Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la generazione di forza durante una contrazione massima del pesce zebra, della larva, del muscolo del tronco. Ciò si ottiene realizzando prima anelli di sutura che verranno utilizzati per tenere le larve in posizione durante le misurazioni della forza. Successivamente, le larve anestetizzate vengono posizionate all'interno della camera sperimentale.

Una volta in posizione, la forza viene registrata durante una contrazione massimale della contrazione. Il passaggio finale consiste nel misurare le dimensioni della muscolatura del tronco in modo che la forza di picco possa essere normalizzata all'area della sezione trasversale muscolare. In definitiva, la misurazione della generazione di forza durante la contrazione viene utilizzata per mostrare i cambiamenti nella funzione muscolare e nella salute generale dei muscoli.

Sebbene dimostriamo questo metodo utilizzando larve di pesce zebra di tipo selvatico, può essere utilizzato anche con larve geneticamente modificate o con larve trattate con farmaci o sostanze tossiche. Il metodo può quindi essere utilizzato per caratterizzare modelli di malattia muscolare e valutare trattamenti o per studiare lo sviluppo muscolare, le lesioni o la tossicità chimica. Il primo passo è preparare gli anelli di sutura che verranno utilizzati per tenere in posizione le larve.

Durante il test di forza, utilizzare una pinza per separare la sutura non sterile in tre filamenti. Una volta separato, inizia a fare un doppio nodo a rovescio in uno dei fili, ma fermati prima di stringere completamente il nodo per fare un piccolo anello. Invece di finire il cappio, usa le forbici per tagliare la sutura in eccesso dalle code.

Posiziona l'anello sul lato adesivo di un post-it per un uso successivo. Realizzare due anelli di sutura per ogni larva che verrà testata. Innanzitutto, posizionare l'apparecchiatura di prova sul tavolino di uno stereomicroscopio.

Quindi, collegare i cavi del trasduttore di forza e del controller di lunghezza all'apparecchiatura di prova. Accendere il trasduttore di forza e il regolatore di lunghezza e premere l'interruttore sulla parte anteriore del regolatore di lunghezza. Ciò rende il tubo del controller di lunghezza collegato a ponte con un trasferimento monouso. Pipetta.

Riempire la camera sperimentale con la soluzione di prova. Usa una pinza per raccogliere un anello di sutura da una delle code come presa. L'anello sulla parte curva può attorcigliare la sutura e causarne la rottura durante i passaggi successivi.

Appendere un anello al tubo del trasduttore di forza e un altro al controller di lunghezza Con una pipetta di trasferimento monouso, trasferire le larve di pesce zebra in una piccola capsula di Petri riempita con la soluzione di test. Una volta che l'anestetico ha fatto effetto, spingere delicatamente la coda per verificare che ci sia una mancanza di nuoto evocato dal tatto. Successivamente, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire le larve nella camera sperimentale con una pinza.

Guidare delicatamente la parte anteriore della larva attraverso l'ansa di sutura sul tubo del trasduttore di forza, afferrando entrambe le code dell'ansa di sutura. Tirali contemporaneamente per stringere l'anello posteriormente al sacco di quercia o alla vescica natatoria con una pinza. Tenere una coda di sutura e tirare, facendo ruotare le larve di 90 gradi attorno al tubo fino a quando il lato laterale della larva è rivolto verso l'alto.

Utilizzando il dispositivo di posizionamento X, Y, Z collegato al controller di lunghezza, spostare il tubo del controller di lunghezza lungo l'asse x e sotto il tronco e la coda delle larve. Lasciare spazio tra le estremità del tubo del regolatore di lunghezza e il tubo del trasduttore di forza. Quindi, guida l'anello di sutura sulla coda delle larve e stringi l'anello di sutura.

Come dimostrato in precedenza, potrebbe essere necessario ruotare la parte posteriore delle larve in modo che il lato laterale sia rivolto verso l'alto. Una volta in posizione, taglia le code dell'anello di sutura. Utilizzare i dispositivi di posizionamento XY, Z per abbassare lentamente i tubi fino a toccare appena il fondo della camera.

Quindi sollevare le larve a una distanza adeguata dal fondo della camera. Questo dovrebbe essere entro la distanza di lavoro di un obiettivo per microscopio invertito utilizzato in seguito. Infine, regolare il tubo del regolatore di lunghezza per allineare l'asse lungo della larva con l'asse lungo del tubo del trasduttore di forza.

