Name: Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri l'isolamento delle cellule endoteliali ventricolari embrionali da embrioni di topo transgenico mediante dissezione, trattamento con collagene e separazione magnetica. Questo metodo facilita l'analisi dello sviluppo cardiovascolare.

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Vorremmo ringraziare Andrea Portbury per la lettura critica del manoscritto, il microscopio Servizio Laboratorio di UNC per l&#39;assistenza con il time-lapse imaging, e il NIH (borsa # R01HL061656) per il supporto finanziario.

1. Preparare Beads anticorpi coniugati <ol><li> Un giorno prima della dissezione, unire l&#39;anticorpo di scelta con le Dynabeads appropriate (ad esempio ratto IgG Dynabeads per un anticorpo cresciuto in ratto, 4 x 10 8 perline / ml) per le istruzioni del produttore. Per il BD ratto anti-CD31 anticorpo (0,5 mg / mL, per isolare le cellule endoteliali), è aggiunto 3 anticorpo microlitri per ogni 25 microlitri perline, per una concentrazione finale di 1,5 mg anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 7 perline / 25 microlitri di buffer. </li><li> Incubare perline e anticorpi notte a 4 ° C. </li></ol> 2. Preparazione del pannello di collagene <ol><li> Cellule isolate formano tubuli più rapidamente quando coltivate su un gel di collagene rispetto al solo una piastra rivestita di collagene. Pertanto, gel di collagene sono fatte la notte prima della dissezione, come descritto al punto 6. Sul ghiaccio in una cappa di coltura tissutale, combinare i seguenti reagenti (sufficiente per 19 pozzetti): 206,4 ml sterile H &lt;sub&gt; 2 O, 140,4 microlitri collagene di tipo I (4,08 mg / ml), 38,4 microlitri 10x M199, e 1,15 microlitri 5 M NaOH. </li><li> Pipettare 20 ml di gel di collagene presente nei pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 384 pozzetti. Porre la piastra in una ° C di coltura tissutale incubatore 37 per 30 min. </li><li> Aggiungere 80 microlitri DMEM a ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 ° C. Rimuovere il terreno di coltura e ripetere altre due volte. </li><li> Dopo l&#39;ultimo risciacquo, aggiungere 80 microlitri 10% FBS / DMEM a ciascun pozzetto e incubare una notte a 37 ° C. Rimuovere il mezzo di coltura prima di aggiungere le cellule isolate. </li></ol> 3. Accise e digerire il Cuore <ol><li> Eutanasia di un mouse timed-incinta al giorno embrionale desiderato utilizzando una tecnica di eutanasia approvato. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of North Carolina a Chapel Hill. </li><li> Con il mouse in posizione supina, liberalmente spruzzare il lato ventrale della femmina con il 70% di etanolo primadissezione. Utilizzando pinze per sollevare la pelle addominale inferiore e muscolo, allontanandosi dagli organi interni, tagliare aprire cavità inferiore addominale della femmina di visualizzare gli organi interni. </li><li> Tenendo il collo dell&#39;utero con una pinza, tagliare con cura caudale per la pinza e iniziare il sollevamento del corno uterino dalla cavità addominale. Mentre si solleva il corno uterino, tagliare qualsiasi tessuto connettivo che tiene il corno a posto. Per finire ablazione del corno uterino, tagliare il nodo del corno uterino con l&#39;ovidotto per liberare il corno uterino. </li><li> Collocare il corno uterino in una capsula di Petri contenente freddo 1x tampone fosfato salino (PBS) e sciacquare come necessario. Tagliare il corno uterino attraverso la linea mediana per esporre i sacchi embrionali allegati. </li><li> Tagliare un sacco embrionale all&#39;incrocio tra la placenta e l&#39;embrione di evitare accidentalmente tagliare l&#39;embrione e recuperare un embrione. Posizionare l&#39;embrione in una seconda capsula di Petri con PBS freddo. Riportare la capsula di Petri con il corno uterino di ghiaccio. </li><li> Decapitate l&#39;embrione per migliorare l&#39;accesso alla parete toracica. Se genotipizzazione è necessario, tagliare la coda per rimuoverla e salvare in una provetta Eppendorf posti su ghiaccio. </li><li> Con l&#39;embrione sul dorso, tagliare