Name: Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Impara a preparare l'epitelio vestibolare semi-intatto del topo per studiare le cellule ciliate con elettrofisiologia e microscopia a due fotoni. Questo metodo consente analisi in condizioni fisiologiche.

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Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito da un Garnett Passe e Rodney Williams Memorial Foundation sovvenzione di progetto a R. Lim e AJ Campo.

1. Animali <ol><li> I topi sono stati ottenuti dal Centro di roditore australiano (ARC, Perth, Australia) e ha tenuto presso l&#39;Università di Sydney Bosch Animal Facility su un normale ciclo luce / buio di 12 ore con l&#39;arricchimento ambientale. Tutti gli esperimenti descritti sono stati approvati dalla University of Sydney Comitato etico degli animali. </li><li> Topi maschi e femmine (C57/BL6) sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti da questo ceppo sono comunemente utilizzati come sfondo per la manipolazione genetica, e può essere considerato equivalente al tipo selvatico 8-9. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto <ol><li> Preparare 300 ml di glicerolo un fluido cerebrospinale artificiale basata (ACSF) costituito (in mM): 26 NaHCO3, 11 glucosio, glicerolo 250, 2.5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1.2 MgCl2 e 2,5 CaCl 2. Prima dell&#39;aggiunta di CaCl 2, la soluzione con gas carbogeno (95% O 2 e 5% CO 2) per stabilire apH di 7.4 e di evitare la precipitazione di calcio (nuvolosità). Congelare la soluzione in un congelatore -80 ° C per 45 minuti in modo che l&#39;impasto ghiaccio si forma. </li><li> Profondamente anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg) (Parnell, Alessandria d&#39;Egitto, Australia) tramite una iniezione intra-peritoneale. </li><li> Una volta arti posteriori riflessi di presa sono topi decapitare assenti utilizzando taglienti forbici in acciaio inox e fare una incisione cutanea sagittale con una lama di rasoio (arrotondato # 22) per esporre il cranio. A questo punto e in tutta passaggi 2,3-2,8 volta cranica, cervello e apparato vestibolare sottostante deve essere il più fresco possibile mediante l&#39;applicazione regolare di ghiaccio-freddo ACSF sopra il tessuto. </li><li> Utilizzando il braccio a punta di forbici stile internazionale (FST, North Vancouver, Canada) fare una piccola incisione nel cranio a Lambda e tagliare lungo la sutura sagittale. Verificare che il cervello non è &quot;trascinato&quot; dalla lama di taglio durante questa fase. </li><li> Rimuovere con cautela le ossa parietali di distanza lateralmente e l&#39;osso occipitale posterorly utilizzando superficiale curva Pearson rongeurs (FST). </li><li> Una piccola spatola inox viene quindi utilizzato per sollevare delicatamente il cervello dalla superficie della fossa cranica media e posteriore, e il nervo vestibulocochlea esposta (CNVIII) tagliato a metà tra l&#39;orecchio interno e il tronco cerebrale con un paio di forbici iris multa. Tagliare questo nervo riduce al minimo la tensione indebita assoni delle afferenze primarie e le loro connessioni con le cellule dei capelli. </li><li> In seguito a resezione del CN VIII del cervello viene rimossa in toto. </li><li> Il labirinto vestibolare è ora chiaramente visibile nella fossa cranica media, con la coclea di puntamento anteromedialmente. Rongeur lati del labirinto vestibolare prima asportare delicatamente afferrando il canale semicircolare anteriore e tirando lateralmente. </li><li> Immergere i labirinti espunto (figura 1) in un piatto dissezione contenente il ghiaccio-freddo, ACSF continuamente gasati descritto nel paragrafo 2.1. Allo stereomicroscopio, tenere premuto il labirinto dila base del piatto afferrando la coclea. Utilizzare una pinza sottile a graffiare via alla osso sovrastante il canale semicircolare anteriore ampolla. Una volta che un piccolo foro nell&#39;osso è raggiunto iniziare a premere l&#39;osso dal ampolla. Si deve usare cautela per non spingere la pinza attraverso l&#39;osso come questo può danneggiare il labirinto membranoso sottostante ed epitelio sensoriale. Continuare questa procedura fino a quando sia l&#39;anteriore e condotti membranosi semicircolari orizzontali adiacenti e ampolle sono esposti (Figura 2). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Figura 1. L&#39;isolato mouse labirinto vestibolare. A. Pannello di sinistra) Rappresentazione schematica del isolato mouse labirinto vestibolare. Importanti punti di riferimento per l&#39;accesso dell&#39;epitelio sensoriale vestibolare, la coclea, anteriore e orizzontale canali semicircolari sono labeLED. Gli asterischi indicano l&#39;ampolla canale semicircolare contenente l&#39;epitelio sensoriale vestibolare. B. Destra del pannello) Microfotografia del isolato labirinto vestibolare da un 1-mese-vecchio mouse. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;esposizione del labirinto vestibolare membranosa. L&#39;osso sovrastante le ampolle canale semicircolare anteriore e orizzontali sono stati graffiato via per rivelare il nero / marrone maculato di ampolle membranosa e nervi ampollari associati (CNVIII). Lo schema nel pannello inferiore rappresenta le strutture nella regione evidenziata della microfotografia e mostra il rapporto dei condotti canali semicircolari al ampolle e CNVIII. <ol start="10"><li> Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente le ampolle e associati utricle lontano dal labirinto osseo, assicurando che la regione centrale del ampolle (contara zione l&#39;epitelio sensoriale) non sia danneggiata. In alcuni casi può essere necessario tagliare con le forbici iris per rilasciare le ampolle dall&#39;osso parte prossimale del condotto membranoso semicircolare. </li><li> Trasferire la triade contenente le due ampolle e utricle in una capsula di Petri riempite con L-15 di coltura di Leibovitz (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Utilizzare una fibra ottica di &quot;retroilluminazione&quot; il tessuto. Questo permette chiara visualizzazione del crista contenente l&#39;epitelio sensoriale all&#39;interno del ampolle. </li><li> Fare attenzione un&#39;incisione nella maculato &quot;tetto&quot; del otricolo con le belle forbici iris. Continuare questa incisione attraverso il tetto del anteriore e poi le ampolle orizzontale. Effettuare l&#39;incisione più vicino al bordo dell&#39;epitelio sensoriale possibile senza contatto (Figura 3A). Assicurarsi che non ci siano pezzi di membrana sovrastante l&#39;epitelio sensoriale (Figura 3B) </li><li> Trasferire il isolata semi preparazione intatto per un piccolo bicchieres camera di registrazione a fondo pieno di L-15 media. Appesantire la preparazione con una griglia di fibre di nylon sottili depositati ad un filo di platino a forma di U appiattita (Figura 3B). Idealmente, le fibre della griglia non devono sovrapporsi dell&#39;epitelio sensoriale, tuttavia in alcuni casi in cui è richiesta una maggiore stabilità, una singola fibra sezionando dell&#39;epitelio sensoriale forse preferito. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Figura 3. L&#39;isolato preparazione semi-intatta del epitelio sensoriale. A. Rappresentazione schematica vestibolare della preparazione semi-intatto e configurazione degli elettrodi. L&#39;ampolla sovrastante la cresta è stato &quot;de-tetto&quot; per esporre la superficie dell&#39;epitelio sensoriale (verde). B. Microfotografia del semi-intatte preparazione &#39;triade&#39; che mostra la parte anteriore (AC) e orizzontale (hc) Crista (utricle oscurato esserecerva ac). Notare la fibra di nylon utilizzato per fissare la preparazione alla base della camera di registrazione. Barra della scala:. 100 micron C. Un elettrodo di registrazione posizionata su una singola cella capelli vestibolare. Barra della scala: 15 micron. 