Per iniziare, spostare l'apparecchio di prova sul tavolino di un microscopio invertito. Quindi, collegare il termometro del circolatore a bagnomaria e il regolatore di temperatura all'apparecchiatura di prova. Accendere i componenti necessari e regolare l'impostazione del termoregolatore sul valore desiderato.

Collegare i cavi dallo stimolatore all'apparecchiatura di prova. Accendi l'alimentazione allo stimolatore, ma non stimolare le larve a questo punto. Per verificare che le larve siano parallele al fondo della camera, osservare la porzione delle larve compresa tra le estremità dei tubi.

Se parallele, entrambe le estremità delle larve saranno a fuoco, se necessario. Regolare il tubo del trasduttore di forza fino a quando entrambe le estremità sono a fuoco e la larva è parallela. Attivare il sistema di lunghezza del sarcomero video e ruotare la videocamera in modo che le striature siano parallele ai lati del fotogramma video.

La spaziatura delle striature viene utilizzata come indicatore della lunghezza del sarcomero. Regolare il microscopio per mettere a fuoco le fibre periferiche e annotare la lunghezza del sarcomero indicata. Se necessario, regolare il controller di lunghezza per accorciare le larve fino a quando la lunghezza del sarcomero non è inferiore a quella ottimale Per ottimizzare la forza di contrazione.

Innanzitutto, impostare la corrente di uscita sullo stimolatore su una bassa intensità, quindi programmare un software specializzato per erogare impulsi di corrente. Durata 0,2 millisecondi. Eroga il primo impulso e usa l'oscilloscopio per misurare la forza di contrazione di picco.

Aumenta la corrente con incrementi di 50 milliampere e misura la forza di contrazione di picco a ogni nuovo livello di corrente. Attendere 30 secondi tra le contrazioni per evitare l'affaticamento all'aumentare della corrente di stimolazione. La forza di contrazione di picco in genere aumenta fino a un massimo e poi diminuisce gradualmente la corrente alla quale la larva si genera.

La forza maggiore è la corrente di stimolazione ottimale una volta identificata, impostare l'ampiezza della corrente sulla corrente di stimolazione ottimale e regolare la lunghezza delle larve per ottenere la massima forza di contrazione. Infine, suscita una contrazione dei muscoli della larva. Utilizzare l'oscilloscopio per registrare la risposta alla forza e salvare la registrazione per l'analisi successiva.

Per misurare le dimensioni della muscolatura, riportare l'apparecchio di prova allo stereomicroscopio. Utilizzando la scala IP, misurare l'altezza della muscolatura vista di lato. Prendi le misure in un punto di riferimento anatomico.

Ad esempio, l'apertura urogenitale segnata qui in rosso. Quindi facendo attenzione a non modificare la lunghezza delle larve. Ruotare le larve di 90 gradi utilizzando le code dell'anello di sutura per vedere le larve dal basso.

Misura la larghezza della muscolatura vista dal basso. Infine tagliare gli anelli di sutura con una micro lama per rilasciare le larve dall'apparecchiatura di prova nelle larve sane di pesce zebra di tipo selvatico, le fibre muscolari dovrebbero essere parallele tra loro senza grandi spazi tra loro e avere striature evidenti larve di pesce zebra di tipo selvatico che non presentano queste caratteristiche o con danni evidenti come le fibre staccate come si vede qui dovrebbero essere scartate qui. Il picco della forza di contrazione rispetto alla corrente di stimolazione è tracciato per una singola larva di zebrafish.

La corrente di stimolazione ottimale è in genere compresa tra 400 e 600 milliampere. Qui viene mostrata una risposta di forza rappresentativa raccolta durante una contrazione massima di una singola larva. Qui. I valori di forza di picco di larve di tipo selvatico di età diverse variano da 0,9 a 1,7.

Milli newton con larve più vecchie che generano più forza rispetto alle larve più giovani. Le larve più vecchie generano più forza rispetto alle larve più giovani anche dopo che le forze di picco sono state normalizzate all'area muscolare della sezione trasversale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante stringere gli anelli di sutura a sufficienza in modo che le larve non possano ruotare facilmente attorno al trasduttore di forza e ai tubi del regolatore di lunghezza.

Se le anse di sutura sono troppo allentate, la forza generata dalla larva non verrà completamente trasmessa al trasduttore di forza e la forza massima di contrazione sarà sottostimata.