Costruzione di matrici Microdrive per cronici Recordings neurali in topi Comportarsi Awake

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire un micro drive che possa essere utilizzato per le registrazioni cerebrali nei topi mentre si muovono liberamente all'interno di una camera sperimentale. Ciò si ottiene preparando prima un fascio di quattro micro elettrodi in un tede. Il secondo passo consiste nel costruire la base del microazionamento e assemblare i componenti dell'azionamento.

Successivamente, i tetros sono collegati all'unità e sono collegati a pin d'oro. Il passaggio finale consiste nell'oripolare la punta dei tetros per abbassarne l'impedenza e garantire un'elevata corrispondenza tra segnale e registrazioni di rumore. In definitiva, gli array di microunità croniche vengono utilizzati per registrare l'attività neurale di popolazioni di neuroni, così come di singoli neuroni in animali svegli che si comportano.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre una soluzione abbastanza economica e a onde luminose per registrazioni cerebrali croniche nei topi e in altri piccoli mammiferi. Questa tecnologia può affrontare questioni chiave nel campo delle neuroscienze, come il modo in cui i neuroni codificano le informazioni durante l'esecuzione di compiti comportamentali. Utilizziamo regolarmente questa tecnica per registrare dai neuroni dell'ippocampo dorsale e dell'ulu, ma l'abbiamo anche usata per colpire strutture più profonde come l'amigdala.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la costruzione e la parte di assemblaggio sono difficili da imparare, e anche perché si ha a che fare con una parte molto piccola e delicata per iniziare la fabbricazione del tetro. Per l'ippocampo, tagliare 30 centimetri di filo isolato di iridio con anima isolata di 12,5 micrometri di diametro, piegare il filo due volte per formare quattro fili paralleli ciascuno di 7,5 centimetri di lunghezza. Quindi, attacca una clip rivestita in gomma vicino alla parte inferiore del filo drappeggiato e fissala al tetro spinner motorizzato, assicurandoti che il filo sia teso ma non troppo teso o che il peso del cuscinetto sia questo lo causerà la rottura.

Durante il processo di centrifuga, applicare 80 rotazioni in senso orario per caricare il tero, seguite da 20 rotazioni in senso antiorario per rilasciare la tensione. Il numero finale di rotazioni per lunghezza di filo dovrebbe essere di otto rotazioni per micron. Quindi, imposta la pistola termica a 400 gradi Celsius e usala per fondere insieme i fili.

Far scorrere la pistola termica su e giù per la lunghezza dei fili per cinque secondi, mantenendola sempre a circa due centimetri dal filo. Per sciogliere delicatamente il rivestimento VG bond sui fili, tagliare la parte superiore del tero per formare quattro fili separati, quindi rilasciare l'estremità inferiore dalla clip. Riporre il tero completato in una scatola di contenimento priva di polvere per riporlo fino al completamento dell'unità.

Innanzitutto, costruisci la base per il micro drive levigando un pezzo quadrato di 20 millimetri di plexiglass acrilico con uno spessore di cinque millimetri in una forma che consentirà al mouse di muoversi liberamente con l'unità dopo che è stata impiantata sulla testa. Quindi, saldare insieme perpendicolarmente due guide in ottone da 3,3 x 6,3 millimetri. La guida verticale in ottone terrà la vite di azionamento e gli elettrodi mentre il pezzo orizzontale sarà incollato nella base in acrilico.

Quindi iniziare l'assemblaggio dell'unità stessa facendo passare una vite a seno con testa di riempimento attraverso la parte superiore della guida e in un blocco di plastica delrin. Infilare un petto esagonale non sulla vite fino a quando il dado non tocca quasi la parte inferiore della guida. Tuttavia, non serrarlo completamente.

Invece, sciogliere una piccola quantità di saldatura per unire il dado e la vite. Ma attenzione a non saldare nulla alla guida. Ruotando la vite si dovrebbe spostare il blocco di delrin in senso orario e antiorario verticalmente lungo la filettatura.

