Name: One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablazione del tumore Utilizzando Porphysomes, intrinseca multifunzionale nanovesicles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Scopri la sintesi dei porphysomes per la terapia fototermica dei tumori mediante estrusione ad alta pressione. Questa tecnica nanotecnologica ha mostrato un tasso di sopravvivenza del 100% negli studi in vivo su modelli xenotrapiantati.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Ospedale Principessa Margaret, la National Science and Engineering Research Council of Canada, Canadian Institute for Health Research, la Fondazione canadese per l&#39;innovazione e il Joey e Toby Tanenbaum / brasiliano Ball Chair in Prostate Cancer Research, concedere dalla Research Foundation SUNY e supporto all&#39;avvio da University at Buffalo.

1. Sintesi di Pyropheophorbide lipidi <ol><li> Unire 200 mmol pyropheophorbide (preparato da Spirulina Pacifica alghe come descritto in precedenza,... Zheng et al, Bioconj Chem, 2002, 13 -392) 4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-idrossi-sn-glycero -3-fosfocolina, Avanti Polar Lipidi # 855675), 76,3 mg di EDC, 48,7 mg DMAP (4 - (dimetilammino) piridina) in 5 ml amylene stabilizzato cloroformio per un rapporto di 1:1:2:2 Pyro: Lipid: EDC : DMPA. </li><li> Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente sotto argon per 24 h. Si evapora il cloroformio sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante con riscaldamento a 40 ° C. La miscela di isomeri piro-lipidico (pyro attaccati alla posizione sn-1 e sn-2) viene prodotto. </li><li> Risospendere piro-lipidico miscela di isomeri in 1 mM CaCl 2, Tris 50 mM (pH 8), 0,5% Triton X-100 e 10% di metanolo alla concentrazione di 5 mg / ml. Aggiungi fosfolipasi A2 (PLA2), dal miele al veleno d&#39;api0,1 mg concentrazione ml / e incubare la soluzione a 37 ° C per 24 ore per digerire sn-1 piro-lipidico e per produrre il puro sn-2 piro-lipidico isomero. </li><li> Aggiungere ulteriori 2 volumi di cloroformio e di 1,25 volumi di metanolo, estratto, e quindi rimuovere il solvente con evaporatore rotante a pressione ridotta a 40 ° C. Risospendere il prodotto di scissione in 1% MeOH in DCM e purificare su una piccola colonna di silice diolo per la isomericamente puro piro-lipidico. </li></ol> 2. Preparazione di Porphysomes <ol><li> Sciogliere pyropheophorbide-lipide, distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-metossi (polietilene glicole) (PEG-2000-PE) e colesterolo in cloroformio separatamente, e registrare le concentrazioni rispettivamente. </li><li> Preparare porphysome film lipidico in una provetta 12x75 mm prova borosilicato con un peso lipidico totale di 5 mg / tubo combinando il 65% molare porfirina-lipide, 5% molare PEG-2000-PE e il 30% molare colesterolo. </li><li> Asciugare i film lipidici sotto un getto di nitrogas gen e farli ulteriormente essiccati sotto vuoto per 1 ora. Memorizzare i film lipidici a -20 ° C sotto argon fino futuro idratazione ed estrusione. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone fosfato salino (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM fosfato, pH 7.4) a ciascuna provetta film lipidico. Congelare la provetta in azoto liquido fino a completo congelato, e poi scongelare il tubo 65 ° C bagnomaria finché il campione è tutto sciolto. Vortex il tubo per un totale di 30 sec (3x a 10 sec ciascuno, con 5 sec ri-riscaldamento a 65 ° C in bagno d&#39;acqua tra ogni vortex). </li><li> Ripetere il congelamento-scongelamento per 5 cicli o più al momento necessaria fino a quando non grandi aggregati possono essere osservati nella soluzione idratata. Lasciare la sospensione porphysome sul ghiaccio quando fatto. </li><li> Montare l&#39;estrusore ad alta pressione (10 ml) con due filtri in policarbonato 100 nm accatastati installati dentro Collegare l&#39;estrusore thermobarrel ad un circolatore termostatato a 65 ° C in circolazione bagnomaria, e collegare il sistema estrusore ad un serbatoio di azoto per alta pressionesicuro approvvigionamento. </li><li> Trasferire la sospensione porphysome alla camera estrusore con una pipetta di trasferimento vetro 9 pollici. Impostare la pressione ruotando la manopola sul regolatore serbatoio di azoto fino a una lettura tra 200 e 300 psig è osservato come pressione di estrusione iniziale. Aprire la valvola del regolatore di pressione gradualmente fino portata porphysome sufficiente è raggiunto o viene raggiunto un massimo di 800 psig (5.440 kPa) di pressione. </li><li> Dopo il primo passaggio di estrusione, chiudere la valvola di controllo della pressione e rilasciare la pressione dell&#39;estrusore aprendo la valvola limitatrice della pressione sulla parte superiore estrusore. Riempire il estrusore con la soluzione porphysome appena estruso, e ripetere l&#39;estrusione per almeno 10 volte per assicurare la soluzione estruso finale è omogeneo. </li><li> Determinare la concentrazione della soluzione finale porphysome misurando l&#39;assorbimento di un campione diluito in metanolo per UV-Vis spettrometro. Calcolare la concentrazione utilizzando la seguente equazione with il coefficiente di estinzione di 97.000 M -1 cm -1 a 410 nm per