Name: Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Scopri come misurare l'adesione assonale ai substrati con sensibilità piconewton usando la spettroscopia di forza e laser UV. Questo metodo permette di valutare il rilascio di tensione post-lesione assonale in tempo reale.

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Alberto Guiggiani per lo sviluppo del sistema di controllo in tempo reale, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima per penetranti discussioni, Giacomo Pruzzo e Alessandro Parodi per lo sviluppo di elettronica custom e software, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni per la loro consulenza e assistenza nella preparazione della coltura cellulare esperto.

1. Setup Optical L&#39;intero sistema ottico è stato descritto in precedenza 15. Brevemente, il sistema di pinzette ottiche è basato su un onda continua itterbio (CW) fibra laser operante a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulatore spaziale di luce (SLM) (LCOS-SLM, modello X10468-07 - Hamamatsu) varia la fase del fascio laser in ingresso IR per controllare la posizione del punto di messa a fuoco trapping sul piatto di coltura da Computer ologrammi generati. I Blu-pinzette software (collegamento web sul tavolo attrezzature) ologrammi generati liberamente disponibili proiettate sul modulatore spaziale di luce. L&#39;interferometro per misure di spettroscopia di forza era basata su un fotodiodo a quattro quadranti (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) ed un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs). La fonte dissezione laser pulsato è stato un sub-nanosecondo UV Nd: YAG laser a 355 nm (PNV-001.525-040, POWERCHIP nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acustico-modulatore ottico (MQ110-A3-UV, 355 nm silice fusa-AA-opto-elettronico) controllava la potenza del laser UV consegnato al campione. L&#39;ottica olografica pinzette laser e micro dissettore stati integrati su un microscopio verticale modificato (BX51 - Olympus) dotata di un 60X, 0,9 NA acqua immergendo objective.The fase del microscopio è composto da un motore 3-asse lineare DC micro-posizionamento sistema (M-126.CG1, Fisica-Instruments) che porta un piezoelettrico fase nano-posizionamento a 3 assi separati (P-733.3DD, Fisica-Instruments) per combinare il movimento grossolana del campione con la risoluzione sub-nanometrica della piezo- stadio. Il sistema del microscopio è stato dotato di due circuiti di controllo che agisce sinergicamente per mantenere il punto fuoco intrappolamento nella posizione giusta, a seconda della modalità di funzionamento selezionata (posizione o forza di serraggio, statica o dinamica) 16. In particolare, un circuito di retroazione interna agisce su un palco piezoelettrico, per mantenere il tallone in una selectndr distanza dal centro trappola. L&#39;altro circuito esterno controlla la posizione del portaoggetti motorizzato di sfruttare la regione attraversato dal piezoattuatore su un&#39;area maggiore della sua corsa 17 disponibili. Quando il piezo stadi, raggiunge il limite della corsa disponibile in una direzione, il loop esterno sposta il micro percorso nella direzione opposta, così il piezo recupera verso la sua posizione centrale perché sta rilevando la perlina intrappolato aderito al campione. Quando il piezo-stadio raggiunge la posizione centrale della sua gamma naturalmente, il micro fase interrotta. Ulteriori dettagli del sistema sono riportati in Guiggiani et al 16,17. Un dispositivo Peltier (QE1 riscaldamento resistivo con TC-344B del riscaldatore a doppio canale - Warner Instruments) controlla la temperatura della coltura cellulare al microscopio (37 ° C). Nella cultura, pH e umidità sono stati mantenuti in condizioni fisiologiche per aerare un polidimetil custom-designedsilossano (PDMS) manicotto (integrando l&#39;obiettivo microscopio) con CARBOGEN umidificata (95% O 2, 5% di CO 2). 