Utilizzo di un emacitometro per contare le cellule
Il conteggio delle cellule è un passo importante in molti saggi basati su cellule per determinare il numero e la vitalità delle cellule. In generale, l'obiettivo del conteggio è capire quanto un campione di una concentrazione di cellule sconosciute deve essere diluito per un ulteriore utilizzo. Lo strumento di laboratorio più comune per il conteggio delle cellule è l'emacitometro.
L'emacitometro è uno strumento di conteggio che è stato originariamente creato per contare le cellule del sangue. Al centro dell'emacitometro ci sono due camere di conteggio, su cui si può trovare una griglia incisa al laser.
La griglia è composta da 9 quadranti principali. I quattro quadranti angolari sono ulteriormente divisi in 16 quadranti più piccoli. Il quadrante centrale è diviso in 25 di questi quadranti più piccoli, ognuno dei quali è ulteriormente diviso in 16 micro-quadranti.
All'estremità di ogni camera ci sono le porte di introduzione del campione, in cui viene erogato il campione di cella da contare.
Su entrambi i lati delle camere di conteggio si trovano i supporti di montaggio antiscivolo di copertura, su cui poggia il coperchio in quarzo, di solito circa 0,1 mm sopra la camera di conteggio.
Poiché l'area di ogni grande quadrato è di 1 mm2, il volume contenuto da ogni grande quadrato è di 0,1 mm3 o 1/10.000 di un ml.
Prima di contare, prenditi sempre un momento per usare etanolo e un kimwipe per pulire e asciugare via qualsiasi lanugine, impronte digitali o filigrane dal coperchio e dalla camera di conteggio.
Quindi aggiungere con attenzione una piccola quantità di acqua a ciascuno dei supporti di montaggio del coverslip, la tensione superficiale dell'acqua manterrà il coverslip in posizione.
Ora triturare delicatamente la sospensione cellulare, o pipettarla su e giù, per rimuovere eventuali grumi cellulari. Utilizzare una micropipetta per aspirare circa 10 μl della sospensione e quindi caricare una delle porte di introduzione con il campione. La soluzione verrà aspirata nella camera di conteggio per azione capillare e dovrebbe coprire l'intera griglia.
Mentre le celle si stanno depositando, selezionare l'obiettivo. Quindi caricare l'emacitometro sul palco.
Quindi visualizzare le cellule al microscopio. Se ci sono meno di 5 celle in ciascuno dei grandi quadranti, potrebbe essere necessario ruotare nuovamente il campione verso il basso e risuscievole il pellet in un volume più piccolo. Se le cellule si sovrappongono l'una all'altra o sono semplicemente troppo dense per distinguersi facilmente l'una dall'altra, potrebbe essere necessario diluire il campione in un volume maggiore di soluzione. Assicurati di tenere traccia del fattore con cui stai diluendo le tue cellule. Ne avrai bisogno in un calcolo successivo.
Ora è il momento di contare le celle!
Come abbiamo detto prima, la camera di conteggio è coperta da una griglia incisa al laser. Le linee dei quadranti rendono più facile tenere traccia delle celle che stai contando. Scegliere il quadrante delle dimensioni per il conteggio in base alla densità delle celle nel campione. Ad esempio, se è presente un numero basso di celle, contare tutte le celle in uno dei quadranti angolari. Per i campioni con una quantità media di cellule, scegliere uno dei 16 quadranti più piccoli. Se c'è una densità molto alta di celle, conta le celle in uno dei 25 quadranti centrali. Indipendentemente dal quadrante scelto o dalla densità del campione di cellule, contare almeno 20-50 celle per quandrant.
Non tutte le celle cadranno ordinatamente all'interno dei quadranti. Puoi contare le celle che toccano le linee superiore e sinistra, ma ignora quelle che toccano quelle in basso o a destra. Per ottenere il conteggio più accurato, utilizzare un contatore di celle per tenere traccia delle celle e prendere la media del numero di celle in 4 quadranti della stessa dimensione.
Per calcolare il numero di cellule in un volume di 1 ml, moltiplicare il numero di cellule contate per 10.000, perché, come accennato in precedenza, ogni grande quadrato sulla griglia è 1/10.000 di un ml. Se hai contato uno di questi quadranti più grandi, moltiplica semplicemente questo numero 1. Se hai contato uno dei quadrati più piccoli in uno dei quadranti angolari, moltiplica questo numero per 16. Se hai contato tutte le celle in uno dei 25 quadranti centrali, moltiplica questo numero per 25. Se ti è capitato di diluire la sospensione cellulare prima di caricare l'emacyotmetro, dovrai anche moltiplicare per il fattore di diluizione.
