Modifica multi-scala di impianti metallici con gradienti poro, polielettroliti e il loro monitoraggio indiretto In vivo

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modificare gli impianti metallici a più scale di lunghezza per controllare il comportamento cellulare in vitro e in vivo. Ciò si ottiene producendo prima un gradiente di dimensioni dei pori all'interno di impianti tubolari tridimensionali, metodo di estrazione Biofreeze. Il secondo passo consiste nello sviluppare imitatori della membrana basale nano fibrillare basati su collagene e alginato con la metodologia strato per strato.

Successivamente, un metodo indiretto per monitorare tali impianti dopo l'impianto utilizzando l'analisi del plasma sanguigno. L'HPLC e il successivo sequenziamento dei peptidi si dimostrano in definitiva un impianto in cui aree diverse possono ospitare diversi tipi di cellule secondo necessità. Per alcuni tessuti multicellulari si può ottenere anche se questo sistema può fornire un modo per modificare gli impianti metallici.

Può anche essere applicato a sistemi di modelli di colture cellulari 3D come tessuti artificiali o modelli di malattie. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando stavamo cercando di trovare una tecnica per controllare il movimento cellulare attorno agli impianti porosi in titanio in vivo. Per iniziare questa procedura, pulire gli impianti e progettare e produrre stampi in teflon come descritto nel testo scritto per il congelamento e l'estrazione.

Preparare la soluzione di polimero sintetico PLLA in una miscela binaria di diossina e acqua introducendo la polvere di polimero nel solvente organico. Su uno Starr magnetico riscaldare la miscela a 60 gradi Celsius in modo da ottenere una soluzione omogenea. Questa temperatura viene selezionata perché è il limite superiore della resistenza alla temperatura per le siringhe di vetro di precisione da utilizzare per l'introduzione della soluzione negli impianti.

Nel frattempo, calcolare il volume della soluzione polimerica necessaria rispetto alla porosità dell'impianto tenendo conto della variazione del volume della soluzione congelata. Successivamente, introdurre la soluzione negli impianti utilizzando siringhe di vetro di precisione con una precisione di 0,1 microlitri. Il limite inferiore per la concentrazione del polimero è del 3% per la formazione di gradienti di PO riproducibili, oppure, quando diventa difficile ottenere una distribuzione omogenea nei campioni spessi superiori al 6%, congelare i campioni direttamente a meno 80 gradi Celsius o con un periodo di incubazione precedente di 30 minuti a temperatura ambiente.

Le condizioni di congelamento determinano in parte la formazione dei pori. In questo modo le condizioni di congelamento possono essere regolate in base alla porosità desiderata. Conservare i campioni durante la notte a meno 80 gradi Celsius.

La separazione dello stampo allo stato congelato è un passaggio molto difficile. Bisogna fare attenzione a diminuire il contatto della soluzione di fondo congelata con lo stampo, con l'aiuto di un cuoio capelluto, Immergere gli impianti in etanolo pre raffreddato all'80% per ottenere gradienti di porosità. Utilizzare un bisturi pre-raffreddato per rimuovere tutte le parti dello stampo ad eccezione della mandril, per le protesi tubolari e tutte le parti tranne la parte inferiore per le protesi a forma di disco, eseguire l'estrazione a meno 20 gradi Celsius durante la notte.

Dopo l'estrazione, rimuovere le parti rimanenti dello stampo e asciugare all'aria gli impianti. Per la caratterizzazione della porosità complessiva della struttura. È necessaria l'analisi con ossimetro a mercurio.

In questo esempio, le misurazioni dell'ossimetro a mercurio mostrano picchi distinti che corrispondono ai pori su entrambi i lati dell'impianto e ai pori interdispersi più piccoli. Tuttavia, il dato più cruciale è la differenza tra le porosità delle superfici intraluminali ed extraluminali, che possono essere analizzate dall'immagine J per la distribuzione delle dimensioni dei pori. Successiva frattura da congelamento dei campioni osservando la sezione d'urto con un microscopio elettronico a scansione.

A causa della natura porosa aperta degli impianti utilizzati e della capacità di riflessione della luce del titanio, è possibile eseguire pile Z di cellule marcate all'interno degli impianti porosi. Le cellule marcate con PKH 26 o calcium AM possono essere utilizzate per visualizzare gli impianti con la microscopia laser confocale per l'accumulo di multistrati. La massima riproducibilità si ottiene con i robot ad immersione.

Tuttavia, se non è disponibile un robot a immersione, questi passaggi possono essere eseguiti manualmente. Per preparare la soluzione di collagene, utilizzare collagene di grado medico di tipo uno e alginato di sodio. Le concentrazioni ottimizzate sono di 0,5 grammi per litro per ciascuno su 150 millimolari.

Il tampone di cloruro di sodio citrato a pH 3,8 dissolve la soluzione di collagene durante la notte per garantire l'omogeneità. La soluzione di pH acido di 3,8 è necessaria per l'accumulo stabile degli strati poiché la struttura è instabile. Prima della reticolazione.

Nella versione a pH neutro è disponibile un supporto specifico per l'utilizzo degli impianti con robot di immersione utilizzati nella produzione multistrato di polielettrolita. Depositare gli strati sulla superficie degli impianti di solo titanio o degli impianti modificati come descritto nel testo. Utilizzando un sistema robotico di immersione, immergendo prima gli impianti in una soluzione di alginato per 15 minuti, quindi risciacquare la struttura con 150 millimolari di cloruro di sodio a pH 3,8 per cinque minuti.