2. Cell Culture Preparazione Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano. Colture primarie sono state ottenute da ippocampo di topi (C57BL6J, Charles River) giorno embrionale 18 (E18). <ol><li> I neuroni sono state piastrate ad una concentrazione di 25.000 cellule / ml su fondo di vetro Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). La bassa concentrazione di cellule in coltura è necessaria per evitare la formazione di una fitta rete già nei primi giorni in vitro. Alla concentrazione cellulare menzionato, la probabilità di trovare cellule isolate con un neurite più lungo non collegato ad altre cellule è molto più alta. </li></ol> 3. Rivestimento Bead <ol><li> Polymer microsfere (Ø 4 micron, COOH-terminato-Bangs Laboratories, codice prodotto PC05N/6700) sono stati rivestiti con poli-D-lisina seguendo la procedura descritta nel Polylink Protein Coupling Kit (Polysciences, codice prodotto 19539). Le perle sono rivestite con la stessa molecola utilizzata per coprire il supporto e la coltura favore cellule adesione. </li></ol> 4. Scegli isolato Neuron. Staccare un tallone dalla cultura substrato, Trappola e spostarlo Accanto al Neuron <ol><li> Mettere il piatto cultura Petri sul palco microscopio. Dopo aver impostato la messa a fuoco sul campione di moto fase, correggere la posizione del illuminante obiettivo condensatore per impostare Kohler-illuminazione. Allineamento delle ottiche di illuminazione per impostare la condizione Kolher-illuminazione è necessaria per migliorare la qualità delle immagini luminose campo. Utilizzando tali condizioni di allineamento, è anche necessario per massimizzare l&#39;efficienza di raccolta del laser IR (tramite condensatore oggettivo), dalla dispersione sonda intrappolato, effettuare il tracciamento interferometrica dal QPD e PD. </li><li> Pipettare pochi microlitri della soluzione patinati microsfere inal piatto cultura. Microsfere depositerà e di aderire al substrato della cultura. Il numero di microlitri iniettato nel piatto cultura dipende dalla concentrazione microsfere della soluzione di riserva. La condizione ideale è avere tra uno e due microsfere per campo dell&#39;imaging di vista. Quando troppi microsfere vengono aggiunti al piatto di coltura, possono già attaccare caso ai neuroni coltivati. </li><li> Muoversi nel piatto cultura, alla ricerca di un neurone isolato con una neurite più lungo (l&#39;assone), e salvare la posizione del palco microscopio. </li><li> Muoversi e cercare una perlina aderito al sostegno della cultura. </li><li> Accendere il laser a infrarossi cattura. In questa fase, non ologrammi vengono proiettate su SLM, e la posizione del punto laser IR coincide con la posizione spot laser UV. Impostare la posizione assiale dello spot IR 2-3 micron sopra la superficie di supporto cultura, dal movimento del microscopio. </li><li> Impostare la potenza del laser UV consegnato al campione da meno di 1 μW. GliUV laser dissettore è stato precedentemente tarato 14: 5-6 μW il supporto di vetro viene ablata 4 μW una connessione neuronale è completamente sezionato 2,5 μW una neurite è parzialmente lesionati &lt;1 μW un&#39;onda d&#39;urto è prodotto nel piatto di coltura. L&#39;onda d&#39;urto ottico è abbastanza forte da staccare il tallone dal supporto di vetro. </li><li> Accendere il laser UV, lasciando il laser IR, e spostare il punto UV sopra il tallone aderito al movimento palco microscopio. Gli stacca tallone dalla superficie, ed è intrappolato dal laser IR. Quindi, spegnere il laser UV. </li><li> Spostare le intrappolati tallone diversi micrometri di sopra del supporto di vetro (20-30 micron). Sollevamento del tallone a questa posizione sarà impediva di contattare altre cellule mentre viene spostato verso il neurone precedentemente scelto. Portare il tallone nella posizione precedentemente salvata stadio. Impostare la velocità di fase a un valore basso (10 micron / sec), cosicché la forza di trascinamento del fluido non superi la trappola otticaforza ping. </li></ol> 5. Spostare la posizione Trappola rispetto al Dissector Spot Laser e Axon posizione da Computer Generated Hologram e calibrare il Optical pinzette Rigidità <ol><li> Spostare il tallone verso il supporto in vetro di visualizzare l&#39;assone. La sferetta è tenuta sopra la cella per evitare il contatto con essa (circa 5 micron sopra del supporto di vetro). </li><li> Spostare la fase di microscopio per spostare il punto attivo UV sul