pyropheophorbide-lipidico. </li></ol><img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/50536/50536eq1.jpg" /><ol start="10"><li> Misurare la distribuzione finale dimensioni di porphysomes utilizzando un Malvern Zetasizer ZS90 dalla dispersione della luce dinamica. Diluire la soluzione porphysome in PBS e di eseguire tre misurazioni con 15 corse ciascuno per i risultati medi. </li><li> Determinare il quenching di fluorescenza porphysome confrontando l&#39;emissione di fluorescenza di porphysome temprato (1 mM in PBS) e porphysome unquenched (1 mM in 1% Triton X-100) utilizzando Spectrofluorometer. Prendere gli spettri prima e dopo il detersivo (Tirton X-100) si aggiunge, e normalizzare il segnale di lettura massima fluorescenza. Impostare l&#39;eccitazione di essere 410 nm, e l&#39;emissione gamma di lunghezze d&#39;onda per essere 600-800 nm. </li><li> Tenere soluzione porphysomes sotto argon a 4 ° C fino all&#39;utilizzo futuro, e proteggerlo dalla luce in alluminio folio. </li></ol> 3. Preparazione di Animal Xenograft Modello <ol><li> Cultura le cellule KB in RPMI-1640 (con 10% FBS), e sostenere le cellule in 5% di CO 2 e l&#39;atmosfera idratata a 37 ° C. </li><li> Cellule Harvest KB utilizzano tecniche di coltura cellulare standard. Mantenere la sospensione cellulare (20.000 cellule / ml) in tampone fosfato (PBS) in ghiaccio per la conservazione a breve termine fino al momento dell&#39;iniezione. </li><li> Preparare un KB xenotrapianti in topi nudi. Topi nudi sono acquistati da Charles River Laboratories quando sono di 20 g (Categoria # Crl: NU (NCR)-Foxn1 nu, 6-7 settimane di età), data dieta standard e biancheria da letto (Harlan Laboratories, Dieta: irradiato LM-485, # 7912; Letti: biancheria da letto Pannocchia, ¼ &quot;, # 7097). Sterilizzare tutti gli strumenti di gestione degli animali (siringhe, pinze e pastiglie animale) prima di esperimenti. Anestetizzare topi con 2% isoflurano v / v in 100% di ossigeno gassoso. Tutti i protocolli animali sono approvati dall&#39;istituzione (University Health NeTwork in questo caso) la cura degli animali e l&#39;uso commissione. </li><li> Iniettare cellule tumorali sospese in PBS per via sottocutanea al fianco destro del mouse. I topi sono pronti per essere utilizzati dopo 10 giorni quando tumore raggiunge diametro di 4-5 mm e spessore di 2-3 mm. </li></ol> 4. In vivo Photothermal Therapy <ol><li> Iniettare porphysomes (contenenti 750 nmol pyro al volume di 200 ml) per via endovenosa via vena della coda. Condurre laser irradiazione 24 ore dopo l&#39;iniezione di porphysomes. </li><li> In questa sezione, eseguire tutte le procedure in una camera di sicurezza laser chiusa. Indossare occhiali di protezione laser durante l&#39;irraggiamento laser. </li><li> Impostare l&#39;apparecchiatura irraggiamento laser. Tenere la fibra laser e un diffusore da un morsetto su un supporto. Impostare la potenza del laser a basso livello e accendere il laser. Regolare l&#39;altezza della fibra laser per ottenere una superficie di irradiazione del 9 mm di diametro (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canada), calibrare la potenza del laser di 750 mW (1.18 W / cm 2) con apower metro e poi spegnere il laser per preparare gli animali. </li><li> Anestetizzare gli animali con 2% isoflurano v / v in 100% di gas di trasporto di ossigeno attraverso un&#39;ogiva non scavenging evidente di isoflurano un pericolo rischio per la salute umana). Verificare che l&#39;animale viene anestetizzato abbastanza profondo eseguendo un pizzico punta con una pinza o dita zampe posteriori dell&#39;animale. Gli animali sono pronti per irraggiamento laser quando sono insensibili a questa procedura. </li><li> Monitorare la temperatura del tumore da una telecamera a infrarossi termica (Mikroshot, LumaSense Technologies). Posizionare la fotocamera vicino al tumore, concentrarsi bene e prendere una immagine pre PTT così come un normale immagine a luce bianca prima di PTT inizio di irradiazione. </li><li> Accendere il laser di nuovo, e aumentare il potere della luce a 750 mW. Posizionare il tumore nel centro del raggio laser per ottenere il tumore completamente coperto, e iniziare a programmare il calendario di irradiazione. Acquisire l&#39;immagine temperatura tumore ogni 5 secondi per un trattamento laser un minuto. Spegnere il laser a 1 min. Stop la fornitura di gas del 2% isoflurano, attendere fino a quando le recupera animali provenienti anestesia e la rimise alla gabbia. </li><li> Mantenere i topi a normothermia stanza degli animali sotto 00:12 h ciclo buio e luce secondo protocolli animali approvati dalla University Health Network. Iniettare buprenorfina (0,05 mg / kg, per via sottocutanea due volte al giorno per una settimana dopo l&#39;irradiazione laser per ridurre il dolore causato dalla cicatrice. Ogni due giorni, misurare il diametro del tumore usando un calibro e scattare una foto. Calcolare il volume del tumore usando l&#39; seguente equazione: V = π / 6 · a · b 2, dove a è il diametro lungo, e b è quello corto. </li><li> Sacrificare gli animali mettendoli in CO 2 camera quando la lunga diametro del tumore raggiunge 10 mm, in quanto è il punto finale definito nel nostro laboratorio. Eseguire dislocazione cervicale dopo il trattamento CO2. Tracciare la curva di sopravvivenza. </li></ol>