aprire la parete toracica per visualizzare il cuore e polmoni. Per evitare di tagliare il cuore, fare un taglio verticale lungo il lato della gabbia toracica, vicino a una zampa anteriore, seguito da un taglio orizzontale attraverso la parte inferiore delle costole, poi estrarre delicatamente la parete toracica e fuori del modo. Attraverso circa embrionale giorno 13.5, la parete toracica è trasparente, aiutando nella visualizzazione. </li><li> Sollevare delicatamente il cuore con pinze e tagliare i vasi sotto. Quindi, tagliare sopra i grandi vasi di liberare il cuore. Se i vasi polmonari non sono tagliati, i polmoni possono essere rimossi con il cuore. Così, eliminano tessuti estranei, come i polmoni, se necessario. </li><li> Separare e scartare i vasi atri e grande dai ventricoli. Utilizzando le forbici, tritare i ventricoli in piccoli pezzi (circa 1 mm 3 &lt;/ Sup&gt;) e il luogo in circa 500 ml di collagenasi (1 mg / ml in PBS sterile). Conservare i campioni in ghiaccio fino a quando tutti i ventricoli sono stati macinati e messi in collagenasi. </li><li> Ripetere i passaggi precedenti fino a quando i ventricoli sono stati rimossi da tutti gli embrioni, raccogliendo ogni cuore in un tubo Eppendorf separata. Se tutti gli embrioni hanno lo stesso genotipo, i cuori possono essere raggruppati in un unico tubo Eppendorf. Il numero di campioni trattati in una sola volta può essere limitato in base al magnete utilizzato per l&#39;isolamento, la DynaMag (123-21D), qui usato in possesso di un massimo di 16 provette Eppendorf. </li><li> Posizionare i ventricoli tritate a 37 ° C con dondolo per 45 min. Ogni 15 minuti, rimuovere delicatamente il campione e pipettare su e giù per dissociare meccanicamente le cellule. </li></ol> 4. Isolando le cellule endoteliali <ol><li> Far passare la soluzione ventricolo-collagenasi attraverso un 70 micron filtro per rimuovere macchie residue di cellule. </li><li> Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min. Scartareil surnatante, sostituire con circa 200 ml 10% FBS in DMEM, e pipettare su e giù per dissociare le cellule. </li><li> Ripetere il passaggio precedente una volta. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min dopo il secondo 10% FBS / DMEM lavaggio. Risospendere le cellule in 50 microlitri 10% FBS / DMEM. </li><li> Durante la fase di centrifugazione finale, preparare le perline. <ol><li> Porre il tubo Eppendorf contenente l&#39;anticorpo e perline su un magnete per 1 min. </li><li> Con il tubo in posizione sul magnete, rimuovere il surnatante. Togliere la provetta dal magnete e aggiungere circa 100 ml 10% FBS / DMEM. </li><li> Posizionare il tubo sul magnete per 1 min. Rimuovere il surnatante, e lavare ancora con 10% FBS / DMEM. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le sfere di anticorpi coniugati a 10% FBS / DMEM (5 ml per campione). </li></ol></li><li> Per ciascun campione cellulare, aggiungere 5 ml di perline anticorpo-coniugate. Posizionare le sospensioni bead-cell a 4 ° C con dondolo for 30 min. </li><li> In una cappa a flusso laminare, posizionare le provette Eppendorf contenenti cellule e perline anticorpi coniugati sul magnete per 1 min. Eliminare il surnatante, togliere i tubi dal magnete, e lavare con circa 100 l 10% FBS / DMEM. Ripetere l&#39;operazione per 5 lavaggi. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, posizionare i tubi sul magnete per 1 min, rimuovere il supernatante, e rimuovere i tubi dal magnete. Aggiungere circa 100 microlitri DMEM. </li><li> Porre i tubi sul magnete per 1 min, rimuovere il supernatante, e rimuovere i tubi dal magnete. Aggiungere 100-200 ml preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA. Incubare i campioni a 37 ° C e 5% di CO 2 per 5 min. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete per 2 min. Trasferire accuratamente il supernatante contenente cella per provette Eppendorf. Centrifugare per 5 min a 400 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 80-100 microlitri mezzo di crescita e piatto in un 96 - o 384 pozzetti piatto di coltura trattata, a seconda del rendimento atteso(Circa 450-600 cellule dai ventricoli del E14.5-E16.5 embrioni). Per le cellule endoteliali, utilizzare endoteliale coltura mezzo di crescita (definito di seguito). </li></ol>