Una volta assemblato l'azionamento, tornare alla base in acrilico e tagliare una fessura larga tre millimetri dove si troverà l'azionamento dell'elettrodo. Quindi passare la guida orizzontale del reggiseno attraverso la fessura e quindi utilizzare la colla Sano ACRL per fissare il pezzo alla base. Quindi, posizionare una scheda di interfaccia elettronica sulla parte superiore della base e contrassegnare le posizioni dei due fori per le viti utilizzando un trapano a punta da 1,5 millimetri, praticare con cautela i fori in corrispondenza dei segni delle viti che terranno l'EIB in posizione sulla parte superiore della base.

Quindi avvitare due viti per il seno nei fori. Usa le forbici da micro dissezione per tagliare quattro pezzi di tubo in poliammide lunghi sette millimetri. Allineali uno accanto all'altro su un pezzo di nastro da laboratorio piegato e applica sano ACRL per unirli insieme.

Attendere che i tubi di giunzione si asciughino completamente. Quindi, tamponare con cura una piccola quantità di cianoacrilato sulla faccia del delrin. Quindi posizionare i quattro tubi di giunzione sulla colla.

Ancora una volta, attendere che la colla si solidifichi completamente prima di tentare di spostare l'unità. Verificare che i tubi in poliammide siano fissati saldamente e che l'intero gruppo si muova senza intoppi senza toccare la guida o incontrare alcuna resistenza. Quindi, preparare la vite di messa a terra e collegare il filo di terra all'EIB come descritto nel protocollo di testo allegato.

Collegare i tetros e/o i singoli elettrodi all'EIB facendo prima passare i fili attraverso il tubo in poliammide, permettendo loro di estendersi di almeno due millimetri oltre l'estremità del tubo. Quindi applicare una piccola goccia di cianoacrilato, fissando il filo al tubo e impedendo qualsiasi movimento del filo. Quindi, collegare le estremità libere del tero o di altri fili a un foro del canale EIB utilizzando uno spillo d'oro.

Infine, taglia il filo in eccesso con le forbici sottili mostrate. Di seguito sono riportati esempi di altre configurazioni di unità che possono essere costruite per indirizzare diverse regioni del cervello. Per iniziare viceversa, guidare il gruppo.

Tagliare il tubo in poliammide a 10 millimetri e guidarlo attraverso il foro più piccolo su un supporto in tetro fino a quando non si estende di 0,5 millimetri oltre l'estremità. Quindi epossidicare il tubo di poliammide in posizione e ripetere questi passaggi per gli altri tre tubi e supporti. Dopo che la resina epossidica si è completamente solidificata.

Far passare ciascun tubo in poliammide attraverso uno dei quattro fori sulla base di trasmissione Versa. Quindi spingere uno spillo per insetti attraverso il foro esterno. Questo manterrà il vettore tetro in linea e fungerà da binario su cui il vettore potrà viaggiare.

Ripeti l'operazione per gli altri tre vettori. Quindi, prendi un tappo e allinealo con i quattro perni per insetti in modo che il tappo copra la base e i tero carrier risiedano all'interno del tappo. Infilare una vite a macchina da un millimetro per cinque millimetri attraverso l'apposito foro nel tappo e nel supporto del tero.

Ripetere l'operazione per le altre tre viti. Ruotare tutte le viti in senso orario fino a quando i supporti in tetro non si trovano nella posizione più alta e i tubi in poliammide sono visibili attraverso l'apertura del tappo. Utilizzando le forbici da microdissezione fine, tagliare il tubo appena sotto la base in modo che tutti e quattro i tubi in poliammide abbiano la stessa lunghezza.

Quindi, utilizzare un microscopio da dissezione per infilare con cura i tetros attraverso i tubi di poliammide e fissarli in posizione con una piccola goccia di ano. Quindi tagliare i tetros in modo che si estendano solo di 2,0 millimetri oltre i tubi. Prima di collegare i fili del tero alle prese d'oro.

