Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale
September 30th, 2013
Visualizzazione dei dati sperimentali è diventata un elemento chiave per la presentazione dei risultati alla comunità scientifica. Generazione di live time-lapse di embrioni in crescita contribuisce a una migliore presentazione e la comprensione dei processi di sviluppo complessi. Questo protocollo è una guida passo-passo per l'etichettatura cellulare tramite fotoconversione di proteine Kaede in zebrafish.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare una registrazione in tempo reale della migrazione delle cellule della cresta neurale al fine di mostrare la formazione di strutture facciali craniche in via di sviluppo. Ciò si ottiene montando prima un pesce zebra transgenico anestetizzato SOX 10 KD in agarosio al fine di ridurre al minimo il movimento durante l'esperimento. Successivamente, al microscopio confocale, viene eseguita la fotoattivazione UV per convertire la KD dal verde al rosso nelle cellule della cresta neurale.
Quindi concentrandosi sulle cellule della cresta neurale fotoconvertite. Viene generato uno Zack della struttura in via di sviluppo prima che venga registrato un video time-lapse. Si ottengono risultati che mostrano lo sviluppo di cellule della cresta neurale cranica nel palato primario del pesce zebra in un embrione transgenico di pesce zebra SOX 10 KD.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging statico, è che i processi di sviluppo complessi come la migrazione cellulare possono essere visualizzati in tempo reale. Ciò rende i risultati più accessibili alla comunità scientifica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come si formano le strutture derivate dalle cellule della cresta neuro e come i geni PTO influenzano il loro sviluppo.
Per prepararsi al montaggio degli embrioni, utilizzare un pallone da 125 millilitri per mescolare l'acqua E tre con un microonde aeros a basso punto di fusione per sciogliere la soluzione. Quindi aggiungere trica e mettere il pallone in un bagnomaria a 50 gradi Celsius per mantenere caldo e nidificare i legami brillantemente fluorescenti transgenico soina KD zebra embrioni di pesce zebra a 60 ore dopo la fecondazione. Quindi trasferirli su un vetrino da camera con carta velina.
Assorbire l'acqua in eccesso e poi utilizzare la soluzione di agarro per coprire l'embrione. Utilizzare una punta micro loader per posizionare l'embrione perfettamente dorsale, assicurandosi che gli embrioni siano completamente immersi nell'agarro. Dopo che l'agarro si è impostato, utilizzare E tre 0,015% trica per riempire il vetrino della camera per eseguire la conversione delle foto.
Inizia utilizzando un obiettivo a immersione in aria 20 x per concentrarti sull'embrione. Quindi premere il pulsante di illuminazione L 100 sul microscopio e selezionare i canali nel software. Apri le icone.
Visualizza i controlli di acquisizione A una delle impostazioni e fai clic sul pulsante di configurazione confocale. Quindi, fai clic su auto e seleziona DPI 4 88 e 561.9 rispettivamente per i canali 1, 2, 3 prima di chiudere nuovamente la finestra. Quindi spegnere i canali uno e tre prima di fare clic sul pulsante di rimozione dell'interblocco e premere il pulsante di scansione a partire da un fotogramma al secondo e HV 200.
Inizia a concentrarti sulle celle di interesse. Aumentando gradualmente i fotogrammi al secondo fino a uno ogni 32 e riducendo la tensione da 100 a 120 a seconda del rumore di fondo. Quando l'embrione è a fuoco, afferra il bordo verde sul bordo destro dello schermo e riducilo per adattarlo all'area da convertire prima di fare clic con il pulsante destro del mouse.
Modificare i fotogrammi al secondo a uno e l'HV a 200 e premere scansione. Sarà ora visibile un'immagine ingrandita dell'area di conversione delle foto. Prossima foto.
Converti le celle attivando il canale uno per un periodo compreso tra cinque e 60 secondi fino a quando il segnale KD verde non è quasi assente. Quindi spegni il canale dappy. Attivare i canali due e tre per tornare allo zoom originale.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di zoom e scegliere Torna alle dimensioni originali per verificare se le celle desiderate sono state convertite correttamente. Imposta i limiti dello Zack scegliendo l'icona Capture Z Series nella barra dei menu. Regola le tabelle di ricerca o uts per impostare un time lapse.