centro della larghezza del assone. Salvare la posizione attuale fase. </li><li> Spostare il focus posizione a pronti IR da ologramma generato al computer. In questa fase, la fase viene arrestato nella posizione scelta nel passaggio precedente. Quando il computer ologramma generato è proiettato sul SLM, il tallone intrappolata viene spostata rispetto alla assone. Abbiamo spostare il punto laser IR avere il tallone intrappolata allineato al centro del neurite, con il punto laser UV centrata sulla stessa neurite troppo. Lo spot IR e quindi il intrappolata tallone sono posizionati lungo i neuriti5-10 micron di distanza dal punto UV. Muoviamo la posizione del IR rispetto alla macchia UV in funzione della geometria neurite. Nel caso le pinzette ottiche non sono dotati di un sistema SLM, la posizione può essere variata specchi ribaltabili, o deflettori acustici ottiche, sul percorso ottico di IR. Il punto laser IR potrebbe essere posizionata 5-10 micron dalla macchia UV per evitare interazioni ottico del fascio dissezione con la sonda intrappolato, che potrebbe influenzare il moto browniano e alterare le tracce spettroscopia di forza. </li><li> Dopo aver definito la nuova posizione a pronti IR rispetto a macchia UV e posizione assone, spostare la fase di posizionare il tallone intrappolato dalla assone ed evitare collisioni con esso. Spostare la posizione assiale del tallone intrappolata di circa 2 micron sopra il vetro di copertura. </li><li> Allineare il QPD al centro le frange di interferenza su di esso: x e segnali differenziali y QPD sono zeri quando il QPD è centrato. Acquisire 5 secondi del moto browniano del tallone intrappolati dalla interferometrichemetro, a 50 KHz frequenza di campionamento. Avere la rigidità (pN / nm) e sensibilità (V / nm) della trappola ottica dal metodo spettro di potenza 18. </li></ol> 6. Fissare il tallone alla Axon. Eseguire assotomia e simultanea Misura della forza <ol><li> Sollevare la posizione tallone intrappolato circa 4 micron sopra il vetro di copertura, e spostarlo nella posizione di fase precedentemente salvata (vedi punto 3.2). </li><li> Spostare il tallone giù intrappolato verso l&#39;assone finché non tocca la neuriti. La collisione tra tallone intrappolati e l&#39;assone è controllata dal segnale QPD z rilevamento spostamento del tallone intrappolato nella direzione assiale. </li><li> Attendere 10 sec con il tallone intrappolata spinto contro l&#39;assone di favorire l&#39;adesione alla membrana neuriti. </li><li> Spostare il micro fase di spostare il tallone intrappolato dal assone, e quindi verificare la sua adesione alla membrana cellulare. Se il tallone aderito, sfugge dalla trappola ottica. </li><li> Spostare indietro la trappola laser sul tallone aderitoe attivare il ciclo forza-clamp con condizione forza pari a zero. In tal modo, i riposiziona piezo-fase del tallone, allegate alla cella, sul centro trappola ottica. Se il sistema non dispone di un controllo di retroazione, la posizione trappola laser può essere spostata dal palco microscopio per centrarlo sulla sonda aderito. Il centro della trappola è raggiunto quando i segnali QPD sono gli stessi quando il tallone è bloccata e non aderisce alla cella (x ed y segnali QPD pari a zero, e il segnale z QPD dà la stessa tensione somma dei quattro quadranti come quando il tallone è intrappolato lontano da qualsiasi superficie). </li><li> Impostare una condizione forza-clamp sull&#39;asse z, posizionando il laser trapping leggermente nel centro del tallone (circa 100 nm), per generare un precarico sul aderito sonda intrappolato. Nel caso il sistema non è dotato di un controllo di forza-clamp, la posizione trappola ottica può essere sollevato fino a passi di 25 nm dalla fase microscopio. Il segnale z QPD permette il monitoraggio. Pertanto, utilizzare thiil segnale s per impostare la posizione della trappola laser rispetto alla sonda aderito. Tale pre-tensionamento è necessario per rilevare la tensione sulla membrana dopo la lesione assonale, e la conseguente diminuzione del moto browniano della sonda aderito. Un approccio simile è stato proposto di misurare il rilascio di tensione in un tether membrana da immagini