Quindi, per calcolare il numero di cellule in 1 ml di questo campione, moltiplichiamo le 20 cellule in questo quadrante centrale per 104 e 25 per ottenere un totale di 5 x 106 cellule in 1 ml del campione.
Ora che conosciamo il numero totale di cellule in 1 ml del campione, dobbiamo moltiplicare questo numero per il volume totale della nostra soluzione. Quindi, ad esempio, se abbiamo 5 x 106 cellule in 1 ml, quindi in 2 ml, avremo un totale di 1 x 107 cellule.
Quindi, per evitare errori di conteggio errato, distribuzione non uniforme delle celle o errori di pipettaggio, caricare l'altro lato della camera e contare il campione di cella una seconda volta.
Contare le cellule al microscopio è anche un ottimo momento per valutare la vitalità delle cellule nel campione. Il tripano blu, una macchia vitale, viene spesso miscelato con il campione prima di essere caricato nell'emacitometro per questo scopo.
Le cellule vive escludono questo colorante, perché le cellule viventi sono molto selettive su ciò che permettono attraverso le loro membrane. Una cellula morta, tuttavia, non ha una membrana intatta, che consente al tripano blu di passare attraverso e macchiare il citoplasma.
Per verificare la vitalità del campione cellulare, diluire un'aliquota della sospensione cellulare in tripano blu, quindi caricare il campione colorato di tripano blu proprio come il normale campione cellulare. Sotto il contrasto di fase, le cellule vive appariranno luminose e dorate e dovrebbero essere contate; non contare nessuna delle cellule blu opache, morte.
Calcola il numero di celle come prima, questa volta moltiplicando il numero finale per il fattore di diluizione blu del tripano. Quindi, se il nostro campione rappresentativo originale fosse stato prima diluito in tripano blu, avremmo poi moltiplicato il nostro numero totale di cellule per la nostra diluizione blu di tripano 1:10, per un totale di 1x108 cellule nel nostro campione.
Quando hai finito di contare, ricordati di pulire il coperchio e la camera di conteggio!
Ora che sei un professionista del conteggio delle cellule, parliamo di alcuni dei motivi per cui potresti aver bisogno di sapere quante cellule hai in un particolare esperimento.
Dopo aver isolato le cellule da un tessuto normale o sperimentale, è importante sapere quante cellule hai recuperato. Qui i ricercatori vorranno sapere quanti splenociti, o cellule della milza, hanno isolato da questa milza di topo.
Quando si esegue un esperimento per vedere come reagiscono due diverse popolazioni cellulari, è importante sapere quante di ogni tipo di cellula si stanno mescolando insieme, come in questo esperimento di co-coltura con cellule B e T.
Vorrai sapere quante cellule hai per molti altri tipi di saggi basati su cellule. Qui viene impostato un test ELISPOT per determinare il numero di cellule in un campione che secernerà IFNγ, una proteina infiammatoria, in risposta al virus del papilloma umano.
Quando si esegue un esperimento in cui l'mRNA deve essere estratto, o isolato, dalle cellule di interesse, è importante sapere con quante chiamate si sta iniziando, al fine di acquisire una quantità sufficiente di mRNA per l'esperimento.
L'emacitometro è uno strumento economico e relativamente facile da usare per contare le celle, ma può essere noioso e ha il potenziale per l'errore umano.
Lo Scepter Handheld Automatic Counter è, come suggerisce il nome, un dispositivo di conteggio portatile che ha una precisione di conteggio migliorata rispetto all'emacitometro e che può discriminare sia la dimensione che il volume delle cellule in un campione di cellule.
Il contatore di celle automatizzato TC10 valuta sia il numero di celle che la vitalità, calcola automaticamente il numero di celle totali nel campione e consente di visualizzare le celle anche nella schermata di lettura.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al conteggio delle cellule. In questo video abbiamo esaminato: cos'è un emacitometro, come contare le cellule e determinare la vitalità cellulare e alcuni motivi diversi per cui potrebbe essere necessario contare le cellule. Grazie per aver guardato e ricordati di non contare le celle blu!