<ol><li>Landecker, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandecker%2C+H+%22Culturing+Life%3A+How+Cells+Became+Technologies%22">Culturing Life: How Cells Became Technologies</a>. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).</li>
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<li>Arima, S., Nishiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+morphogenesis+driven+by+dynamic+and+heterogeneous+collective+endothelial+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement.</a> Development. 138, 4763-4776 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Lavorare con le cellule embrionali primarie consente nuovi esperimenti per affrontare in fasi critiche dello sviluppo in vitro. Tuttavia, la procedura di isolamento non è banale. Passaggi critici per isolare qualsiasi tipo di cellule comprendono assicurare che le cellule sono ben separati su digestione collagenasi e poi che siano ben sospesi durante le fasi di lavaggio. Dissezione meccanica pipettando aiuta notevolmente separare le cellule durante la fase di collagenasi, e la fase di filtraggio rimuove...

L&#39;avvento di linee cellulari immortalizzate ha rivoluzionato la biologia cellulare di base 1. Le linee cellulari attualmente disponibili sono derivati ​​da una vasta gamma di organi e comprendono tutti i principali tipi di cellule. Tuttavia, le linee cellulari stabilizzate hanno alcune limitazioni. Il processo di immortalizzazione ovviamente cambia il comportamento delle cellule, in particolare rispetto alla durata di vita e la proliferazione, ma può anche influenzare l&#39;espressione di proteine ​​imprevisti, come le proteine ​​citoscheletriche 2. Inoltre, anche se molte linee cellulari differenti sono disponibili, vi è diversità significativa tra anche un singolo tipo di cellula all&#39;interno un intero organismo. Le cellule endoteliali in particolare mostrano comportamenti diversi in base al fatto che la linea arterie o vene e che tipo di flusso è presente nel recipiente 3. Ancor più pressante da una prospettiva evolutiva, tuttavia, è che la stragrande maggioranza delle linee cellulari disponibili sono derivati ​​da tessuti adulti (vedi, ad esempio tegli collezione disponibile tramite ATCC). Queste linee cellulari adulte probabilmente non ricapitolano la natura dinamica dei loro precursori embrionali. La rapida evoluzione spazio-temporali pattern di espressione genica osservati durante lo sviluppo suggeriscono anche che una cellula endoteliale da un organo in un determinato stadio di sviluppo non può comportarsi allo stesso modo di una cellula endoteliale, da quello stesso organo, in una fase di sviluppo diverso. Come alternativa all&#39;utilizzo di linee cellulari immortalizzate disponibili in commercio, cellule primarie possono essere isolate dal tessuto specifico di interesse. Tra i vantaggi di questa tecnica, queste cellule primarie possono essere isolati da un organo specifico o anche parte di un organo in qualsiasi stadio di sviluppo specifico. Inoltre, queste cellule primarie possono essere isolati dalla grande varietà di animali transgenici disponibili, permettendo lo studio in vitro del gene knockout e knock-in, evitando altri problemi come l&#39;efficienza di trasfezione. Non sorprende che moltitecniche sono stati pubblicati in dettaglio come isolare specifici tipi di cellule 4,5. In generale, queste tecniche implicano la raccolta della regione di interesse, dissociare le cellule, tagging il tipo cellulare specifico di interesse, e isolando quelle celle per ulteriori analisi. Per studiare una popolazione precoce embrionale delle cellule endoteliali coronariche, abbiamo ridimensionato una tecnica 4 precedentemente pubblicato per l&#39;uso con un organo più piccolo. Con questa procedura in scala ridotta, possiamo isolare le cellule endoteliali coronariche dal cuore embrionale in stadi embrionali specifici. Queste cellule possono quindi essere utilizzate in saggi tradizionali endoteliali, quali le analisi di migrazione. Fino ai primi di linee cellulari embrionali sempre più frequentemente, lavorando con le cellule primarie è una tecnica di inestimabile.