Name: Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Impara l'immunofluorescenza della retina neonatale del topo per studiare l'angiogenesi in vivo. Questo metodo consente di visualizzare il plesso vascolare retinico con microscopia confocale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust e della British Heart Foundation.

Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. 1. Enucleazione e la fissazione di postnatali Occhi <ol><li> Posizionare il mouse eutanasia cucciolo su un lato, togliere la pelle che copre gli occhi con le forbici. </li><li> Utilizzare forbici e pinze per enucleare l&#39;occhio. </li><li> Luogo forbici sotto l&#39;occhio enucleato, tagliare il nervo ottico e dei tessuti circostanti e sollevare l&#39;occhio. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente 4% paraformaldeide (PFA) composto 2x in PBS a temperatura ambiente. </li><li> Consentire ad ogni occhio di fissare per il 10 - 15 min, poi trasferimento al freddo 2x PBS in ghiaccio per 5 - 10 min. È meglio sfalsare enucleazioni e fissazione successiva per garantire il grado di fissazione è uguale per ogni occhio. </li></ol> 2. Dissezione di postnatali retine murini <ol><li> Trasferire gli occhi in una capsula di Petri contenente 2x PBS utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro e posto sotto una diffuamen microscopio. </li><li> Rimuovere eventuale grasso intorno all&#39;occhio con pinze e forbici. </li><li> Pierce il bordo della cornea con forbici affilate e tagliare intorno alla cornea e iride e scartare. </li><li> Inserire pinza tra retina e la sclera e rimuovere la sclera facendo attenzione a non strappare la retina. Lo strato coroide può anche essere rimosso, ma se vi è il rischio di danni alla retina occorrono durante tale fase, lo strato coroide può essere lasciato in quanto non dovrebbe influenzare significativamente la qualità della immunocolorazione. </li><li> Rimuovere la lente e l&#39;umor vitreo con pinze. </li><li> Rimuovere i vasi hyaloids raccogliendo insieme nel centro dell&#39;occhio con una pinza sottile poi rapidamente allontanarsi dal centro della retina (in alternativa snip alla base dei vasi hyaloid con le forbici sottili). </li><li> Sciacquare la retina a forma di coppa con PBS in un piatto pulito Petri. </li><li> Fare 4 a 5 incisioni radiali raggiungono circa 2/3 del raggio della retina mediante molla scissors creare una forma &#39;petalo&#39;. </li><li> Erogare PBS utilizzando una pipetta Pasteur per appiattire la retina, e quindi rimuovere l&#39;eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente. </li><li> Lentamente pipetta freddo (-20 ° C) il metanolo goccia a goccia sulla superficie della retina fino totalmente coperto e poi alluvione con ulteriore metanolo. Ciò contribuirà a risolvere le retine e faciliterà permeabilizzazione. Le retine diventeranno bianche. </li><li> Trasferire in una provetta 2 ml utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro. </li><li> Lascia retina in metanolo freddo per almeno 20 minuti prima di procedere con immunoistochimica. Degli anticorpi usati qui, solo VE-Caderina non può essere utilizzato con successo su metanolo retine fissi. In questo caso le retine devono proseguire dritto dell&#39;immunocolorazione dopo il punto 9. </li><li> Se necessario, le retine può essere conservato in metanolo a -20 ° C fino a diversi mesi prima della colorazione. </li></ol> 3. Immuno / colorazione isolectin della retina Vascuslatore <ol><li> Rimuovere con attenzione / versare via metanolo e delicatamente risciacquare retine brevemente in PBS (in questa fase la retina è ancora nella stessa 2 ml di tubo dal punto 11 di cui sopra). </li><li> Rimuovere PBS e copertura retine con 100 ml di soluzione di Perm / blocchi (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% di siero appropriato (cfr. tabella 1) e agitare delicatamente per 1 ora. </li><li> Rimuovere Perm / Blocca e incubare retine agitando delicatamente la notte a 4 ° C con 100 ml di anticorpi primari selezionati (vedi Tabella 1) e / o IsolectinB4, tutti preparati diluendo a Perm / blocchi. </li><li> Rimuovere anticorpo / isolectin e lavare retine 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTx). </li><li> In alcuni casi, per esempio seguente colorazione con IsolectinB4-Alexa488 o un anticorpo primario direttamente coniugato, non è richiesto un anticorpo secondario e retine può essere montato direttamente (fase 7). Quando un anticorpo primario non coniugato è stato utilizzato nel passaggio 3, poi 100 microlitri della appropriata FluorÈ aggiunto anticorpo secondario escent (diluito 1/200 in PBSTx) e lasciata incubare una notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere anticorpo secondario e lavare retine 4 x 15 min in 2 ml PBSTx. </li><li> Trasferire retine su vetrini utilizzando un ampio foro di plastica pipetta Pasteur e rimuovere l&#39;eccesso PBSTx con tessuto assorbente. Mount retine con l&#39;aggiunta di 50 ml di prolungare mezzo di montaggio su un vetrino e delicatamente posizione sopra la retina. </li><li> Trasferimento scivola al frigorifero per una notte a 4 ° C, assicurando che siano piatte e al riparo dalla luce, per consentire al Prolungare montante per impostare. </li><li> Retina immagine utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza. </li></ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li>
<li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li>
<li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li>
<li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+eye+enucleation+for+remote+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping.</a> J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+expression+of+TGFbeta+type+II+receptor+is+required+to+maintain+vascular+integrity+during+postnatal+development+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system.</a> PLoS One. 7 (9), e39336(2012).</li>
<li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+arteriovenous+malformations+in+the+absence+of+endoglin%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin.</a> Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li>
<li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li>
<li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li>
<li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il metodo qui presentato offre un modo semplice ed efficace per ottenere immagini colorate preparativi monte intero di retine neonatali del mouse, il che rende un modello facilmente quantificabile e fisiologicamente rilevanti di angiogenesi. Inizialmente, l&#39;occhio del mouse può essere molto difficile da sezionare grazie alle sue piccole dimensioni e la forma globo, quindi sono necessarie una certa pratica e di buoni strumenti di dissezione per risultati affidabili. Dissezione di occhi preparati in 2x concentrazione ...