3. Elettrofisiologia <ol><li> Profumato alla preparazione semi-intatte con continuamente ossigenato L-15. Il supporto contiene un indicatore di pH (rosso fenolo) e il colore del mezzo devono essere monitorate per le registrazioni. Il pH di ossigeno dovrebbe essere 7,3-7,4 e corrispondere a un colore rosso. </li><li> Preparare la registrazione pipette da 1,5 millimetri (1.19 mm ID) in vetro borosilicato utilizzando un protocollo a due fasi (fase di calore 1: 72, e passo di calore 2: 50) su una micropipetta estrattore (Narishige, Giappone, modello PP-830) per ottenere una impedenza finale di 3-4 MW. </li><li> Riempire il gambo della pipetta con 3-4 mm di soluzione interna a base di fluoruro di potassio contenente (in mM) KF 110, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1.8 MgCl2,3 D-glucosio e 2 Na-ATP, pH 7,4 con KOH. </li><li> Avvolgere il gambo della pipetta 2-3 volte e più in basso alla punta possibile con una sottile striscia di parafilm per isolare l&#39;elettrodo e ridurre pipetta capacitanza. </li><li> Posizionare la pipetta sopra l&#39;epitelio sensoriale sotto ingrandimento a bassa potenza (5X) su un microscopio in posizione verticale (Olympus BX51). Passare a elevata potenza (40X) e visualizzare le cellule ciliate vestibolari individuali con una fotocamera collegata CCD. </li><li> Posizione pipetta sulla membrana di una cellula capelli visualizzate (Figura 3C) utilizzando un micromanipolatore (Sutter Instruments, California, USA). Una volta che una guarnizione gigaohm è raggiunto, la rottura della membrana cellulare con una piccola quantità di pressione negativa applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto pipetta. </li><li> Effettuare registrazioni clamp di tensione a cellula intera utilizzando tecniche standard di 8-9. </li></ol> 4. Microscopia a due fotoni <ol><li> Preparare una soluzione salina allo 0,9% contenente 5 mM Oregon Verde488 BAPTA-1 (OGB-1; sale hexapotassium, Invitrogen, Germania). </li><li> Mentre ancora sommerso, posizionare la &quot;de-tetto&quot; preparazione triade semi-intatto su un piccolo pezzo di carta da filtro (4x4 mm, 0,8 micron di spessore; Millipore, Germania) garantendo che l&#39;epitelio sensoriale è ostruita da sopra. </li><li> Trasferire la carta da filtro e preparazione sulla base di soluzione salina coperta elettrodo di platino (7 ml) di un electroporator costituito dalla combinazione di un generatore di impulsi e un amplificatore a larga banda, e coprire con un ulteriore 5 pl di soluzione 5 mM di calcio sintetici colorante indicatore Oregon verde 488 Bapta-1 (figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> Figura 4. Elettroporazione Bulk. A. schematica che mostra sezione trasversale di configurazione elettroporazione. La preparazione semi-intatta (*) è collocato su un pezzo di carta da filtro immersa in dy calcioe (Oregon verde 488 Bapta-1) e la corrente applicata tra due elettrodi di platino. Adattato da Briggman e Euler, 2011 10. <ol start="4"><li> Portare la parte superiore platino elettrodo parallelo con l&#39;elettrodo di base ad una distanza di circa 2 mm, facendo attenzione a non disturbare l&#39;orientamento della preparazione, quando il contatto con il verde 488 BAPTA-1 soluzione di Oregon è fatto. </li><li> Passare un breve impulso di corrente in tutta la preparazione (Parametri per la corrente; +13 V, 10 msec larghezza di impulso, 1 Hz, 10 impulsi a onda quadra) 10-11. </li><li> Sul fondo di una camera di registrazione fondo di vetro riempita con L-15, posizionare una goccia di olio siliconico e posizionare la preparazione semi-intatte su di esso, assicurando che il nuovo epitelio sensoriale è ostruita da sopra. Per assicurare la stabilità durante l&#39;imaging, sostituire la griglia di nylon sopra la preparazione come descritto sopra (vedi punto 2.13). </li><li> Utilizzando il microscopio a due fotoni effettuare registrazioni ottiche di spontaattività calcio nea nell&#39;epitelio sensoriale (figura 7) utilizzando protocolli di imaging standard 10-11. </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

I meccanismi alla base il nostro senso di equilibrio hanno ricevuto scarsa attenzione rispetto ad altri sistemi sensoriali, ad esempio, i sistemi visivi e uditivi. Tra gli studi che hanno indagato i cambiamenti nella funzione vestibolare o di equilibrio, la maggior parte sono concentrati su misure comportamentali tra cui il riflesso vestibolo-oculare, con una conoscenza incompleta degli elementi costitutivi fondamentali del-la bilancia cellule ciliate vestibolari stesse. Quegli studi che si sono concentrati sul...