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Timed-pregnant topi</td><td></td><td></td><td>Da sezionare allo stadio embrionale di interesse</td></tr><tr><td>Anti-topo CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>553370</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110-35</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>BD Bioscience</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi, tipo I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di crescita delle cellule endoteliali</td> <td>(prodotto in laboratorio come descritto nelle note)</td><td></td> <td>DMEM contenente il 20% di FBS, 5 &mu; M &#946;-mercapt&#8211; thanol, 50 &mu; g/ml ECG e 1x penicillina/streptomicina</td></tr><tr><td>&#946;-mercapt&#8211; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ECGS</td><td>Tecnologie biomediche, Inc.</td><td>BT-203</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 384 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>T-3037-6</td><td>La piastra è stata preparata con un sottile gel di collagene, come descritto in 6; superficie di lavoro 10 mm2</td></tr><tr><td>Collagene di tipo I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>Utilizzare in un finale concentrazione di 1,5 mg/ml</td></tr><tr><td>M199, 10x</td><td>Invitrogen</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Syto-16</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td>Utilizzato come indicato in 13 </td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Thermo</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Thermo</td><td>75002430</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Coltura cellulare ha notevolmente migliorato la nostra capacità di valutare le singole popolazioni di cellule in condizioni di coltura miriade. Mentre le linee cellulari immortalizzate offrono vantaggi significativi per la loro facilità di utilizzo, queste linee cellulari non sono disponibili per tutti i potenziali tipi di cellule. Isolando cellule primarie di una regione di interesse, in particolare da un topo transgenico, studi più sfumate possono essere eseguite. La tecnica di base consiste dissezione dell&#39;organo o organo parziale di interesse (ad esempio il cuore o una regione specifica del cuore) e dissociare l&#39;organo di singole cellule. Queste cellule vengono poi incubate con perline magnetiche coniugate ad un anticorpo che riconosce il tipo cellulare di interesse. Le cellule di interesse possono quindi essere isolati con l&#39;uso di un magnete, con una breve incubazione tripsina dissociare le cellule dalle perline. Queste cellule isolate possono essere coltivate e analizzati come desiderato. Questa tecnica è stata originariamente progettata per adulto organo del mouses ma può essere facilmente ridotta per uso con organi embrionali, come dimostrato qui. Poiché il nostro interesse è nel sistema vascolare coronarico di sviluppo, abbiamo voluto studiare questa popolazione di cellule durante le fasi embrionali specifici. Così, il protocollo originale ha dovuto essere modificata per essere compatibile con le piccole dimensioni dei ventricoli embrionali e la bassa resa potenziale delle cellule endoteliali in queste fasi di sviluppo. Utilizzando questo approccio in scala ridotta, abbiamo valutato coronarica plesso rimodellamento ventricolare in cellule endoteliali embrionali transgeniche.

Utilizzando un anticorpo specifico per endoteliale che riconosce CD31, le cellule endoteliali sono state isolate dai ventricoli del embrionali (E) 13.5 (Figura 1A) e 18,5 (Figure 1B-1D) embrioni. Quando cresciuto su un piatto di coltura trattata, queste cellule rimangono arrotondate e formerebbero un pattern di ciottoli se vicino confluenti (Figura 1A). Diluire il collagene è stato utilizzato anche per rivestire i pozzetti, e mentre le cellule endoteliali aderirà ad ess...

