Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D In vitro Sistema Tumore test

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un sistema di test tumorale 3D con cellule primarie su un'impalcatura biologica decellularizzata. Ciò si ottiene preparando prima lo scaffold utilizzando un processo di decellularizzazione in cui un segmento di alluminio suino viene pompato con una soluzione di decellularizzazione. Il secondo passo consiste nell'isolare le cellule umane primarie dalla biopsia di un paziente utilizzando un protocollo di isolamento standard.

Successivamente, impostare il sistema di test del tumore tagliando la sottomucosa tubolare dell'intestino tenue su un lato, fissandola tra due anelli metallici e seminando con cellule tumorali e cellule stromali associate in densità cellulari definite. Il passaggio finale consiste nel coltivare il costrutto caricato in cella in una configurazione adeguata in condizioni statiche o dinamiche. In definitiva, la microscopia immunoistochimica viene utilizzata per valutare le caratteristiche della crescita tumorale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i sistemi di test tumorale TT, è che con questo metodo è possibile creare modelli di tessuto 3D che simulano le condizioni in vivo di un tumore in modo più accurato rispetto ai comuni modelli 2D. Il vantaggio della coltura dinamica è che le caratteristiche specifiche delle cellule vengono mantenute. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei tumori, come ad esempio il modo in cui le cellule tumorali formano le interazioni cellula e matrice cellulare in un ambiente 3D, che aiuterà a chiarire i processi correlati al cancro come la progressione del tumore e le metastasi.

L'impalcatura biologica vascolarizzata o biova utilizzata in questo sistema di test dei tumori deriva da un segmento di jaal suino. Sciacquare il sistema vascolare del segmento suino e il lume intestinale con PBS tramite accesso arterioso cannulato. Ripetere fino a quando non è completamente pulito.

Preparare un serbatoio di vetro di 200 millimetri di diametro con quattro adattatori e collegarli tramite tubi di silicone alla pompa peristaltica. L'unità di controllo della pressione può essere monitorata tramite un sensore di pressione collegato a una cupola monouso sterile. Riempire i flaconi del serbatoio con soluzione di decellularizzazione o DZ.

Controllare il sistema di tubi per eventuali bolle d'aria. Collegare il lume intestinale con fascette ai connettori in vetro per il flusso luminale. Pompare 500 millilitri di soluzione DZ nell'accesso arterioso rosso del sistema vascolare.

Interrompere brevemente il processo di pompaggio ogni 15 minuti per espellere manualmente l'intero lume intestinale. È importante monitorare la pressione della soluzione tampone durante il processo di decellularizzazione. La pressione dovrebbe essere compresa tra 80 e 100 millimetri di mercurio modellato sulla pressione sanguigna naturale.

Lavare la biova con PBS fino a quando non è priva di residui di cellule e la struttura vascolare è completamente di colore bianco. Inizia questa procedura tagliando la biopsia cutanea in strisce di due o tre millimetri di larghezza con un bisturi e risciacquandole tre volte con una soluzione di PBS. Dopo aver incubato il tessuto con la soluzione di disbe, utilizzare due pinzette per separare l'epidermide dal derma.

Trasferire entrambi separatamente in piastre di Petri riempite con PBS per isolare le cellule endoteliali microvascolari dermiche primarie o le strisce dermiche di risciacquo MV eecs Una volta con ene, aggiungere 10 millilitri in soluzione di EDTA alle strisce dermiche e incubare a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Arrestare la reazione enzimatica con l'1% di FCS e trasferire le strisce di pelle in una capsula di Petri riempita con vita vascu. Gratta via ogni striscia con il bisturi otto volte su ciascun lato, aggiungendo una piccola pressione per produrre una sospensione cellulare.

Successivamente centrifugare la sospensione cellulare e risus, sospendere il pellet cellulare con vascu life. Per isolare i fibroblasti. Per prima cosa, usa un bisturi per tagliare le strisce di derma in piccoli pezzi.

