Differenziazione del neonato mouse pelle cellule staminali derivate in cellule germinali-simili

L'obiettivo generale del seguente esperimento è formare cellule simili agli ovociti utilizzando cellule staminali derivate dalla pelle somatica. Questo risultato si ottiene impiegando cellule staminali indifferenziate purificate derivate dalla pelle di topo neonato. Come secondo passaggio, le cellule staminali vengono dissociate, preparandole così alla differenziazione.

Successivamente, le cellule staminali vengono seminate in un mezzo di differenziamento definito. Al fine di indurre la formazione di cellule germinali, si ottengono risultati che mostrano l'espressione di marcatori specifici dell'ovocita in base alla PCR in tempo reale semi-quantitativa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia della riproduzione.

Fornendo un sistema chiuso in cui studiare la cellula germinale, la formazione e lo sviluppo di eSight, tutti i mezzi necessari per il protocollo devono essere preparati da due a tre ore prima dell'uso e collocati nell'incubatore per colture cellulari, con il tappo allentato, nel luogo in cui si svolgerà l'esperimento. I due mezzi utilizzati qui sono il mezzo per cellule staminali costituito da D-M-A-M-F 12, integrato con B 27, BFGF ed EGF, e il mezzo per la differenziazione delle cellule germinali costituito da M1 99, integrato con FSH, LH, B-S-A-I-T-S, piruvato di sodio, tuin ed EGF. Cellule staminali isolate da topo neonato.

I cuccioli vengono utilizzati per la differenziazione in vitro delle cellule germinali al passaggio due-quattro. Poiché l'efficienza di formazione di cellule simili a citi o OLC è direttamente correlata alla qualità delle cellule staminali iniziali, è preferibile avviare la differenziazione non appena la popolazione appare pulita e sana, generalmente intorno al passaggio 2. 48 ore prima di iniziare la differenziazione, sottocolturare le cellule staminali utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere tutti gli aggregati cellulari sferici in sospensione e il mezzo usato dalla piastra di coltura e trasferirli in un tubo da 15 millilitri. È importante raccogliere soltanto gli aggregati cellulari sferici in sospensione e non le cellule aderenti al fondo della piastra che stanno differenziando spontaneamente.

Centrifugare le cellule a 500 ×g per cinque minuti, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di mezzo fresco per cellule staminali. Portare a 37 gradi Celsius. Pipettare delicatamente gli aggregati per dissociare parzialmente le cellule.

Non pipettare aggressivamente le cellule poiché ciò ridurrebbe la vitalità cellulare. Lavare le cellule parzialmente dissociate in 9,5 millilitri di mezzo per cellule staminali fresco preriscaldato in una piastra per colture cellulari da 10 centimetri a basso attaccamento. Reintrodurre le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per 48 ore.

Per iniziare la procedura di differenziazione delle OLC, utilizzare una pipetta serologica per rimuovere le cellule staminali dalla piastra di coltura e trasferirle in un tubo da 15 millilitri. Lasciare indietro eventuali cellule aderenti. Centrifugare le cellule a 500 ×g per cinque minuti, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS sterile, pipettando vigorosamente con una punta larga da 1000 microlitri per formare aggregati di dimensioni non superiori a 10-20 cellule.

Per il successo di questo protocollo, è fondamentale controllare regolarmente il grado di dissociazione al fine di garantire il livello corretto durante il processo di dissociazione. Prelevare periodicamente un piccolo quantitativo di cellule e osservarle al microscopio a luce bianca per verificare che le cellule aggregate siano raggruppate in ammassi di 10-20 cellule singole. Evitare di sovradissociare le cellule, poiché ciò comporterebbe una ridotta vitalità cellulare.

Successivamente, aggiungere 9,5 millilitri di PBS alle cellule dissociate e trasferire 15 microlitri di questa sospensione cellulare in un emocitometro per il conteggio cellulare. Centrifugare le cellule a 500 × g per cinque minuti. Dopo aver eliminato il soprannatante, risospendere le cellule nel mezzo di differenziamento a una concentrazione di 1,32 × 10⁶ cellule per millilitro.

Piatti le cellule aggiungendo 500 microlitri per pozzetto in una piastra sospensione da 24 pozzetti con fondo piatto. Posiziona la piastra da 24 pozzetti in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius in atmosfera al 5% di CO2 per 48 ore. Dopo 48 ore, rimuovi 250 microlitri di mezzo da ogni pozzetto e trasferiscili in un tubo da 1,5 millilitro corrispondente e opportunamente etichettato.

Aggiungere 250 microlitri di mezzo di differenziamento fresco in ogni pozzetto. Centrifugare il mezzo usato a 500 ×g per cinque minuti, scartare il soprannatante e risospendere eventuali cellule pellettate in 50 microlitri di mezzo di differenziamento fresco. Reintrodurre la sospensione cellulare nel corrispondente pozzetto della piastra di differenziamento. Ogni 48 ore fino al giorno 12 di differenziamento, sostituire la metà del mezzo con lo stesso metodo.

Durante la differenziazione nelle fasi iniziali, le cellule si attaccano al fondo della piastra di coltura e si espandono. Questa immagine rappresentativa mostra cellule a 42-72 ore dalla differenziazione, positive per OCT4. Un marcatore per cellule staminali indifferenziate è indicato nei nuclei verdi, controcolorati con Hirst e indicati in blu.

Man mano che la differenziazione procede, alcuni aggregati cellulari mostreranno cellule positive per OCT4, marcate in verde, circondate da cellule negative per OCT4. La barra della scala per questa immagine è di 100 micron. Questa figura mostra un'immagine in luce bianca di una struttura simile a un follicolo dopo il distacco dalla superficie di coltura; la barra della scala rappresenta 40 micron.

Con una coltura prolungata, l'LCS crescerà fino a raggiungere un diametro di circa 45 micron. La barra della scala in questa immagine rappresenta 10 micron. Grandi LCS positivi per OCT4 possono essere osservati sia circondati da cellule che singolarmente all'interno della coltura.

Questi LCS possono essere raccolti con cellule di supporto o con occhi di tripsina per ottenere LCS privi di altre cellule aderenti. Per confermare che i LCS esprimessero trascritti simili a quelli dei siti ol naturali, i LCS sono stati raccolti e analizzati per l'espressione di marcatori comuni dei siti OO, come Z-P-C-S-C-P tre CMO, T quattro BMP 15 e vasa. Questa figura mostra i livelli di trascritto di questi marcatori in 10 LCS rispetto a 10 citi di topo neonato.

I risultati mostrano che le LCS esprimono meno ZPC rispetto alle cytes. Poiché ZPC è un componente della struttura della membrana zop lucidum specifica delle cytes, questo potrebbe spiegare la natura fragile e la membrana zita più sottile delle LCS. L'espressione della SCP meiotica tre è maggiore nelle LCS rispetto alle cytes naturali.

Tuttavia, un marcatore diverso della meiosi, CMOs, è espresso a un livello inferiore. Questa discrepanza nei livelli di espressione potrebbe in parte spiegare l'attuale fallimento del LCS nel completare la meiosi. Altri marcatori come BMP 15 e vasa non mostrano differenze significative tra i siti lcs e O.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la salute della popolazione iniziale di cellule staminali è fondamentale per il suo successo.