Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale
30 settembre 2013
Visualizzazione dei dati sperimentali è diventata un elemento chiave per la presentazione dei risultati alla comunità scientifica. Generazione di live time-lapse di embrioni in crescita contribuisce a una migliore presentazione e la comprensione dei processi di sviluppo complessi. Questo protocollo è una guida passo-passo per l'etichettatura cellulare tramite fotoconversione di proteine Kaede in zebrafish.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare una registrazione in tempo reale della migrazione delle cellule della cresta neurale al fine di mostrare la formazione di strutture facciali craniche in via di sviluppo. Ciò si ottiene montando prima un pesce zebra transgenico anestetizzato SOX 10 KD in agarosio al fine di ridurre al minimo il movimento durante l'esperimento. Successivamente, al microscopio confocale, viene eseguita la fotoattivazione UV per convertire la KD dal verde al rosso nelle cellule della cresta neurale.
Quindi concentrandosi sulle cellule della cresta neurale fotoconvertite. Viene generato uno Zack della struttura in via di sviluppo prima che venga registrato un video time-lapse. Si ottengono risultati che mostrano lo sviluppo di cellule della cresta neurale cranica nel palato primario del pesce zebra in un embrione transgenico di pesce zebra SOX 10 KD.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'imaging statico, è che i processi di sviluppo complessi come la migrazione cellulare possono essere visualizzati in tempo reale. Ciò rende i risultati più accessibili alla comunità scientifica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia dello sviluppo, come ad esempio come si formano le strutture derivate dalle cellule della cresta neuro e come i geni PTO influenzano il loro sviluppo.
Per prepararsi al montaggio degli embrioni, utilizzare un pallone da 125 millilitri per mescolare l'acqua E tre con un microonde aeros a basso punto di fusione per sciogliere la soluzione. Quindi aggiungere trica e mettere il pallone in un bagnomaria a 50 gradi Celsius per mantenere caldo e nidificare i legami brillantemente fluorescenti transgenico soina KD zebra embrioni di pesce zebra a 60 ore dopo la fecondazione. Quindi trasferirli su un vetrino da camera con carta velina.
Assorbire l'acqua in eccesso e poi utilizzare la soluzione di agarro per coprire l'embrione. Utilizzare una punta micro loader per posizionare l'embrione perfettamente dorsale, assicurandosi che gli embrioni siano completamente immersi nell'agarro. Dopo che l'agarro si è impostato, utilizzare E tre 0,015% trica per riempire il vetrino della camera per eseguire la conversione delle foto.
Inizia utilizzando un obiettivo a immersione in aria 20 x per concentrarti sull'embrione. Quindi premere il pulsante di illuminazione L 100 sul microscopio e selezionare i canali nel software. Apri le icone.
Visualizza i controlli di acquisizione A una delle impostazioni e fai clic sul pulsante di configurazione confocale. Quindi, fai clic su auto e seleziona DPI 4 88 e 561.9 rispettivamente per i canali 1, 2, 3 prima di chiudere nuovamente la finestra. Quindi spegnere i canali uno e tre prima di fare clic sul pulsante di rimozione dell'interblocco e premere il pulsante di scansione a partire da un fotogramma al secondo e HV 200.
Inizia a concentrarti sulle celle di interesse. Aumentando gradualmente i fotogrammi al secondo fino a uno ogni 32 e riducendo la tensione da 100 a 120 a seconda del rumore di fondo. Quando l'embrione è a fuoco, afferra il bordo verde sul bordo destro dello schermo e riducilo per adattarlo all'area da convertire prima di fare clic con il pulsante destro del mouse.
Modificare i fotogrammi al secondo a uno e l'HV a 200 e premere scansione. Sarà ora visibile un'immagine ingrandita dell'area di conversione delle foto. Prossima foto.