video 19. </li><li> Spegnere il ritorno di forza-clamp per misurare la forza sulla sonda aderito nella condizione di posizione-clamp (il piezo-stadio è bloccato). </li><li> Avviare la registrazione simultanea delle posizioni del tastatore intrappolate attraverso l&#39;interferometro (20 KHz frequenza di campionamento), e la cellula durante laser assotomia time-lapse imaging in campo chiaro (20 Hz frame rate). </li><li> Accendere il laser UV per fornire impulsi laser fino a una lesione diventa visibile sull&#39;immagine del l&#39;assone (solitamente 200-400 impulsi ottici sono necessari Energia per impulso: 25. NJ), quindi spegnere il laser UV. </li><li> Continuare la registrazione dal interferometro per circa 3 min, fino a quando la x, yez QPD tracce di raggiungere un plateau. </li></ol> 7. Quantificare il totale tensione di uscita <ol><li> Convertire le tracce QPD registrati (in Volt) per la sensibilità calibrata della trappola ottica, per ottenere le rispettive tracce in nanometri. </li><li> Filtrare il x, y, z e tracce di spostamento da un filtro passa alto con tagliato a 10 Hz. </li><li> Calcolare la varianza totale delle tracce filtrati rappresentano il moto browniano del tallone intrappolato. Calcola la varianza a 25 msec per le finestre di tempo di 500 msec (10.000 punti dati) 20 sovrapposte. L&#39;elevato filtraggio delle tracce passaggio esclude le variazioni del moto browniano a causa della fluttuazione della membrana o movimento actina corticale. Il moto browniano del tallone è ridotta dalle forze ottici e le forze di adesione sulla membrana cellulare. Quando la membrana è tesa a causa del rilascio di tensione sua viscosità è aumentata e quindi il moto browniano della perlina, rilevata immediatamente dopo assotomia, inizia a diminuire. </li><li> Definire t0: l&#39;inizio della diminuzione del moto browniano varianza, dopo la consegna di energia laser UV. L&#39;istante t0 tempo indica l&#39;inizio del ceppo membrana. </li><li> Definire t1: la fine della diminuzione del moto browniano varianza (quando raggiunge un plateau). L&#39;istante t1 tempo indica la fine del ceppo membrana. </li><li> Eseguire video tracking di detriti o un graffio sul supporto vetro di copertura, per misurare qualsiasi deriva del campione durante la misurazione della forza. Per tenere traccia della particella sul supporto di vetro, per prima cosa applicare soglie per le immagini in campo chiaro, per ottenere una pila di immagini binarie con la particella in bianco su sfondo nero. Poi, si traccia il centro particella di massa con una precisione sub-pixel (utilizzando il software freeware ImageJ). </li><li> Sottrarre la deriva misurato dalle tracce QPD spostamento. Moltiplicare le tracce QPD drift-corretti dai rispettivi rigidità ottico calibrato (k x, k <sub&gt; y, k z) per ottenere le Fx, Fy, Fz tracce in piconewtons. </li><li> Calcolare la traccia forza totale come F tot = √ (2 + Fx Fy Fz 2 + 2). </li><li> Calcola il rilascio totale di forza tra T0 e T1 come F rilasciato = F tot (t1) - F tot (T0). La forza misurata in t0 deve essere sottratto perché è dovuto allo spostamento della sonda dal centro trappola, quando aderisce al tallone neuriti. </li><li> Calcolare l&#39;area di contatto tra il tallone neuriti intrappolati e la posizione di punto laser UV: sulla misura di immagine in campo chiaro le lunghe (L) e corto (D) assi del neuriti intrappolato tra il tallone e la posizione di punto laser UV. L&#39;area di contatto assone assone è A = L x D. </li><li> Normalizzare il totale rilasciato dalla pubblicato forza F l&#39;area di contatto Un assone assone. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Riportiamo in questo lavoro un metodo quantitativo per confrontare l&#39;adesione al substrato neuriti cultura, effettuando la misurazione simultanea forza spettroscopia laser durante lesione cellulare indotta. Il rilascio della tensione misurata è correlato al grado di adesione della cellula al substrato: celle con un numero più elevato di adesioni focali dovrebbero rilasciare meno tensione. Misurando il rilascio di tensione in termini di piconewtons fornisce una grandezza fisica da cui calcolare la assonale adesione a...