<ol><li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).</li>
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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Nello sviluppo di tecnologie di drug delivery, nanoparticelle multifunzionali sono attualmente in fase di ampie ricerche per il monitoraggio accurato del veicolo di consegna della droga, pur mantenendo un elevato carico utile di droga. Porfirinici liposomi caricati sono stati sviluppati per migliori proprietà farmacocinetiche e consegna più efficiente rispetto alla somministrazione diretta di porfirina, ma esistono ostacoli, compresa la quantità di carico limitato di porfirina e rapida ridistribuzione di porfirina da li...

Porphysomes sono nanovesicles nuovi multifunzionali che abbiamo recentemente sviluppato, che sono in grado di imaging e terapia multimodale 1. Esse sono formate da doppi strati porfirinici auto-assemblati e contengono una altissima densità di porfirina (oltre 83, 000/porphysome particella), che genera grande coefficiente di estinzione e risultati in unica struttura-dipendente fluorescenza auto-spegnimento. Porphysomes hanno buone in vivo farmacocinetica e biodistribuzione proprietà: essi mostrano un sangue emivita di 12 ore dopo la somministrazione sistematica, e passivamente accumulano nei tumori trapiantati con 7,5% ID / g in 24 ore dopo l&#39;iniezione 2. La loro struttura unica e le proprietà fisico-chimiche fanno porphysome un buon candidato per l&#39;imaging multimodale e la terapia immagine-guida. Prima di tutto, contenente porfirina, porphysomes sono intrinsecamente adatti per imaging di fluorescenza dei tumori sulla accumulo tumore 1.Inoltre, ogni porfirina ha un sito stabile per radioisotopi chelanti, dunque, porphysomes possono essere facilmente etichettati con radioisotopi come 64Cu per l&#39;imaging PET 3. Inoltre, l&#39;energia luminosa assorbita viene dissipata termicamente sotto irraggiamento laser di esposizione quando porphysome struttura è intatta, così porphysomes mostrano anche immagini fotoacustica unico e funzionalità PTT. E &#39;stato dimostrato che 24 ore dopo l&#39;iniezione endovenosa di porphysomes, irradiazione laser del tumore porphysome accumulata ha indotto un aumento di temperatura rapido e forte fototermico ablazione del tumore. Ciò ha dimostrato che porphysomes sono stimolatori fototermiche efficienti con coefficiente di estinzione alto come le nanoparticelle d&#39;oro (AuNPs) 1. D&#39;altra parte, in confronto con altri agenti fototermiche inorganici, incluse AuNPs, porphysomes mostrano un vantaggio eccezionale nei biosicurezza a causa della loro natura organica. Porphysomes sono enzimaticamente biodegradabili e inducono minimo toxicit acutay in topi con dosi endovenose alto come 1,000 mg / kg 1. Inoltre, simile a liposomi, il grande nucleo acquosa di porphysomes potrebbe essere passivamente o attivamente caricato con agenti terapeutici o di imaging. Le proprietà ottiche e biocompatibilità di porphysomes dimostrano il potenziale multimodale di nanoparticelle organiche per l&#39;imaging e la terapia BioPhotonic. In questo lavoro, si introduce il metodo di sintesi di coniugati pyropheophorbide-lipidico, la fabbricazione e il metodo di caratterizzazione di porphysomes utilizzando estrusione ad alta pressione. PTT in vivo su topi è condotta anche per dimostrare l&#39;efficienza di porphysome abilitati PTT nel tumore trattamento con un modello di tumore xenotrapianto sottocutanea.