Nonostante il significativo contributo del sistema vestibolare per la nostra vita di tutti i giorni, una chiara comprensione dei processi responsabili del declino osservato in funzione vestibolare con l&#39;età rimane elusiva. Uno dei motivi di questa mancanza di conoscenza è che il declino della funzione vestibolare è quasi esclusivamente stata esplorata mediante saggi comportamentali, tra cui il riflesso vestibolo-oculare (VOR), un indicatore preciso della funzione vestibolare estrinseca, ma offre spunti limitati nei cambi di componenti intrinseche . Questo è uno dei principali ostacoli per la nostra comprensione della funzione delle cellule dei capelli vestibolare in salute, la malattia, o l&#39;invecchiamento. Mentre ci sono stati molti studi di cellule ciliate vestibolari singole, una grave lacuna è stata il ricorso a preparazioni di cellule dei capelli acuti, dove le cellule dei capelli e dei terminali afferenti anche calice vengono rimossi dal loro ambiente normale mediante trattamento meccanico e / o enzimatica. Approcci come inevitaBly disturbare il delicato microarchitettura tra cellule dei capelli e calice, e capelli cellula e cellula di supporto. Con lo sviluppo di preparati semi-intatte 1-5, e un isolato mouse preparazione labirinto 6, ora vi è la possibilità di studiare le varie forme di comunicazione sinaptica in condizioni che avvicinano maggiormente a quelle in vivo. Infatti, (2011) Lim et al. Ha mostrato notevoli differenze nelle correnti cellule intere registrati da tipo acuto isolato I cellule ciliate vestibolari rispetto a quelli che sono rimasti inseriti all&#39;interno del neuroepitelio. Specificamente, potassio è pensato ad accumularsi nello spazio intercellulare, tra la cella capelli e calice afferente, e modifica significativamente capelli risposta cellulare 7. Questo tipo di informazioni sarebbe impossibile da ottenere senza la preparazione semi-intatte dell&#39;epitelio sensoriale vestibolare qui descritto. Dimostriamo la preparazione semi-intatto del mouse crista 3, E mostrare i risultati rappresentativi ottenuti da cellule intere di patch elettrofisiologia e di imaging di calcio a due fotoni.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Leibovitz medium L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon green</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 SF Pinza</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici modello standard</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH Convertitore A-D</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Micromanipolatore</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>amplificatore multiclamp</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati (elettrofisiologia)</td><td>Axografo</td><td>N/A Imspector</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati (due fotoni)</td><td>Max Planck innovation</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

un isolato semi-intatte preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Comprendere le cellule ciliate vestibolari funzionano in condizioni normali, o come un trauma, malattia, invecchiamento e interrompere questa funzione è un passo fondamentale per lo sviluppo di approcci di prevenzione e / o di nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, la maggior parte degli studi che stanno visualizzando funzione vestibolare anormale non sono stati a livello cellulare, ma si è concentrata principalmente sulle analisi comportamentali della disfunzione vestibolare, come le analisi del cammino e le prestazioni riflesso vestibolo-oculare. Anche se questo lavoro ha prodotto dati importanti su ciò che accade quando le cose vanno male, poca informazione viene estratta per quanto riguarda le cause di disfunzione. Tra gli studi che si concentrano sui processi cellulari e sub-cellulari che sono alla base la funzione vestibolare, la maggior parte hanno fatto affidamento su cellule ciliate acutamente isolati, privi delle loro connessioni sinaptiche e l&#39;ambiente delle cellule di sostegno. Pertanto, una sfida tecnica è stata accesso alle cellule ciliate vestibolari squisitamente sensibili in un prepparazione che è meno perturbato, fisiologicamente. Qui mostriamo una preparazione semi-intatto del mouse vestibolare epitelio sensoriale che mantiene il micro-ambiente locale tra cui cellule capelli / complessi afferenti primari.