Molti esperimenti biomedici richiedono la manipolazione di una quantità nota di cellule, al fine di ottenere dati accurati, riproducibili e statistica…
Il conteggio delle cellule è un passo importante in molti saggi basati su cellule per determinare il numero e la vitalità delle cellule. In generale, l'obiettivo del conteggio è capire quanto un campione di una concentrazione di cellule sconosciute deve essere diluito per un ulteriore utilizzo. Lo strumento di laboratorio più comune per il conteggio delle cellule è l'emacitometro.
L'emacitometro è uno strumento di conteggio che è stato originariamente creato per contare le cellule del sangue. Al centro dell'emacitometro ci sono due camere di conteggio, su cui si può trovare una griglia incisa al laser.
La griglia è composta da 9 quadranti principali. I quattro quadranti angolari sono ulteriormente divisi in 16 quadranti più piccoli. Il quadrante centrale è diviso in 25 di questi quadranti più piccoli, ognuno dei quali è ulteriormente diviso in 16 micro-quadranti.
All'estremità di ogni camera ci sono le porte di introduzione del campione, in cui viene erogato il campione di cella da contare.
Su entrambi i lati delle camere di conteggio si trovano i supporti di montaggio antiscivolo di copertura, su cui poggia il coperchio in quarzo, di solito circa 0,1 mm sopra la camera di conteggio.
Poiché l'area di ogni grande quadrato è di 1 mm2, il volume contenuto da ogni grande quadrato è di 0,1 mm3 o 1/10.000 di un ml.
Prima di contare, prenditi sempre un momento per usare etanolo e un kimwipe per pulire e asciugare via qualsiasi lanugine, impronte digitali o filigrane dal coperchio e dalla camera di conteggio.
Quindi aggiungere con attenzione una piccola quantità di acqua a ciascuno dei supporti di montaggio del coverslip, la tensione superficiale dell'acqua manterrà il coverslip in posizione.
Ora triturare delicatamente la sospensione cellulare, o pipettarla su e giù, per rimuovere eventuali grumi cellulari. Utilizzare una micropipetta per aspirare circa 10 μl della sospensione e quindi caricare una delle porte di introduzione con il campione. La soluzione verrà aspirata nella camera di conteggio per azione capillare e dovrebbe coprire l'intera griglia.
Mentre le celle si stanno depositando, selezionare l'obiettivo. Quindi caricare l'emacitometro sul palco.
Quindi visualizzare le cellule al microscopio. Se ci sono meno di 5 celle in ciascuno dei grandi quadranti, potrebbe essere necessario ruotare nuovamente il campione verso il basso e risuscievole il pellet in un volume più piccolo. Se le cellule si sovrappongono l'una all'altra o sono semplicemente troppo dense per distinguersi facilmente l'una dall'altra, potrebbe essere necessario diluire il campione in un volume maggiore di soluzione. Assicurati di tenere traccia del fattore con cui stai diluendo le tue cellule. Ne avrai bisogno in un calcolo successivo.
Ora è il momento di contare le celle!
Come abbiamo detto prima, la camera di conteggio è coperta da una griglia incisa al laser. Le linee dei quadranti rendono più facile tenere traccia delle celle che stai contando. Scegliere il quadrante delle dimensioni per il conteggio in base alla densità delle celle nel campione. Ad esempio, se è presente un numero basso di celle, contare tutte le celle in uno dei quadranti angolari. Per i campioni con una quantità media di cellule, scegliere uno dei 16 quadranti più piccoli. Se c'è una densità molto alta di celle, conta le celle in uno dei 25 quadranti centrali. Indipendentemente dal quadrante scelto o dalla densità del campione di cellule, contare almeno 20-50 celle per quandrant.
Non tutte le celle cadranno ordinatamente all'interno dei quadranti. Puoi contare le celle che toccano le linee superiore e sinistra, ma ignora quelle che toccano quelle in basso o a destra. Per ottenere il conteggio più accurato, utilizzare un contatore di celle per tenere traccia delle celle e prendere la media del numero di celle in 4 quadranti della stessa dimensione.
Per calcolare il numero di cellule in un volume di 1 ml, moltiplicare il numero di cellule contate per 10.000, perché, come accennato in precedenza, ogni grande quadrato sulla griglia è 1/10.000 di un ml. Se hai contato uno di questi quadranti più grandi, moltiplica semplicemente questo numero 1. Se hai contato uno dei quadrati più piccoli in uno dei quadranti angolari, moltiplica questo numero per 16. Se hai contato tutte le celle in uno dei 25 quadranti centrali, moltiplica questo numero per 25. Se ti è capitato di diluire la sospensione cellulare prima di caricare l'emacyotmetro, dovrai anche moltiplicare per il fattore di diluizione.