Converti le celle attivando il canale uno per un periodo compreso tra cinque e 60 secondi fino a quando il segnale KD verde non è quasi assente. Quindi spegni il canale dappy. Attivare i canali due e tre per tornare allo zoom originale.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di zoom e scegliere Torna alle dimensioni originali per verificare se le celle desiderate sono state convertite correttamente. Imposta i limiti dello Zack scegliendo l'icona Capture Z Series nella barra dei menu. Regola le tabelle di ricerca o uts per impostare un time lapse.
Scegli la casella A one simple GUI e seleziona le seguenti impostazioni. Uno ogni 32 fotogrammi al secondo. Taglia 1024 e media quattro o otto x a seconda del numero di pile Z che devono essere prese in un ciclo.
Successivamente, vai a visualizzare i controlli di acquisizione Acquisizione sequenza ND e imposta l'intervallo di tempo. Fare quindi clic su continuo e quindi su Zack. Impostare i bordi come illustrato in precedenza.
Avviare il filmato, aggiungere la soluzione di E tre 0,015% trica alla camera, far scorrere durante il giorno e riempire completamente la camera per l'imaging notturno. Al termine dell'imaging, creare un video di alta qualità dal file di imaging facendo clic su Mostra proiezione intensità massima. Quindi fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e creare un nuovo documento.
Elimina i fotogrammi non necessari e regola i L ut. In questo filmato che mostra Palato Genesis nel pesce zebra, la linea transgenica SOX 10 K viene utilizzata per seguire le cellule della cresta neurale cranica mentre si sviluppano per formare il palato primario. Le cellule più anteriori del palato in formazione vengono fotoconvertite dal verde al rosso a 60 ore dopo la fecondazione.
Quando i trabecoli accoppiati si sono incontrati per formare il palato primario, queste cellule vengono seguite fino a raggiungere la loro destinazione finale. Questo filmato mostra lo sviluppo perturbato del palato che porta alla formazione di una schisi orofacciale, abbattimento dello speck mediato dal morino. Un lb, un gene coinvolto nella schisi facciale obliqua viene utilizzato come esempio.
A 60 HPF, la fotoconversione unilaterale delle placche etmoidi più anteriori mostra un versamento fallimentare tra le placche etmoidi mediane e laterali. Questo difetto assomiglia alla patogenesi dello sviluppo della schisi facciale obliqua nell'uomo, dove si verifica un versamento fallito tra il processo nasale laterale e la prominenza mascellare. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia dello sviluppo per esplorare lo sviluppo delle cellule della cresta neuro nel pesce zebra.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo metodo per catturare il tuo processo di sviluppo di interesse.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale in embrioni di pesce zebra mediante registrazioni vitali a intervalli di tempo. Utilizzando la fotoconversione della proteina kaede, i ricercatori possono comprendere meglio lo sviluppo delle strutture facciali craniche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia dello sviluppo
- Embriologia
Sfondo
- La visualizzazione dei dati sperimentali è fondamentale per la comunicazione scientifica.
- Le registrazioni in time-lapse migliorano la comprensione dei processi complessi di sviluppo.
- I modelli di pesce zebra transgenici sono preziosi per lo studio della dinamica delle cellule della cresta neurale.
- Le tecniche di fotoconversione permettono un tracciamento preciso dei cambiamenti cellulari.
Scopo dello studio
- Generare registrazioni in diretta con riprese a intervalli di tempo della migrazione delle cellule della cresta neurale.
- Illustrare la formazione delle strutture craniofacciali nel pesce zebra.
- Utilizzare la fotoconversione per migliorare la visualizzazione dei processi cellulari.
Metodi Utilizzati
- Montaggio di zebrafish transgenici con silenziamento di SOX10 anestetizzati in agarosio.
- Eseguire l'attivazione fotochimica con luce UV per convertire la proteina kaede da verde a rossa.
- Messa a fuoco delle cellule della cresta neurale fotoconvertite mediante microscopio confocale.
- Registrazione di video in time-lapse per catturare lo sviluppo delle strutture craniche.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita della migrazione delle cellule della cresta neurale nel pesce zebra.