Innanzitutto, collegare i fili di terra al cappuccio. Quindi, guidare tutti i fili tero allentati attraverso i rispettivi fori di presa sul tappo e installare il tappo allineando i fori dei perni degli insetti e raccordandolo a pressione sulla base. Infine, taglia il filo in eccesso che rimane sporgente dalla parte superiore del cappuccio.

Per prima cosa ruotare le viti del microazionamento in senso antiorario fino alla posizione più bassa. Quindi montare saldamente il microazionamento su un morsetto che consentirà l'abbassamento delle punte degli elettrodi nella soluzione di placcatura in oro. Riempire una torre di delrin con una soluzione d'oro CCO e l'altra con acqua distillata e abbassare le punte degli elettrodi nella soluzione d'oro.

Quindi, apri il programma Nano Z e fai clic su Elettroplacca CC. Imposta la modalità in modo che corrisponda alle impedenze, la corrente di placcatura a 1,0 microampere negativi e il target a 350 kiloohm a 1004 hertz. Quindi impostalo in modo che venga eseguito cinque volte a intervalli di cinque secondi con una pausa di due secondi tra ogni corsa.

Una volta impostato il programma, fare clic su piastra automatica, il programma leggerà prima l'impedenza di ciascun canale. Quindi applicare la corrente specificata a quel canale, ripetere il test dell'impedenza e applicare la corrente secondo necessità fino a raggiungere l'impedenza target o un valore inferiore. Se l'impedenza scende al di sotto di 100 kilo ohm, invertire la polarità della corrente a 1,0 microampere positivi per rimuovere le particelle d'oro in eccesso e quindi ripetere la galvanica I valori tipici dell'impedenza finale su un fascio di quattro fili da 12,5 micrometri vanno da 150 a 325 kiloohm.

Una volta che tutti i canali sono stati placcati a un livello di impedenza accettabile, chiudere il programma Nano Z e scollegare il dispositivo. Quindi sollevare gli elettrodi dalla soluzione di placcatura e abbassare le punte nella torre di delrin di acqua distillata per risciacquare le particelle d'oro in eccesso Registrazioni neurali rappresentative utilizzando il microdrive per misurare i potenziali di campo locale dal topo. Gli ulu dorsali sono mostrati qui.

I quattro canali mostrati nella parte A sono un esempio di segnale scarsamente messo a terra che si traduce in valori saturi e segnali estremamente rumorosi. I quattro canali mostrati nella parte B, tuttavia, sono un buon esempio di segnale ben messo a terra con oscillazioni di rete chiaramente visibili nell'intervallo theta da quattro a 12 hertz. A sinistra c'è un esempio di una registrazione di Tero scadente.

Poiché i quattro fili degli elettrodi hanno registrato forme d'onda spike sostanzialmente identiche, oltre un migliaio di singole forme d'onda spike sono state sovrapposte l'una sull'altra per ogni canale del teros. Questo modello era probabilmente dovuto alla fusione dei fili durante la fase di fusione dell'isolamento della fabbricazione del tero, facendo sì che il fascio di fili agisse efficacemente come un singolo elettrodo di registrazione. A destra c'è un esempio di una buona registrazione tetro che mostra forme d'onda spike sovrapposte da un'unità putativa con diverse ampiezze attraverso i quattro fili tede.

Questo tipo di modello di registrazione dei picchi consente una migliore discriminazione delle unità durante il successivo clustering e separazione offline. Dopo aver costruito questa micro immersione, è importante testare ciascuno dei canali degli elettrodi e assicurarsi che rientrino in un intervallo di impedenza adeguato prima di passare all'intervento chirurgico di impianto. Dopo aver visto questo video, dovresti sentirti a tuo agio nella costruzione di teros e micro elettrodi per l'impianto cronico nel topo.

Buona fortuna a costruire le tue unità e divertiti con i tuoi esperimenti.