Microscopia ottica è uno del sistema di imaging meno invasiva disposizione per osservare le cellule viventi. Con lo sfruttamento degli effetti, come la pressione di radiazione (come in pinzetta ottica 1), o flusso di fotoni ad alta energia (come nel laser dissettore 2), questa tecnologia è stata estesa a nano-manipolazione. Il sistema di imaging ottico fornisce un controllo preciso di visualizzare e manipolare gli obiettivi sub cellulari 3. Allo stesso tempo, grazie alla calibrazione accurata della potenza del laser consegnato, strumenti ottici realizzano sia la manipolazione del campione morbido o invasivi con riproducibilità senza precedenti. Diversi laboratori integrati, nello stesso setup sperimentale, pinzette ottiche e laser dissettore per ablazione organelli 4, a fondere 5 celle diverse, o per stimolare le cellule dai guidato otticamente carichi 6,7. Mentre pinzette ottiche, dopo la calibrazione della rigidezza ottica, consentonoil controllo della forza applicata alla cella su scala piconewton, sistemi dissezione laser può modulare manipolazione ottica, che varia da membrana foto-porazione all&#39;ablazione di singoli organelli o dissezione di strutture sub-cellulari. Tuttavia, calibratura dissezione laser si basa sulla valutazione qualitativa dell&#39;entità di manipolazione ottica rispetto alla energia fornita al campione, principalmente sulla base di analisi di immagini che illustra i cambiamenti morfologici dovuti al campione 8. Nel metodo presentato, dimostriamo come eseguire la misurazione spettroscopia di forza durante la dissezione laser assonale di un neurone sviluppo, quantificare, su scala piconewton, la forza prodotta da un equilibrio alterato nella struttura citoscheletro di un compartimento subcellulare 9. Neuroni coltivati ​​aderiscono al substrato, e polarizzano durante lo sviluppo. La fase di polarizzazione si verifica durante i primi cinque giorni in vitro. Alla seconda fase di polarizzazione, una delle estrusorizione neuriti diventa più lungo, e sarà differenziarsi per diventare l&#39;assone 10. Allungamento assonale in risposta alla forza di traino presso il cono di crescita è già stato modellato dal modello di Dennerl 11. Recentemente, questo modello è stato esteso da 12 a includere il ruolo di neuriti adesione ai substrati della matrice extracellulare. Questo modello biofisico, proposto dopo 13 osservazioni sperimentali, ha mostrato che tirando forze sul cono di crescita, si propaga lungo i neuriti, sono modulati da adesioni focali al substrato. Allo stesso modo, lesione assonale produce un rilascio locale di tensione propagare verso il corpo cellulare. Pertanto, abbiamo proposto che la misura tale tensione rilasciato in una posizione lungo l&#39;assone tra la lesione e la soma cellulare offre la possibilità di valutare l&#39;esito di smorzamento di adesioni focali inalterati. Calibriamo l&#39;energia necessaria fotone-flusso del laser dissettore per controllare l&#39;entità del damag assonale inflittoe, da completo transection a lesione parziale. Dopo la calibrazione, si è ripetuta lesione parziale ai assoni di diversi neuroni differenzianti e sviluppato il protocollo di quantificare il rilascio della tensione, e così ottenuto un parametro quantitativo per stimare l&#39;adesione del assone al substrato 14. Nel presente lavoro, si descrive in dettaglio il protocollo sviluppato, che rappresenta una precisa procedura sperimentale per valutare e confrontare con sensibilità piconewton assonale l&#39;adesione al substrato in diverse condizioni sperimentali come trattamento chimico 14, o diversi tipi di supporto di coltura cellulare.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Microsfere polimeriche, 4 &mu; m, COOH rivestito</td><td>Bangs laboratories</td><td>PC05N/6700</td><td></td></tr><tr><td>PolyLink Kit di accoppiamento proteico Polyscience</td><td></td><td>19539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Laser IR</td><td>IPG Laser GmbH</td><td>YLM-5-SC-LP</td><td>laser a fibra di itterbio (CW) funzionante a 1064 nm, con polarizzazione lineare</td></tr><tr><td>Modulatore di luce spaziale</td><td>Hamamatsu</td><td>LCOS-SLM 10468-07</td><td></td></tr><tr><td>Software per pinzette blu</td><td>Gruppo di ottica, Università di Glasgow</td><td>Software scaricabile gratuitamente</td><td><a href="http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/" target="_blank">http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/</a></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Hamamatsu</td><td>Software</td> <td>scaricabile gratuitamente<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/ </a></td></tr><tr><td>QPD</td><td>Thorlabs</td><td>S5980 con scheda C5460SPL 6041</td><td>Fotodiodo a quattro quadranti per misurare lo spostamento della sonda intrappolata x, y</td></tr><tr><td>PD</td><td>Teem Photonics</td><td>PDA100A-EC</td><td>Photodiode per misurare lo spostamento della sonda intrappolata z</td></tr><tr>laser<td>UV nano-Pulse</td><td>AA-optoelctronics</td><td>PNV-001525-040</td><td>Laser UVA pulsato, lunghezza dell'impulso 400 ps</td></tr><tr><td>Modulatore ottico acustico</td><td>Olympus</td><td>MQ110-A3-UV, 355nm silice</td><td></td>fusa</tr><tr><td>Microscopio verticale</td><td>Andor</td><td>BX51</td><td>Dotato di un obiettivo a immersione in acqua 60, 0,9 NA,</td></tr><tr><td>CCD Warner</td><td>Instruments</td><td>V887ECSUVB dispositivo EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Peltier</td><td>Physic Instruments</td><td>Riscaldamento resistivo QE1 con riscaldatore a doppio canale TC-344B controller</td><td></td></tr><tr><td>Stadio del microscopio: stadio micro + piezoelettrico</td><td>National Instruments</td><td>Tre stadi lineari M-126. CG1 con uno stadio di nanoposizionamento piezoelettrico a 3 assi separato P-733.3DD</td><td></td></tr><tr><td>Daq</td><td></td><td>NI PCI-6229</td><td>Acquisizione della posizione x, y, z della sonda intrappolata e invio di segnali di feedback loop al tavolino del microscopio</td></tr> Sistema <tr>di feedback ad anello di feedback in tempo reale Linux<td>Real Time Application Interface (RTAI)</td><td></td><td></td><td>per controllare la posizione dello stadio, sviluppato su un desktop PC dedicato</td></tr></tbody></table>