<table><tbody><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Thermo-Savant</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Votex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td>Numero di modello: G560</td></tr><tr><td>Estrusore ad alta pressione</td><td>LIPEX, Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>Estrusore Thermobarrel da 10 ml</td></tr><tr><td>Circolatori a bagno riscaldato (Termostatato)</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>SC100-S5P</td><td></td></tr><tr><td>Filtri in policarbonato </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>Dimensione dei pori 100 nm e diametro della membrana 19 mm</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/Visibile</td><td>Varian Australia</td><td>Spettrofotometro UV/visibile Cary 50 Bio</td> Spettrofluorimetro HORIBA Scientific FluoroMax-4 Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)Incubatore per colture cellulari Hitachi H-7000 SANYO MCO-18AIC Powermeter Thorlabs PM100D con sensore S142C 671nm Laser LaserGlow Technologies <td> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>LRS-0671_PFN-02000-05</td><td>S/N:10097270</td></tr><tr><td>Termometro a infrarossi</td><td>Mikroshot, LUMASENSE Technologies</td><td>9102409</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali protettivi laser</td><td>LaserGlow Technologies</td><td>AGF6602XX</td><td>Densità ottica: 1,5+ a 630-700 nm</td></tr></tbody></table>

one minute, sub-one-watt photothermal ablazione del tumore utilizzando porphysomes, intrinseca multifunzionale nanovesicles

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

Abbiamo recentemente sviluppato porphysomes come nanovesicles intrinsecamente multifunzionali. Un fotosensibilizzante, pyropheophorbide α, è stato coniugato ad un fosfolipide e quindi auto-assemblato vescicole sferiche liposoma-like. A causa della densità estremamente elevata della porfirina nel doppio strato lipidico porfirina, porphysomes generato grandi coefficienti di estinzione, la struttura dipendente dalla fluorescenza di auto-spegnimento, e ottima efficacia fototermica. Nella nostra formulazione, porphysomes stati sintetizzati utilizzando estrusione ad alta pressione, e visualizzate una dimensione media delle particelle di circa 120 nm. Iniezione Ventiquattro ore dopo endovenosa di porphysomes, la temperatura locale del tumore è aumentata da 30 ° C a 62 ° C rapidamente su uno minuti di esposizione di 750 mW (1,18 W / cm 2), 671 nm laser irradiazione. Seguendo l&#39;ablazione termica completa del tumore, escare formata e guarito entro 2 settimane, mentre nei gruppi di controllo i tumori hanno continuato a crescere e tutti raggiunto il en definitalettera d entro 3 settimane. Questi dati mostrano come porphysomes possono essere usate come terapia photothermal potente (PTT) agenzie.

Pyropheophorbide è coniugato al fosfolipide come monomero lipidico stabile (Figura 1a) e coniugati auto-assemblano per formare porphysomes dal metodo di estrusione membrana utilizzando un estrusore ad alta pressione. Di solito è difficile estrudere sospensione porphysome lipidi durante i primi 3 cicli di estrusione con portata relativamente lento. Come più estrusi vengono ripetute, la velocità di flusso della soluzione estruso aumenta gradualmente, e la pressione può essere leggermente diminuita se nece...

