o l'intensità media diminuiscono leggermente. L'aumento della proteina integrata combinata accelera anche dopo la gemmazione, in confronto alla sola regione della cellula madre.Questi risultati dimostrano l'importanza di incorporare correttamente i contributi del gemmulo nella misurazione dell'intera cellula e sottolineano la necessità di assegnare in modo appropriato la formazione del gemmulo e i tempi di divisione. Le serie temporali differenziate possono essere utilizzate per calcolare un livello istantaneo relativo di mRNA e un tasso di trascrizione, entrambi i quali aumentano anche dopo la gemmazione, consentendo la generazione di un tempo stabile. Le derivate delle serie temporali di misurazione sono inoltre utili per studi cinetici che impiegano il sistema di espressione commutabile descritto nel protocollo testuale.Un'analisi in serie temporale mostra quando il fattore di trascrizione è localizzato nel nucleo e quando il gene bersaglio inizia e termina l'espressione. Le immagini di trascrizione mostrate qui sono microfotografie provenienti dai quattro canali di acquisizione indicati per una cellula con un attivatore trascrizionale Tet R a YFP commutabile associato a PHO4. L'attivatore trascrizionale si localizza nel nucleo marcato con RFP in risposta a basse concentrazioni di fosfato e induce l'espressione di un reporter CFP sotto il controllo di un promotore 7X Tet O.Le variazioni del tasso di trascrizione inferito cambiano in base alla localizzazione, sia in media che a livello di singola cellula. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altre analisi sui dati serie temporali multimensionali a livello di singola cellula per rispondere a ulteriori domande, ad esempio: come varia l'espressione all'interno della popolazione nel tempo? Gli effetti delle fluttuazioni estrinseche vengono ereditati per più generazioni?Le cinetiche di attivazione genica cambiano durante la riattivazione? Il ciclo cellulare svolge un ruolo e molte altre domande che richiedono l'analisi della crescita dell'espressione genica e delle traiettorie di linaggio a livello di singole cellule.

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