Scegli la casella A one simple GUI e seleziona le seguenti impostazioni. Uno ogni 32 fotogrammi al secondo. Taglia 1024 e media quattro o otto x a seconda del numero di pile Z che devono essere prese in un ciclo.
Successivamente, vai a visualizzare i controlli di acquisizione Acquisizione sequenza ND e imposta l'intervallo di tempo. Fare quindi clic su continuo e quindi su Zack. Impostare i bordi come illustrato in precedenza.
Avviare il filmato, aggiungere la soluzione di E tre 0,015% trica alla camera, far scorrere durante il giorno e riempire completamente la camera per l'imaging notturno. Al termine dell'imaging, creare un video di alta qualità dal file di imaging facendo clic su Mostra proiezione intensità massima. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e creare un nuovo documento.
Elimina i fotogrammi non necessari e regola i L ut. In questo filmato che mostra Palato Genesis nel pesce zebra, la linea transgenica SOX 10 K viene utilizzata per seguire le cellule della cresta neurale cranica mentre si sviluppano per formare il palato primario. Le cellule più anteriori del palato in formazione vengono fotoconvertite dal verde al rosso a 60 ore dopo la fecondazione.
Quando i trabecoli accoppiati si sono incontrati per formare il palato primario, queste cellule vengono seguite fino a raggiungere la loro destinazione finale. Questo filmato mostra lo sviluppo perturbato del palato che porta alla formazione di una schisi orofacciale, abbattimento dello speck mediato dal morino. Un lb, un gene coinvolto nella schisi facciale obliqua viene utilizzato come esempio.
A 60 HPF, la fotoconversione unilaterale delle placche etmoidi più anteriori mostra un versamento fallimentare tra le placche etmoidi mediane e laterali. Questo difetto assomiglia alla patogenesi dello sviluppo della schisi facciale obliqua nell'uomo, dove si verifica un versamento fallito tra il processo nasale laterale e la prominenza mascellare. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per esplorare lo sviluppo delle cellule della cresta neuro nel pesce zebra.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo metodo per catturare il tuo processo di sviluppo di interesse.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale negli embrioni di zebrafish attraverso registrazioni time-lapse dal vivo. Utilizzando la fotoconversione della proteina kaede, i ricercatori possono comprendere meglio lo sviluppo delle strutture facciali craniali.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
Sfondo
- La visualizzazione dei dati sperimentali è cruciale per la comunicazione scientifica.
- Le registrazioni time-lapse migliorano la comprensione di processi di sviluppo complessi.
- I modelli transgenici di zebrafish sono preziosi per studiare la dinamica delle cellule della cresta neurale.
- Le tecniche di fotoconversione permettono un tracciamento preciso dei cambiamenti cellulari.
Obiettivo dello studio
- Generazione di registrazioni time-lapse dal vivo della migrazione delle cellule della cresta neurale.
- Illustrare la formazione delle strutture facciali craniali negli zebrafish.
- Utilizzare la fotoconversione per una migliore visualizzazione dei processi cellulari.
Metodi utilizzati
- Montaggio di zebrafish transgenici SOX 10 KD anestetizzati in agarose.
- Condurre l'attivazione UV foto per convertire la proteina kaede dal verde al rosso.
- Concentrarsi sulle cellule della cresta neurale foto-convertite sotto un microscopio confocale.
- Registrare video time-lapse per catturare lo sviluppo delle strutture craniali.
Risultati principali
- Viabilizzazione di successo della migrazione delle cellule della cresta neurale negli zebrafish.
- Dimostrazione delle cellule della cresta neurale craniali che si sviluppano nel palato primario.
- Generazione di un video time-lapse che mostra le dinamiche cellulari.
- Conoscenze sul ruolo di SOX 10 nello sviluppo craniofacciale.
Conclusioni
- Il protocollo dimostra efficacemente il comportamento delle cellule della cresta neurale in vivo.
- La fotoconversione è uno strumento potente per studiare i processi di sviluppo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dello sviluppo craniofacciale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