Abbiamo sviluppato nuovi nanovesicles multifunzionali intrinseche chiamati porphysomes, che hanno struttura-dipendente fluorescenza auto-estinzione e le proprietà fototermiche uniche, fungendo così gli agenti di terapia fototermica come potenti. Abbiamo formulato porphysomes utilizzando estrusione ad alta pressione e studiato l&#39;efficacia della terapia photothermal in un modello di tumore xenotrapianto.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablazione del tumore Utilizzando Porphysomes, intrinseca multifunzionale nanovesicles

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

Gli obiettivi generali del seguente esperimento sono dimostrare la sintesi delle por quattro utilizzando un estrusore ad alta pressione e l'efficacia della terapia fototermica mediata dalle por quattro nel trattamento di tumori in un modello di tumore xenotrapiantato sottocutaneo. Questo viene ottenuto coniugando la piro quattro mediante alfa a un fosfolipide per formare la piro senti quattro lipidica come secondo passaggio; le piro quattro lipidiche si autoassemblano quindi in por quattro mediante estrusione ad alta pressione e vengono caratterizzate per il controllo qualità. Successivamente, le por cinque vengono iniettate in animali con tumori sottocutanei per dimostrarne l'efficacia nella terapia fototermica. Dopo irradiazione laser, i risultati mostrano che le por cinque sono nanoparticelle con elevata omogeneità e fluorescenza fortemente soppressa, e che le por cinque rappresentano un potente agente fototermico sulla base del tasso di sopravvivenza del 100% osservato nello studio in vivo sugli animali.I por foursomes sono le prime nanoparticelle organiche a fungere da potenziatori fototermici efficienti, mantenendo al contempo la capacità di caricamento del farmaco e la biocompatibilità dei convenzionali liposomi, risultando adatti per imaging multimodale e terapia guidata da immagini. Le implicazioni di questa tecnica si estendono quindi alla terapia e alla diagnosi dei tumori. Prima di questa procedura, i pyro four by lipid erano stati sintetizzati precedentemente secondo il protocollo descritto nel testo.Sciogliere separatamente il pyro four mediante il polietilene glicole lipidico e il colesterolo nel cloroformio. Registrare le concentrazioni di ciascuna soluzione nell'acquaio sotto cappa a temperatura ambiente. Preparare il complesso lipidico por foursome in un tubo da saggio in silicato di boro per un peso totale di lipidi pari a cinque milligrammi per tubo.Combinare il porfirina lipide PEG 2000 PE e il colesterolo in una concentrazione molare frazionaria rispettivamente del 65,5% e del 30%. Successivamente, evaporare brevemente i film lipidici sotto un flusso di gas azoto e poi sottoporli a vuoto per un'ora. I film lipidici possono ora essere conservati a meno 20 gradi Celsius sotto argon per l'idratazione ed estrusione futura.Per iniziare l'idratazione e l'estruzione, aggiungere un millilitro di PBS in ciascun tubo contenente il film lipidico, quindi congelare completamente ogni provetta nell'azoto liquido. Successivamente, scongelarle in un bagno termostatato a 65 gradi Celsius una volta che non sono più congelate. Vortexare ogni provetta tre volte per 10 secondi, riscaldandole nuovamente per cinque secondi nel bagno tra un'operazione di vortex e l'altra.Ripetere i cicli di congelamento, scongelamento e vortex per cinque volte o più, fino a quando non si osservano più aggregati di grandi dimensioni nella soluzione idratata. Infine, lasciare la sospensione di liposomi sul ghiaccio. Successivamente, assemblare un estrusore ad alta pressione da 10 millilitri con due filtri in policarbonato da 100 nanometri sovrapposti.Collegare l'estrusore a un bagno termostatato con circolazione d'acqua regolato a 65 gradi Celsius. Successivamente, collegare il sistema di estrusione a una bombola di azoto per fornire pressione. Utilizzare ora una pipetta di vetro lunga nove pollici per trasferire la sospensione nella camera dell'estrusore.Aumentare la pressione iniziale di estrusione a un valore compreso tra 200 e 300 PSIG. Aprire quindi gradualmente la valvola finché non si ottiene un flusso di por sufficiente. Non applicare una pressione superiore a 800 PSIG dopo il primo passaggio di estrusione.Chiudere la valvola di controllo della pressione e aprire la valvola di sfiato. Riempire nuovamente l'estrusore con la soluzione fresca e ripetere il