- Dimostrazione dello sviluppo delle cellule della cresta neurale cranica nel palato primario.
- Realizzazione di un video in time-lapse che illustra la dinamica cellulare.
- Approfondimenti sul ruolo di SOX10 nello sviluppo craniofacciale.
Conclusioni
- Il protocollo dimostra efficacemente il comportamento delle cellule della cresta neurale in vivo.
- La fotoconversione è uno strumento potente per lo studio dei processi di sviluppo.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dello sviluppo craniofacciale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione della dinamica delle cellule della cresta neurale cranica nel pesce zebra fornisce un modello predittivo per la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli craniofacciali. Il sistema transgenico sox10:kaede consente un tracciamento temporale ad alta risoluzione di eventi di migrazione e differenziazione rilevanti per la morfogenesi facciale umana. Questo approccio supporta la scoperta precoce collegando perturbazioni genetiche a esiti fenotipici in un sistema rilevante per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche tracciando i contributi delle creste neurali craniali agli elementi mascellari e mandibolari.
- Valore operativo: Permette una precisa restrizione della linea cellulare mediante il reporter fotoconvertibile kaede, riducendo l’ambiguità dell’etichettatura rispetto all’iniezione di coloranti.
- Valore predittivo: Consente lo screening fenotipico di mutanti craniofacciali per valutare il legame al bersaglio e la modulazione del percorso metabolico.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi spazio-temporali sulla migrazione cellulare e sulla convergenza dei tessuti per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Produce acquisizioni ripetibili in time-lapse compatibili con le linee guida per l'analisi ad alto contenuto informativo.
- Scalabilità: Adattabile a qualsiasi reporter kaede o fotoconvertibile in zebrafish transgenici per il riutilizzo della piattaforma.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Illustra l'omologia tra le prominenze facciali del pesce zebra e quelle degli amnioti, aumentando la rilevanza traslazionale.
- Valore operativo: Permette di osservare sia lo sviluppo craniofacciale normale che anomalo nei mutanti, per la validazione fenotipica.
- Controllo del rischio: Consente l'osservazione di difetti di effusione che modellano la patogenesi delle fessure orofacciali umane.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro di scoperta precoce fornendo un'immagine in tempo reale di strutture derivate dalla cresta neurale prima dello screening dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla funzione genica nella migrazione della cresta neurale cranica e nella formazione del palato.
- Screening: Fornisce letture quantitative al microscopio confocale per valutare gli effetti dei composti sulla dinamica cellulare.
- Analisi: Permette la misurazione della velocità di migrazione, dei tempi di convergenza e della formazione dei confini tissutali.
- Ricerca traslazionale: Collega lo sviluppo del palato nel pesce zebra agli omologhi craniofacciali umani per l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile per la valutazione del fenotipo dello sviluppo in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi attraverso la visualizzazione diretta delle decisioni riguardo al destino cellulare.
- Valore operativo: Standardizza i protocolli di fotoattivazione e di acquisizione temporizzata per un tracciamento riproducibile delle creste neurali.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione collegando gli obiettivi genetici a fenotipi craniofacciali osservabili.
- Impatto sul portafoglio: Informa la priorizzazione dei bersagli aggiustata per il rischio in base alla gravità del fenotipo dello sviluppo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'embriologia del pesce zebra, nella microscopia confocale e nella gestione di proteine fotoconvertibili.
- È dipendente da sistemi confocali dotati di capacità UV e da infrastrutture per l'immobilizzazione degli embrioni mediante inclusione in agarosio.
- Necessita della standardizzazione della durata della fotoattivazione e dell'acquisizione dello z-stack tra diversi utilizzatori.
- Le considerazioni per l'adattamento includono l'uso di reporter espressi da diversi promotori e lo stadio di sviluppo variabile tra ceppi di pesce zebra.
- I limiti pratici comprendono la fototossicità derivante da esposizioni prolungate ai raggi UV e la vitalità degli embrioni durante acquisizioni prolungate.