Le proprietà elettrofisiologiche di cellule cigliate vestibolari sono dipendenti dalla microarchitettura complesso entro cui sono inserite 7. Figura 5 mostra che il semi-intatte preparazione epitelio vestibolare può essere utilizzata per distinguere tra cellule pilifere tipo I (Figura 5A), cellule hair tipo II (Figura 5B), e il calice primario afferente (Figura 5C) sulla base di caratteristiche conduttanze cellula intera. Queste caratteristic...

Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all&#39;interno della parte più dura del cranio, l&#39;osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una preparazione quasi normale dell'epitelio sensoriale vestibolare del mouse, che può essere utilizzata per studiare i processi cellulari e subcellulari fondamentali dei recettori ciliati vestibolari. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando il labirinto vestibolare osseo dalla volta cranica. Il secondo passaggio consiste nel graffiare con cura il labirinto osseo utilizzando pinzette fini, per esporre il labirinto membranoso sottostante, prima di rimuoverlo completamente dal suo involucro osseo.Successivamente, l'epitelio sensoriale vestibolare viene esposto recidendo la membrana sovrastante mediante forbici da iride fini. L'ultimo passaggio consiste nel montare il preparato di epitelio sensoriale semi-integro su una camera con fondo in vetro e nel stabilizzarlo con una rete di nylon pesata. Infine, vengono utilizzate rispettivamente la tecnica del patch clamp per l'elettrofisiologia e la microscopia a due fotoni per caratterizzare le proprietà intrinseche della membrana e il profilo di segnalazione del calcio di ciascun tipo di cellula ciliata vestibolare e/o di neurone primario.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, inclusa la preparazione di cellule ciliate isolate, consistono nella capacità di mantenere l'organizzazione delle cellule ciliate e dei loro neuroni afferenti primari in condizioni il più possibile vicine a quelle normali. Ciò significa che possiamo effettuare misurazioni in condizioni prossime a quelle fisiologiche e possiamo eseguire tali misurazioni simultaneamente. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché la dissezione è molto difficile da apprendere, principalmente perché l'apparato vestibolare è racchiuso in profondità all'interno dell'osso temporale del cranio e perché l'epitelio sensoriale stesso è molto piccolo e facilmente danneggiabile durante la dissezione.Stefano DeMarco, un collega che lavora con il mio laboratorio, dimostrerà le procedure di elettroporazione e di due fotoni. Dopo aver anestetizzato profondamente e decapitato un topo C57BL/6 secondo le linee guida istituzionali e governative locali ed esposto il cranio, effettuare una piccola incisione nel cranio a livello del Lambda e tagliare lungo la sutura sagittale. Assicurarsi che il cervello non venga trascinato dalla lama di taglio.Durante questo passaggio, applicare un liquido cefalorachidiano (CSF) ghiacciato sul cervello per raffreddare il tessuto, quindi rimuovere con attenzione le ossa parietali lateralmente e l'osso occipitale posteriormente utilizzando pinze Pearson a curvatura leggera; nuovamente, applicare CSF ghiacciato. Successivamente, utilizzare una piccola spatola in acciaio inossidabile per sollevare delicatamente il cervello dalla superficie delle fosse craniche mediale e posteriore. Il labirinto vestibolare è ora chiaramente visibile nella fossa cranica media, con la coclea rivolta in avanti.Aggiungere medialmente A CSF ghiacciato da entrambi i lati del labirinto vestibolare. Quindi escindere delicatamente il labirinto