misura della tensione di uscita durante laser induced axon lesione di valutare adesione assonale al substrato a piconewton e millisecond risoluzione

Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution

La formazione di connessioni funzionali in una rete neuronale sviluppo è influenzato da stimoli estrinseci. La crescita dei neuriti dei neuroni in via di sviluppo è oggetto di segnali chimici e meccanici, ed i meccanismi con cui percepisce e risponde a segnali meccanici sono poco conosciuti. Chiarire il ruolo di forze nella maturazione delle cellule consentirà la progettazione di scaffold che può promuovere l&#39;adesione cellulare e citoscheletro accoppiamento al substrato, e quindi migliorare la capacità di diversi tipi neuronali di rigenerarsi dopo una lesione. Qui, descriviamo un metodo per applicare misure di spettroscopia di forza simultanee durante laser della lesione cellulare indotta. Misuriamo il rilascio della tensione nel assone parzialmente lesionata dal simultaneo monitoraggio interferometrico di una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell&#39;assone. Il nostro protocollo sperimentale rileva il rilascio della tensione con la sensibilità piconewton, e la dinamica del rilascio della tensione arisoluzione temporale millisecondo. Pertanto, offre un metodo ad alta risoluzione per studiare come l&#39;accoppiamento meccanico tra cellule e substrati può essere modulata mediante trattamento farmacologico e / o da distinti proprietà meccaniche del substrato.

La cella genera forze di trazione sul substrato dai suoi adesioni focali. Forza generata da elementi del citoscheletro sono in equilibrio con la forza di contrasto del substrato cultura. Dopo laser indotta lesione del neurite, alcuni cavi citoscheletro Tensed sono interrotti e la loro tensione equilibrata viene rilasciato perché la forza opposta del substrato adesione è eliminato. La tensione rilasciata è parzialmente distribuita sulle adesioni focali inalterati, e il tallone attaccato alla membrana cellulare, tenuto in...

Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell&#39;assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l&#39;assone adesione al substrato cultura.

Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

The formation of functional connections in a developing neuronal network is influenced by extrinsic cues. The neurite growth of developing neurons is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare, con sensibilità nell'ordine dei piconewton, l'adesione assonale ai substrati. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando laser per catturare e posizionare una microsfera vicino a un neurone isolato che presenta un lungo neurite. Il secondo passaggio consiste nel centrare la microsfera sull'assone mediante un laser a infrarossi.Successivamente, la rigidità del trappolamento ottico viene calibrata mediante il tracciamento interferometrico del moto browniano della microsfera intrappolata, prima di attaccarla al neurite. L'ultimo passaggio consiste nell'effettuare misurazioni di forza durante l'erogazione di impulsi laser UV per creare una lesione all'assone. Infine, la spettroscopia di forza viene utilizzata per valutare il rilascio della tensione prodotto dalla lesione assonica, il quale rappresenta una stima dell'adesione assonica al substrato.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla tecnica basata sul fluoresceina è che fornisce un parametro fisico. La forza viene misurata con sensibilità di picco NAL, consentendo un confronto diretto dell'ancoraggio assiale al substrato in diverse condizioni sperimentali