Quindi, per calcolare il numero di cellule in 1 ml di questo campione, moltiplichiamo le 20 cellule in questo quadrante centrale per 104 e 25 per ottenere un totale di 5 x 106 cellule in 1 ml del campione.
Ora che conosciamo il numero totale di cellule in 1 ml del campione, dobbiamo moltiplicare questo numero per il volume totale della nostra soluzione. Quindi, ad esempio, se abbiamo 5 x 106 cellule in 1 ml, quindi in 2 ml, avremo un totale di 1 x 107 cellule.
Quindi, per evitare errori di conteggio errato, distribuzione non uniforme delle celle o errori di pipettaggio, caricare l'altro lato della camera e contare il campione di cella una seconda volta.
Contare le cellule al microscopio è anche un ottimo momento per valutare la vitalità delle cellule nel campione. Il tripano blu, una macchia vitale, viene spesso miscelato con il campione prima di essere caricato nell'emacitometro per questo scopo.
Le cellule vive escludono questo colorante, perché le cellule viventi sono molto selettive su ciò che permettono attraverso le loro membrane. Una cellula morta, tuttavia, non ha una membrana intatta, che consente al tripano blu di passare attraverso e macchiare il citoplasma.
Per verificare la vitalità del campione cellulare, diluire un'aliquota della sospensione cellulare in tripano blu, quindi caricare il campione colorato di tripano blu proprio come il normale campione cellulare. Sotto il contrasto di fase, le cellule vive appariranno luminose e dorate e dovrebbero essere contate; non contare nessuna delle cellule blu opache, morte.
Calcola il numero di celle come prima, questa volta moltiplicando il numero finale per il fattore di diluizione blu del tripano. Quindi, se il nostro campione rappresentativo originale fosse stato prima diluito in tripano blu, avremmo poi moltiplicato il nostro numero totale di cellule per la nostra diluizione blu di tripano 1:10, per un totale di 1x108 cellule nel nostro campione.
Quando hai finito di contare, ricordati di pulire il coperchio e la camera di conteggio!
Ora che sei un professionista del conteggio delle cellule, parliamo di alcuni dei motivi per cui potresti aver bisogno di sapere quante cellule hai in un particolare esperimento.
Dopo aver isolato le cellule da un tessuto normale o sperimentale, è importante sapere quante cellule hai recuperato. Qui i ricercatori vorranno sapere quanti splenociti, o cellule della milza, hanno isolato da questa milza di topo.
Quando si esegue un esperimento per vedere come reagiscono due diverse popolazioni cellulari, è importante sapere quante di ogni tipo di cellula si stanno mescolando insieme, come in questo esperimento di co-coltura con cellule B e T.
Vorrai sapere quante cellule hai per molti altri tipi di saggi basati su cellule. Qui viene impostato un test ELISPOT per determinare il numero di cellule in un campione che secernerà IFNγ, una proteina infiammatoria, in risposta al virus del papilloma umano.
Quando si esegue un esperimento in cui l'mRNA deve essere estratto, o isolato, dalle cellule di interesse, è importante sapere con quante chiamate si sta iniziando, al fine di acquisire una quantità sufficiente di mRNA per l'esperimento.
L'emacitometro è uno strumento economico e relativamente facile da usare per contare le celle, ma può essere noioso e ha il potenziale per l'errore umano.
Lo Scepter Handheld Automatic Counter è, come suggerisce il nome, un dispositivo di conteggio portatile che ha una precisione di conteggio migliorata rispetto all'emacitometro e che può discriminare sia la dimensione che il volume delle cellule in un campione di cellule.
Il contatore di celle automatizzato TC10 valuta sia il numero di celle che la vitalità, calcola automaticamente il numero di celle totali nel campione e consente di visualizzare le celle anche nella schermata di lettura.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al conteggio delle cellule. In questo video abbiamo esaminato: cos'è un emacitometro, come contare le cellule e determinare la vitalità cellulare e alcuni motivi diversi per cui potrebbe essere necessario contare le cellule. Grazie per aver guardato e ricordati di non contare le celle blu!