Seguire con l'immersione in una soluzione di collagene per 15 minuti. Per stabilizzare prima la membrana basale, preparare la soluzione reticolante a 100 millimolari di genina. Nel tampone citrato A-D-M-S-O con un rapporto volume-volume da uno a quattro, sciogliere la genina nel componente DMSO e poi nel componente acquoso per evitare la formazione di grumi, reticolare i campioni mediante immersione nella soluzione reticolante tra 12 e 24 ore dopo.

Sciacquare con abbondanti quantità di tampone citrato a pH 3,8 Dopo aver lavato i passaggi, sterilizzare i campioni con trattamento UV per 30 minuti o in un bagno antibiotico antimicotico. I parametri principali che determinano la qualità della membrana basale sono il suo spessore e il diametro delle fibre. Calcola i diametri delle fibre utilizzando la microscopia a forza atomica o immagini FM ottenute in modalità contatto.

Dopo aver asciugato i campioni con un flusso di azoto, prima dell'imaging quantificare lo spessore di almeno 10 fibre per immagine per determinare lo spessore medio delle fibrille. Con il software Image J dopo l'essiccazione dei film multistrato di collagene alginato a 24 strati di collagene, lo spessore dei film può essere determinato mediante test di graffio. Usando prima un FM, utilizzare un ago da siringa per graffiare la pellicola dopo aver localizzato il graffio con un microscopio ottico, ottenere immagini con un FM su superfici di 10 per 10 micron quadrati al confine del graffio.

Calcola le altezze dai profili ottenuti con il software A FM, che fornisce lo spessore dello strato di film. Dopo aver impiantato il dispositivo nella trachea dei conigli come descritto nel testo, prelevare campioni di sangue dalle vene auricolari, centrifugare i campioni a 5.000 giri/min per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzare il surnatante ottenuto per l'analisi dopo aver estratto il plasma di coniglio con lo 0,1% di acido trior acetico.

Eseguire la purificazione HPLC in fase inversa del contenuto di proteine plasmatiche purificando l'estratto utilizzando una colonna in fase inversa 305 C 18 di cellule nucleo. Registrare l'assorbanza a 214 e 280 nanometri utilizzando il sistema a solvente e la velocità di flusso presenti nel protocollo di testo. Raccogliere le frazioni di picco prima di concentrarle attraverso l'evaporazione.

Utilizzando l'applicazione del vuoto veloce, è importante interrompere il vuoto veloce prima della completa asciugatura. Correlare i picchi ottenuti in diversi punti temporali nel corso del periodo di impianto. Utilizzare i peptidi purificati che mostrano tendenze coerenti durante il corso dell'impianto per l'identificazione mediante sequenziamento automatico di Edmond.

Caricare il campione su filtri in fibra di vetro trattati con poly brain per determinare la sequenza terminale finale dei peptidi purificati mediante degradazione automatica di Edmond utilizzando un micro sequenziatore di precisione. Il passo successivo è l'identificazione del fenil-th e di un amminoacido mediante cromatografia su una colonna C 18. Una volta ottenuta la sequenza, può essere identificata dal software di sabbiatura utilizzando il database Swiss Prote.

Modificando la concentrazione della soluzione di PLLA, è possibile controllare la dimensione dei pori sul lato extra luminale degli impianti. La dimensione e la forma dei pori sono state significativamente influenzate dalla presenza di impianti in titanio. Le dimensioni dei pori variavano da 40 a 100 micrometri con l'utilizzo di concentrazioni più basse che risultavano in pori più piccoli, mentre la dimensione dei pori laterali intraluminali era regolata dall'estrazione limitata ed era di circa nove micron, che è inferiore alla dimensione media dei fibroblasti.

Aggiungendo una fase di incubazione a temperatura ambiente, è possibile ottenere strutture a doppia porosità in cui le pareti dei pori più grandi hanno una propria porosità. Questa caratteristica è importante per gli impianti spessi in quanto faciliterebbe il movimento di gas e nutrienti. Dopo che il gradiente dei pori si è formato, è possibile aggiungere lo strato di film di collagene alginato sopra la struttura.

Questo strato di pellicola è stabile sopra la schiuma PLLA e può anche essere mantenuto sulla superficie in assenza della forma di fibre di collagene su scala nanometrica della schiuma. Man mano che lo strato di pellicola cresce, la crescita del film è esponenziale. In questo modo è possibile ottenere un film spesso di diverse centinaia di nanometri.

Gli impianti porosi in titanio si integrano con il tessuto ospite e sono completamente riempiti tra le quattro e le sei settimane in vivo, come mostrato nelle sezioni trasversali dell'impianto espiantato. Il tessuto all'interno dei pori è un tessuto connettivo maturo con un buon livello di vascolarizzazione. Durante questo periodo, l'analisi HPLC ha mostrato picchi distinti che fluttuano durante il corso del tempo di impianto.

Le frazioni di picco di interesse sono state sequenziate e determinate come semicatene di emoglobina alfa e beta, che avevano mostrato un andamento simile con le letture delle proteine C-reattive. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un giorno se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre gradienti PO multiscala 3D per la modifica di impianti metallici e per esperimenti di coltura cellulare.

L'estrazione a freddo e lo strato mediante formazione del film sono metalli semplici per sviluppare i propri impianti modificati o microambienti per le cellule.