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Misure di applicazione e diretto di forze sui neuroni nel range 2000-1000 Microdyne sono realizzati con la massima precisione utilizzando aghi di vetro calibrato. Questa metodologia può essere utilizzato per controllare e misurare diversi aspetti dello sviluppo assonale, incluso l'avvio assonale, tensione assonale, la velocità di allungamento assonale e vettori di forza.

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Laser assotomia seguito da time-lapse imaging è un modo sensibile al test gli effetti delle mutazioni...

Costruzione di un laser a basso costo del sistema assotomia per studiare la rigenerazione assonale nel C. elegans</em

Questo video descrive il metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish utilizzando l'assotomia laser a due fotoni e osservando il recupero assonale da una lesione.

Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

Il video mostra un metodo per valutare le forze dei recettori applicate dalle cellule immunitarie utilizzando nanoparticelle d'oro ancorate al polietilenglicole e sonde di tensione a forcina di DNA. Le interazioni delle cellule T CD8-positive innescano il dispiegamento della sonda, emettendo fluorescenza, mentre i filamenti di blocco sostengono il segnale per quantificare le forze applicate dalle cellule immunitarie.

Utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per valutare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie

Due fotoni di imaging, accoppiato ad nanodissection laser, sono strumenti utili per studiare processi degenerativi e rigenerativi nel sistema nervoso centrale con risoluzione subcellulare. Questo protocollo viene illustrato come etichetta, immagine e sezionare singole fibre di arrampicata nella corteccia cerebellare in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

La registrazione delle correnti di Ca2+ sulla membrana frontale di rilascio presinaptico è la chiave per una comprensione precisa dell'ingresso di Ca2+ e del rilascio di neurotrasmettitori. Presentiamo una dissociazione acuta del midollo spinale della lampreda che produce assoni reticolospinali isolati funzionali, permettendo la registrazione direttamente dalla membrana facciale di rilascio dei singoli terminali presinaptici.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Presentiamo un protocollo che utilizza la microscopia time-lapse con eccitazione a due fotoni per visualizzare simultaneamente la dinamica delle lesioni degli assoni e della mielina in tempo reale. Questo protocollo proposto consente di studiare fattori sia intrinseci che estrinseci che possono influenzare il destino dell'assone mielinizzato centrale dopo una lesione e contribuire alla disabilità clinica permanente.

Un Ex Vivo Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Qui, presentiamo un protocollo per l'uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.

Misurazione delle dinamiche di sensibili alla forza della proteina in cellule viventi, utilizzando una combinazione di tecniche di fluorescenza

Questo documento descrive un protocollo dettagliato per l'utilizzo di sonde di tensione basate sul DNA per visualizzare le forze recettoriali applicate dalle cellule immunitarie. Questo approccio può mappare le forze recettoriali &gt;4.7pN in tempo reale e può integrare le forze nel tempo.

Sonde di tensione del DNA per mappare le forze transitorie del recettore di Piconewton da parte delle cellule immunitarie

Qui, presentiamo un protocollo per studiare le proprietà meccaniche intracellulari di cellule embrionali isolate di zebrafish in confinamento tridimensionale con misurazione della forza diretta mediante una trappola ottica.

Misure di forza diretta della meccanica subcellulare nel confinamento mediante pinzette ottiche

Qui, descriviamo una configurazione di pinzette magnetiche ad alta velocità che esegue misurazioni nanomeccaniche su biomolecole sensibili alla forza alla velocità massima di 1,2 kHz. Presentiamo la sua applicazione a forcine di DNA e complessi SNARE come sistemi modello, ma sarà applicabile anche ad altre molecole coinvolte in eventi meccanobiologici.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Scopri come misurare l'adesione assonale ai substrati con sensibilità piconewton usando la spettroscopia di forza e laser UV. Questo metodo permette di valutare il rilascio di tensione post-lesione assonale in tempo reale.

Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione (Video) | JoVE Journal

Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione

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