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule endoteliali ventricolari embrionali. Questo viene raggiunto prelevando innanzitutto un embrione per la dissezione. Successivamente, il cuore viene escisso.I ventricoli tritati vengono trasferiti in una soluzione di collagene dopo la rimozione degli atri. Successivamente, la sospensione di singole cellule viene incubata con un anticorpo che riconosce le cellule endoteliali. Infine, un magnete viene utilizzato per isolare le cellule endoteliali legate all'anticorpo.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano la formazione di catene endoteliali mediante microscopia in campo chiaro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo cardiovascolare, come ad esempio quali fattori promuovono la migrazione delle cellule endoteliali coronariche. Sebbene questa tecnica possa fornire informazioni sul comportamento delle cellule endoteliali, può essere applicata anche ad altri tipi cellulari, come i miociti e i fibroblasti. Il giorno precedente l'esecuzione della dissezione, operando in una cappa a flusso laminare, combinare l'anticorpo scelto con le appropriate dyna beads seguendo le istruzioni del produttore per l'anticorpo rat anti CD 31 utilizzato in questo caso.Aggiungere tre microlitri di anticorpo a 25 microlitri di microsfere per ottenere una concentrazione finale di 1,5 microgrammi in 10 alla settima di microsfere. Incubare le microsfere con l'anticorpo tutta la notte a quattro gradi Celsius per preparare i gel di collagene per la rapida formazione di tubuli da cellule isolate in una cappa a flusso laminare, mantenendo il tutto sul ghiaccio. Combinare collagene di tipo uno, acqua sterile, 10 XM 1 99 e idrossido di sodio 5 M. Secondo il protocollo indicato nel testo, pipettare 20 microlitri del gel di collagene nei pozzetti di una piastra per colture cellulari da 384 pozzetti.Posizionare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere 80 microlitri di DMM in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Rimuovere il mezzo di coltura e ripetere il lavaggio altre due volte; dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere 80 microlitri di DM con FBS al 10% in ogni pozzetto e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.Dopo l'eutanasia di un topo gravido a giorni embrionali prestabiliti, utilizzando una tecnica approvata e rimuovendo il corno uterino secondo il protocollo descritto nel testo, posizionarlo in una piastra di Petri contenente un XPBS e risciacquarlo. Una volta esposte le sacche embrionali mediante un'incisione mediana al giunzione tra placenta ed embrione, aprire una sacca embrionale ed estrarre l'embrione.Posizionare l'embrione in una seconda piastra di Petri con PBS freddo e riportare il corno uterino sul ghiaccio per migliorare l'accesso alla parete toracica. Decapitare quindi l'embrione. Se previsto il genotipaggio, tagliare la coda e conservarla in un tubo posto sul ghiaccio. Con l'embrione in posizione supina, effettuare un taglio.Aprire la parete toracica per visualizzare il cuore e i polmoni, evitando di tagliare il cuore. Eseguire un taglio verticale lungo il lato della gabbia toracica vicino a un arto, seguito da un taglio orizzontale lungo la parte inferiore delle costole. Quindi sollevare delicatamente la parete toracica verso l'alto e spostarla di lato fino a circa il giorno embrionale 13,5.La parete toracica è trasparente, il che facilita la visualizzazione. Utilizzando una pinzetta, sollevare con cura il cuore e recidere i vasi sottostanti. Se necessario, trasferire il cuore in una capsula pulita per separarlo dai polmoni, recidendo al di sopra dei grossi vasi.Successivamente, separare e scartare le atria e i vasi sanguigni principali dai ventricoli. Quindi, utilizzando le forbici, tritare i ventricoli in piccoli pezzi e porli in circa 500 microlitri di collagenasi posta sul ghiaccio. Escindere ed elaborare i ventricoli dai restanti embrioni, raccogliendo ogni cuore in un tubo separato.Posizionare i ventricoli tritati a 37 gradi Celsius con movimento oscillatorio per 45 minuti. Ogni 15 minuti, rimuovere delicatamente i campioni e aspirare e