vestibolare afferrando il canale semicircolare anteriore e tirando lateralmente. Immergere i labirinti escissi in una capsula di Petri contenente soluzione ghiacciata.Continuare a saturare con gas un LCS posizionato sotto un microscopio stereoscopico. Questo diagramma mostra in dettaglio il labirinto escisso. Successivamente, operando sotto il microscopio stereoscopico, afferrare la coclea con pinzette fini e tenere il labirinto contro il fondo della piastra.Utilizzare una seconda pinzetta per raschiare l'osso sovrastante l'ampolla del canale semicircolare anteriore. Una volta ottenuto un piccolo foro nell'osso, iniziare a rimuovere delicatamente l'osso dall'ampolla. Prestare attenzione a non spingere la pinzetta attraverso l'osso, poiché ciò potrebbe danneggiare il labirinto membranoso sottostante e l'epitelio sensoriale.Continuare questa procedura fino a quando entrambe le membrane semicircolari orizzontali anteriore e adiacente, i dotti e il pul sono esposti come mostrato qui. Ora, utilizzando pinzette fini, sollevare delicatamente il pul e l'utricolo associato dal labirinto osseo, assicurandosi che la regione centrale del puli contenente l'epitelio sensoriale non venga danneggiata. Trasferire il triade contenente i due pule e l'utricolo in una piastra di Petri riempita con mezzo di coltura Lebovitz's L 15.Utilizzare una fibra ottica per illuminare in trasparenza il tessuto, in modo da visualizzare chiaramente la cresta contenente l'epitelio sensoriale all'interno del bulbo. A questo punto, utilizzare il forbicino da iride per effettuare con attenzione un'incisione sul tetto punteggiato dell'ampolla. Eseguire l'incisione il più vicino possibile al margine dell'epitelio sensoriale senza toccarlo.Come mostrato qui, assicurarsi che non ci siano frammenti di membrana sovrapposti all'epitelio sensoriale. Questo schema mostra la forma della preparazione finale e il posizionamento dell'elettrodo di registrazione. Trasferire la preparazione isolata semi-integra in una piccola camera di registrazione con fondo in vetro riempita con mezzo L 15, fissando la preparazione mediante una griglia di sottili fibre di nylon ancorate a un filo di platino piegato a forma di U appiattito. Il tessuto è ora pronto per le registrazioni elettrofisiologiche.Perfondere il preparato semi-integro con mezzo L 15 continuamente ossigenato. Assicurarsi che il mezzo rimanga rosso per indicare un pH in presenza di ossigeno compreso tra 7,3 e 7,4. Durante tutta la procedura, preparare le pipette di registrazione partendo da capillari con diametro esterno di 1,5 millimetri e diametro interno di 1,19 millimetri.Prelevare vetro silicato utilizzando un protocollo in due fasi su un estrattore di micropipette per ottenere un'impedenza finale di tre-quattro megaohm. Riempire il gambo della pipetta con tre-quattro millimetri di soluzione interna a base di fluoruro di potassio. Quindi avvolgere il gambo della pipetta due o tre volte, fino a raggiungere la punta il più possibile, con una sottile striscia di paraffina per isolare l'elettrodo e ridurre la capacità della pipetta.Posizionare la pipetta sopra l'epitelio sensoriale a basso ingrandimento (5x) su un microscopio verticale. Passare a un ingrandimento maggiore (40x) e visualizzare le singole cellule ciliate vestibolari mediante una telecamera CCD collegata. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare la pipetta sulla membrana di una cellula ciliata visibile.Una volta ottenuta una sigillatura gigaohm, rompere la membrana cellulare applicando una piccola quantità di pressione negativa attraverso un orifizio di aspirazione sul supporto della pipetta ed effettuare registrazioni in voltage clamp su cellula intera utilizzando tecniche standard per la microscopia a due fotoni. Mantenere parzialmente intatta la fase di de-roofing. Immergere il preparato e trasferirlo su un piccolo pezzo di carta filtrante.Assicurarsi che l'epitelio sensoriale sia libero da ostruzioni superiori. Posizionare il filtro di carta e il preparato sull'elettrodo di platino di base ricoperto di soluzione salina di un elettroporatore. Portare l'elettrodo superiore di platino parallelo all'elettrodo di base e a una distanza di circa due millimetri, avendo cura di non alterare l'orientamento del preparato.Quando si entra in contatto con il bafta Oregon Green 488, si ottiene una soluzione come mostrato in questa immagine. Applicare un breve impulso di corrente attraverso il preparato. Posizionare una piccola goccia di olio di silicone sul fondo di una camera di registrazione con fondo in vetro riempita con mezzo L-15.Quindi posizionare nuovamente il preparato semi-integro su di esso, assicurandosi che l'epitelio sensoriale sia libero da ostruzioni dalla parte superiore. Per garantire stabilità durante l'acquisizione delle immagini, riposizionare la griglia di nylon sopra il preparato. Successivamente, utilizzando il microscopio a due fotoni, effettuare registrazioni ottiche dell'attività spontanea del calcio nell'epitelio sensoriale seguendo protocolli standard di acquisizione immagini.Questa immagine mostra le correnti cellulari totali registrate da una cellula ciliata vestibolare di tipo uno, caratterizzata da correnti di coda ampie e decrescenti, indicate dalla freccia qui. Le correnti cellulari totali sono state registrate da una cellula ciliata vestibolare di tipo due. Si noti l'assenza di correnti di coda.Questa immagine mostra la registrazione da cellula intera di un afferente primario a calice caratterizzato da correnti transitorie mediate dal sodio, come indicato dalla freccia a seguito della depolarizzazione da un potenziale di riposo negativo di meno 120 millivolt. Tutte le cellule sono state mantenute a meno 60 millivolt. Questa figura mostra le relazioni corrente-tensione per cellule ciliate di tipo due registrate da topi giovani e più anziani in risposta a durate crescenti di depolarizzazione.Questi istogrammi mostrano la conduttanza media e un rapporto di attivazione delle cellule ciliate di tipo due in topi giovani e anziani, basati sulle curve IV di 100 millisecondi. Queste microfotografie a due fotoni mostrano l'attivazione del calcio con BAFTA-1 Oregon Green in risposta a L-15 PERFU otto nel pannello superiore o a L-15 contenente cloruro di potassio 100 millimolare nel pannello inferiore. Le frecce indicano la stessa singola cellula ciliata prima e dopo l'aggiunta di cloruro di potassio.Questo grafico mostra il profilo di fluorescenza del calcio della singola cellula indicata dalla freccia nell'immagine precedente. Questa microfotografia a due fotoni dell'epitelio sensoriale mostra il caricamento di Oregon Green 488 BAPTA-1 in singole cellule ciliate. L'inserto mostra la localizzazione subcellulare del calcio nel citoplasma della cellula ciliata di tipo I, indicata dalla freccia, o nella calotta afferente primaria che circonda una cellula ciliata di tipo I, indicata dalle doppie frecce.Una volta padroneggiata, la dissezione può richiedere meno di 10 minuti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare l'epitelio sensoriale vestibolare, di come mantenerlo integro e di come preservarne la vitalità per registrazioni elettrofisiologiche e per l'imaging del calcio a due fotoni.

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