processo almeno 10 volte per garantire che la soluzione estrusa finale sia completamente omogenea. Ous. Determinare la concentrazione della soluzione finale di por foursome misurando l'assorbanza di un campione diluito in metanolo mediante uno spettrometro UV-vis.Successivamente, diluire la soluzione di por quattro parti in 60 con PBS. Quindi effettuare tre misurazioni della distribuzione dei por quattro parti mediante scattering dinamico della luce. Eseguire 15 prove indipendenti e fare la media dei risultati.Infine, diagnosticare l'oscuramento della fluorescenza del por tetrasoma confrontando l'emissione fluorescente del PHY oscurato a un millimolare in PBS con quella del por pentasoma non oscurato a un millimolare in 1% Triton X-100. Conservare la soluzione del por tetrasoma al riparo dalla luce, avvolta in alluminio e sotto argon, a quattro gradi Celsius. Raccogliere le cellule KB in RPMI 1640 con 10% FBS, sospenderle a 20.000 cellule per millilitro in PBS e mantenerle in ghiaccio; iniettare 100 microlitri di cellule per via sottocutanea nel fianco destro di un topo nudo anestetizzato con isoflurano da 20 grammi.Dieci giorni dopo, il tumore risultante avrà un diametro compreso tra quattro millimetri ed essere pronto per il trattamento. Iniziare il trattamento iniettando 750 nanomoli delle por quaterne attraverso la vena della coda. Dopo 24 ore, irradiare con laser le por quaterne in una stanza chiusa per la sicurezza laser indossando occhiali protettivi per laser; la fibra laser e il diffusore devono essere fissati con un supporto.Impostare la potenza del laser a un livello basso e accendere il laser. Regolare l'altezza della fibra ottica del laser per ottenere un'area di irradiazione di nove millimetri di diametro. Utilizzare un misuratore di potenza per calibrare la potenza del laser a 750 milliwatt, corrispondenti a 1,18 watt per centimetro quadrato.Quindi spegnere il laser mentre si anestetizza l'animale con gas fluorurico ISO. Quando l'animale non risponde a una pinzatura del dito del piede, documentare la temperatura del tumore utilizzando una telecamera termica a infrarossi con fuoco ravvicinato. Acquisire un'immagine pre PTT e anche un'immagine in luce bianca normale.Successivamente accendere il laser a 750 milliwatt. Posizionare il tumore al centro del fascio laser per un minuto e misurare la temperatura del tumore ogni cinque secondi. Dopo un minuto, spegnere il laser, interrompere il flusso di gas isoflurano e attendere finché l'animale non si sia ripreso dall'anestesia prima di restituirlo alla sua gabbia.Ogni due giorni, fotografare il tumore e misurare il suo diametro con un calibro. Quando il diametro raggiunge i 10 millimetri, sacrificare umanamente l'animale. Utilizzando questo protocollo, il composto pyro four bide è stato coniugato al fosfolipide come monomero lipidico stabile ed è stato assemblato autonomamente per formare por foursomes mediante estrusione ad alta pressione.I pori risultanti avranno un'elevata omogeneità nella distribuzione delle dimensioni, con un picco intorno a 120 nanometri. Presentano inoltre due picchi principali di assorbanza a 410 nanometri e 677 nanometri. La fluorescenza della porfirina è spenta fino al 99,8% quando la nanostruttura è integra.Utilizzando il protocollo di PTT in vivo descritto, l'irradiazione laser effettuata con por quattro ha causato un aumento della temperatura tumorale di oltre 35 gradi Celsius dopo un minuto di irradiazione. Mentre il laser da solo ha indotto un aumento di temperatura inferiore ai 10 gradi Celsius. Successivamente all'irradiazione di PTT, i tumori si sono generalmente presentati di colore biancastro a causa dell'intenso effetto termico.L'ablazione termica ha determinato una escara di colore marrone scuro sui tumori e una riduzione del volume tumorale del 100%. Le cicatrici da ES erano evidenti 24 ore dopo il trattamento e si sono gradualmente risolte nelle due settimane successive. Utilizzando por quatre, i tumori sottocutanei sono stati completamente eliminati senza recidive.Per confronto, i tumori iniettati solo con ssom o trattati esclusivamente con laser hanno continuato a crescere. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare prismi por utilizzando un estrusore ad alta pressione e di come eseguire l'irradiazione laser dopo la somministrazione di roone per la terapia fototermica.

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