rilasciare con una pipetta per dissociare meccanicamente le cellule. Al termine dell'incubazione, filtrare la soluzione di collaghenasi dei ventricoli attraverso un filtro da 70 micrometri per rimuovere gli aggregati cellulari residui, centrifugare le cellule a 400 ×g per 10 minuti, eliminare il soprannatante e sostituirlo con circa 200 microlitri di DMEM contenente il 10% di FBS, aspirare e rilasciare con una pipetta per risospendere le cellule, centrifugare nuovamente le cellule e quindi eseguire un secondo lavaggio e centrifugazione. Risospendere le cellule in 50 microlitri di DMEM contenente il 10% di FBS.Successivamente, preparare le microsfere posizionando prima il tubo contenente l'anticorpo e le microsfere su un magnete per un minuto, quindi asportare il soprannatante. Rimuovere quindi il tubo dal magnete e aggiungere circa 100 microlitri di FBS al 10% in dmm. Riportare il tubo sul magnete per un minuto, quindi rimuovere il soprannatante.Ripetere il lavaggio per un totale di tre volte dopo l'ultimo lavaggio. Ri-sospendere le perle coniugate con l'anticorpo in DMM contenente 10% di FBS per ogni campione cellulare, aggiungendo cinque microlitri delle perle coniugate con l'anticorpo. Incubare le sospensioni di perle e cellule a quattro gradi Celsius con agitazione per 30 minuti in una cappa a flusso laminare, quindi posizionare i campioni su un magnete per un minuto ed aspirare il soprannatante.Rimuovere le provette dal magnete e lavare con circa 100 microlitri di 10% FPS e dm. Ripetere per un totale di cinque lavaggi dopo l'ultimo lavaggio. Sospendere le perle in circa 100 microlitri di DMEM.Posizionare i tubi sul magnete per un minuto. Rimuovere il mezzo, quindi aggiungere da 100 a 200 microlitri di tripsina pre-riscaldata allo 0,25% in EDTA, incubare i campioni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per cinque minuti. Posizionare nuovamente i tubi sul magnete per due minuti.Quindi trasferire con attenzione il contenuto cellulare contenente il soprannatante in nuove provette e centrifugare per cinque minuti a 400 G. Infine, dopo aver rimosso il soprannatante, risospendere le cellule in 80-100 microlitri di mezzo di crescita endoteliale e seminare in una piastra da coltura trattata da 96 o 384 pozzetti, a seconda del rendimento previsto. Ogni coppia di ventricoli proveniente da embrioni compresi tra E14.5 ed E16.5 fornisce tipicamente da 450 a 600 cellule, come dimostrato qui utilizzando un anticorpo specifico per cellule endoteliali che riconosce CD31. Le cellule endoteliali sono state isolate dai ventricoli di embrioni al giorno E13.5.Quando coltivate in una piastra da coltura non trattata, queste cellule rimangono arrotondate e formano un pattern a ciottolato quando sono prossime alla confluenza. Sebbene le cellule aderiscano a piastre rivestite con collagene diluito, le cellule isolate dai ventricoli di E 18,5 formano un numero minore di catene rispetto a quando vengono coltivate su un gel di collagene. Inoltre, le cellule formano più rapidamente interazioni cellula-cellula e costituiscono catene, con ramificazioni sul gel di collagene rispetto alla piastra rivestita con collagene, confermando così la loro identità.Le cellule in questa figura risultano positivamente marcate con il marcatore endoteliale ISO selettina. Inoltre, come mostrato qui, le cellule endoteliali isolate dai ventricoli di embrioni E 18,5 sono risultate positivamente marcate con i marcatori endoteliali PAM e flick one. Questa figura mostra cellule endoteliali isolate dai ventricoli di un embrione E 14,5 e marcate con il colorante specifico per le cellule endoteliali cyto.16 cellule isolate sopravvivono fino a un passaggio in coltura, ma sono resistenti all'immortalizzazione e sono quindi più adatte per esperimenti terminali. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre ore e mezza se effettuata correttamente. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri saggi, come i saggi di formazione di tubuli e i saggi di migrazione in transwell, per determinare come si comportano queste cellule isolate in vitro.

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