Il conteggio delle cellule è un passo importante in molti saggi basati su cellule per determinare il numero e la vitalità delle cellule. In generale, l'obiettivo del conteggio è capire quanto un campione di una concentrazione di cellule sconosciute deve essere diluito per un ulteriore utilizzo. Lo strumento di laboratorio più comune per il conteggio delle cellule è l'emacitometro.
L'emacitometro è uno strumento di conteggio che è stato originariamente creato per contare le cellule del sangue. Al centro dell'emacitometro ci sono due camere di conteggio, su cui si può trovare una griglia incisa al laser.
La griglia è composta da 9 quadranti principali. I quattro quadranti angolari sono ulteriormente divisi in 16 quadranti più piccoli. Il quadrante centrale è diviso in 25 di questi quadranti più piccoli, ognuno dei quali è ulteriormente diviso in 16 micro-quadranti.
All'estremità di ogni camera ci sono le porte di introduzione del campione, in cui viene erogato il campione di cella da contare.
Su entrambi i lati delle camere di conteggio si trovano i supporti di montaggio antiscivolo di copertura, su cui poggia il coperchio in quarzo, di solito circa 0,1 mm sopra la camera di conteggio.
Poiché l'area di ogni grande quadrato è di 1 mm2, il volume contenuto da ogni grande quadrato è di 0,1 mm3 o 1/10.000 di un ml.
Prima di contare, prenditi sempre un momento per usare etanolo e un kimwipe per pulire e asciugare via qualsiasi lanugine, impronte digitali o filigrane dal coperchio e dalla camera di conteggio.
Quindi aggiungere con attenzione una piccola quantità di acqua a ciascuno dei supporti di montaggio del coverslip, la tensione superficiale dell'acqua manterrà il coverslip in posizione.
Ora triturare delicatamente la sospensione cellulare, o pipettarla su e giù, per rimuovere eventuali grumi cellulari. Utilizzare una micropipetta per aspirare circa 10 μl della sospensione e quindi caricare una delle porte di introduzione con il campione. La soluzione verrà aspirata nella camera di conteggio per azione capillare e dovrebbe coprire l'intera griglia.
Mentre le celle si stanno depositando, selezionare l'obiettivo. Quindi caricare l'emacitometro sul palco.
Quindi visualizzare le cellule al microscopio. Se ci sono meno di 5 celle in ciascuno dei grandi quadranti, potrebbe essere necessario ruotare nuovamente il campione verso il basso e risuscievole il pellet in un volume più piccolo. Se le cellule si sovrappongono l'una all'altra o sono semplicemente troppo dense per distinguersi facilmente l'una dall'altra, potrebbe essere necessario diluire il campione in un volume maggiore di soluzione. Assicurati di tenere traccia del fattore con cui stai diluendo le tue cellule. Ne avrai bisogno in un calcolo successivo.
Ora è il momento di contare le celle!
Come abbiamo detto prima, la camera di conteggio è coperta da una griglia incisa al laser. Le linee dei quadranti rendono più facile tenere traccia delle celle che stai contando. Scegliere il quadrante delle dimensioni per il conteggio in base alla densità delle celle nel campione. Ad esempio, se è presente un numero basso di celle, contare tutte le celle in uno dei quadranti angolari. Per i campioni con una quantità media di cellule, scegliere uno dei 16 quadranti più piccoli. Se c'è una densità molto alta di celle, conta le celle in uno dei 25 quadranti centrali. Indipendentemente dal quadrante scelto o dalla densità del campione di cellule, contare almeno 20-50 celle per quandrant.
Non tutte le celle cadranno ordinatamente all'interno dei quadranti. Puoi contare le celle che toccano le linee superiore e sinistra, ma ignora quelle che toccano quelle in basso o a destra. Per ottenere il conteggio più accurato, utilizzare un contatore di celle per tenere traccia delle celle e prendere la media del numero di celle in 4 quadranti della stessa dimensione.
Per calcolare il numero di cellule in un volume di 1 ml, moltiplicare il numero di cellule contate per 10.000, perché, come accennato in precedenza, ogni grande quadrato sulla griglia è 1/10.000 di un ml. Se hai contato uno di questi quadranti più grandi, moltiplica semplicemente questo numero 1. Se hai contato uno dei quadrati più piccoli in uno dei quadranti angolari, moltiplica questo numero per 16. Se hai contato tutte le celle in uno dei 25 quadranti centrali, moltiplica questo numero per 25. Se ti è capitato di diluire la sospensione cellulare prima di caricare l'emacyotmetro, dovrai anche moltiplicare per il fattore di diluizione.