Trasferire i pezzi di derma in una provetta Falcon e aggiungere 10 millilitri di soluzione di collagenasi incubata a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Quindi, centrifugare la soluzione e rimuovere con cura il surnatante. Lavare il pellet con DMEM più 10% FCS più 1% di streptococco.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante, risospendere il pellet nel terreno di coltura e trasferirlo in un pallone di coltura T 75 per consentire alle cellule di crescere fuori dal tessuto incubato in condizioni statiche. Per impostare prima il sistema di test del tumore, tagliare la sottomucosa tubolare dell'intestino tenue o muc SIS, aprirla su un lato e fissarla tra due anelli metallici. Queste corone cellulari autocostruite hanno un diametro di 10 millimetri.

Coprire il SIS mu in terreno di coltura cellulare durante la notte del giorno successivo, seminare MVE CS primario sulla superficie basale successiva del SIS, l'ex CI.Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per tre ore. Tre ore dopo, riempire il pozzetto con il terreno per garantire la coltura sommersa e rimetterlo nell'incubatrice. Lasciare che le cellule endoteliali aderiscano per tre giorni dopo tre giorni.

Capovolgere il sistema di coltura statica di 180 gradi e trasferirlo in una piastra a 12 pozzetti. Successivamente, vedere una miscela di fibroblasti dermici primari e cellule tumorali sulla superficie apicale del SIS. Il lato del lume precedente.

Lasciare che le cellule aderiscano per tre ore. Riempire il pozzetto con il terreno per immergere la coltura di coltura, il sistema di test dei tumori in condizioni statiche a 37 gradi Celsius, il 5% di anidride carbonica per altri 14 giorni, cambiando il terreno di coltura ogni due o tre giorni per la coltura dinamica. Fissare il SIS mu tra due anelli metallici e seminare le eec MV primarie come dimostrato in precedenza.

Dopo tre giorni, rimuovere il SIS mu dagli anelli metallici e inserire la membrana nel reattore a flusso con una siringa e una cannula. Applicare i fibroblasti dermici primari e le cellule tumorali sulla matrice del bioreattore. Lasciare che le cellule aderiscano per tre ore prima di riempire il sistema del bioreattore con il terreno di coltura il giorno successivo, posizionare il bioreattore in un sistema di incubazione autocostruito e collegarlo a una pompa peristaltica.

Questa configurazione consente la coltura dinamica con flusso pulsatile regolato a pressione o flusso costante. In questo esperimento, viene utilizzato un flusso medio costante di 3,8 millilitri al minuto. Mantenere la coltura dinamica per 14 giorni, cambiando il terreno di coltura dopo sette giorni.

Al termine degli esperimenti, i tessuti vengono fissati, paraffina, incorporati e colorati, e quindi ripresi con un microscopio inverso. I risultati rappresentativi sono mostrati qui. Il pannello A fornisce una panoramica della linea cellulare tumorale S 4 62 in monocoltura 2D colorata con emat tolina.

La co-coltura 3D è mostrata nei pannelli B, C e D.Questa immagine colorata con H ed e mostra la tripla coltura di cellule tumorali S 4 62 e fibroblasti primari sul lato apicale del SIS MU e MVEC. Sul lato laterale basale, le frecce segnano le cellule endoteliali. Diversi tipi di cellule possono essere identificati colorando marcatori specifici del tipo di cellula come il fattore di von Willebrand per etichettare MVEC mostrato nel pannello C e P 53 mostrato nel pannello D.Le cellule P 53 positive S 4 62 possono essere distinte dai fibroblasti primari P 53 negativi e la distribuzione 3D delle cellule può essere analizzata allo stesso modo.

Diversi tipi di cellule possono essere identificati nel pannello di coltura tripla coltivato dinamicamente A è un'immagine colorata con H ed E in cui le frecce segnano le cellule endoteliali. Il pannello B mostra la colorazione immunoistologica per il fattore di von Willebrand e il pannello C mostra la colorazione per P 53 Dopo questa procedura. Altri metodi, come i test farmacologici, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come trovare nuove terapie antitumorali o l'analisi di importanti vie di segnalazione nella tumorgenesi.

Inoltre, le cellule primarie possono essere utilizzate per definire il miglior trattamento personalizzato per i singoli pazienti.