Quindi, per calcolare il numero di cellule in 1 ml di questo campione, moltiplichiamo le 20 cellule in questo quadrante centrale per 104 e 25 per ottenere un totale di 5 x 106 cellule in 1 ml del campione.
Ora che conosciamo il numero totale di cellule in 1 ml del campione, dobbiamo moltiplicare questo numero per il volume totale della nostra soluzione. Quindi, ad esempio, se abbiamo 5 x 106 cellule in 1 ml, quindi in 2 ml, avremo un totale di 1 x 107 cellule.
Quindi, per evitare errori di conteggio errato, distribuzione non uniforme delle celle o errori di pipettaggio, caricare l'altro lato della camera e contare il campione di cella una seconda volta.
Contare le cellule al microscopio è anche un ottimo momento per valutare la vitalità delle cellule nel campione. Il tripano blu, una macchia vitale, viene spesso miscelato con il campione prima di essere caricato nell'emacitometro per questo scopo.
Le cellule vive escludono questo colorante, perché le cellule viventi sono molto selettive su ciò che permettono attraverso le loro membrane. Una cellula morta, tuttavia, non ha una membrana intatta, che consente al tripano blu di passare attraverso e macchiare il citoplasma.
Per verificare la vitalità del campione cellulare, diluire un'aliquota della sospensione cellulare in tripano blu, quindi caricare il campione colorato di tripano blu proprio come il normale campione cellulare. Sotto il contrasto di fase, le cellule vive appariranno luminose e dorate e dovrebbero essere contate; non contare nessuna delle cellule blu opache, morte.
Calcola il numero di celle come prima, questa volta moltiplicando il numero finale per il fattore di diluizione blu del tripano. Quindi, se il nostro campione rappresentativo originale fosse stato prima diluito in tripano blu, avremmo poi moltiplicato il nostro numero totale di cellule per la nostra diluizione blu di tripano 1:10, per un totale di 1x108 cellule nel nostro campione.
Quando hai finito di contare, ricordati di pulire il coperchio e la camera di conteggio!
Ora che sei un professionista del conteggio delle cellule, parliamo di alcuni dei motivi per cui potresti aver bisogno di sapere quante cellule hai in un particolare esperimento.
Dopo aver isolato le cellule da un tessuto normale o sperimentale, è importante sapere quante cellule hai recuperato. Qui i ricercatori vorranno sapere quanti splenociti, o cellule della milza, hanno isolato da questa milza di topo.
Quando si esegue un esperimento per vedere come reagiscono due diverse popolazioni cellulari, è importante sapere quante di ogni tipo di cellula si stanno mescolando insieme, come in questo esperimento di co-coltura con cellule B e T.
Vorrai sapere quante cellule hai per molti altri tipi di saggi basati su cellule. Qui viene impostato un test ELISPOT per determinare il numero di cellule in un campione che secernerà IFNγ, una proteina infiammatoria, in risposta al virus del papilloma umano.
Quando si esegue un esperimento in cui l'mRNA deve essere estratto, o isolato, dalle cellule di interesse, è importante sapere con quante chiamate si sta iniziando, al fine di acquisire una quantità sufficiente di mRNA per l'esperimento.
L'emacitometro è uno strumento economico e relativamente facile da usare per contare le celle, ma può essere noioso e ha il potenziale per l'errore umano.
Lo Scepter Handheld Automatic Counter è, come suggerisce il nome, un dispositivo di conteggio portatile che ha una precisione di conteggio migliorata rispetto all'emacitometro e che può discriminare sia la dimensione che il volume delle cellule in un campione di cellule.
Il contatore di celle automatizzato TC10 valuta sia il numero di celle che la vitalità, calcola automaticamente il numero di celle totali nel campione e consente di visualizzare le celle anche nella schermata di lettura.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE al conteggio delle cellule. In questo video abbiamo esaminato: cos'è un emacitometro, come contare le cellule e determinare la vitalità cellulare e alcuni motivi diversi per cui potrebbe essere necessario contare le cellule. Grazie per aver guardato e ricordati di non contare le celle blu!
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Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:32
Basic Hemacytometer Components
1:49
Basic Operation of the Hemacytometer
3:26
How to Count Cells
6:21
Determining Cell Viability
7:57
Applications
9:53
Summary
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