L&#39;angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una &#39;punta&#39; cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali &#39;gambo&#39;. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una regione avascolare dove formano nuovi tubi vascolari. Al fine di stabilizzare questi tubi per sostenere il flusso di sangue, cellule endoteliali interagiscono con periciti e cellule muscolari lisce, che circondano i nuovi vasi sanguigni 1. Angiogenesi è essenziale per vascolarizzazione dell&#39;embrione e tessuti in crescita. Tuttavia, essa contribuisce anche a molti patologicodisturbi cal come il cancro; che difetti di angiogenesi sono associati a malattie ischemiche. Lo sviluppo di trattamenti farmacologici efficaci per regolare l&#39;angiogenesi come mezzo di trattamento malattia è quindi di grande interesse. Per esempio, efficaci fattori anti-angiogenici ridurranno la crescita del cancro, mentre strategie pro-angiogenici possono essere usati per trattare la malattia ischemica. Così, i modelli di angiogenesi sono essenziali per comprendere meglio la regolazione della formazione di nuovi vasi e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per migliorare o ridurre la crescita vascolare. Un elemento fondamentale della ricerca angiogenesi è la scelta di un modello appropriato vascolare. Molti modelli in vitro sono stati progettati per riprodurre i passi base dell&#39;angiogenesi come la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione e la sopravvivenza 2,3. Un frequentemente utilizzati saggio in vitro è la formazione di una rete ramificata di cellule endoteliali su una matrice in Matrigel, sebbene til suo non è specifico per le cellule endoteliali, né di solito incorporano il supporto di periciti o cellule muscolari lisce. Valutazione della ex vivo germinazione angiogenesi usando organo cultura mouse, ad esempio, il saggio corpo embrioide, il saggio anello aortico e il saggio metatarso fetale permette l&#39;analisi di angiogenesi delle cellule endoteliali nel contesto delle cellule di supporto aggiuntivi. Tuttavia, le limitazioni principali di questi saggi comprendono la mancanza di flusso di sangue e la regressione dei vasi nel tempo, dando una limitata finestra di analisi. Pertanto, per comprendere la regolazione dell&#39;angiogenesi, più precisamente, in modelli in vivo sono necessari come quelli sviluppati nel topo usando spugne impiantati sottocute o spine matrigel, così come il modello di ischemia dell&#39;arto posteriore. Tuttavia, questi modelli sono difficili da analizzare a causa della complessa architettura 3D del neovasi. In contrasto, l&#39;embrione zebrafish è dimostrato un modello eccellente per visualizzare angiogenesi in tuttamicrorganismo 4. Tuttavia, il topo è evolutivamente molto più strettamente correlato umano rispetto zebrafish, rendendo così il mouse un modello preferito in molti casi. Conseguentemente angiogenesi della retina topo postnatale rappresenta un metodo ben caratterizzato di scelta per la ricerca angiogenesi. Esso non solo fornisce un ambiente fisiologico, ma anche un 2D plesso vascolare che può essere facilmente visualizzato per mezzo di macchie fluorescenti appropriati. L&#39;architettura della rete nave, proliferazione endoteliale, crescita, reclutamento di cellule perivascolari e vaso rimodellamento possono tutti essere studiata utilizzando questa tecnica. Nella retina neonatale topo, lo sviluppo dei vasi retinici avviene nella prima settimana di vita postnatale. I topi, a differenza degli umani, nascono ciechi e le retine diventano solo vascolarizzato dopo la nascita. Vasi retinici nascono dal centro della retina vicino al nervo ottico al giorno postnatale 0 (P0), e si sviluppano da angiogenesi per formare un altamente organizzared plesso vascolare che raggiunge la periferia retinica di circa 5 P8. I vasi sanguigni si sviluppano in modo caratteristico con il plesso capillare gradualmente crescente verso l&#39;esterno del disco ottico verso la periferia per generare un normale modello di alternanza delle arterie e delle vene, con una rete capillare di intervenire. La vascolarizzazione della retina fornisce un modello ideale per studiare l&#39;angiogenesi come i vasi possono essere facilmente identificati come crescono in quello che è essenzialmente un piano 2D, rendendo così relativamente facile per esaminare la vascolarizzazione retinica nei preparati TV a montaggio 5. Un metodo per isolare il mouse retina neonatale per analisi delle risposte delle cellule endoteliali punta su diverse ore ex vivo è stato riportato 6. In alternativa, un esame più dettagliato di tutto il sistema vascolare della retina e marcatori vascolari associate richiede immunoistochimica di campioni di retina fisse a diversi stadi di sviluppo. Qui forniamouna descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per tutta la colorazione monte della retina murina plesso vascolare, dalla enucleazione iniziale dell&#39;occhio postnatale (vedere anche 7) attraverso i protocolli di colorazione per l&#39;imaging finale al microscopio.

<table><tr><tbody><td colspan="4">MaterialPipette</td></tr> <tr><td>in plastica Forniture</td> per <td>laboratorio scientifico</td><td>PIP4210</td><td>Rimuovere la punta con le forbici per creare un foro largo</td></tr><tr><td>Piastre BD Falcon a 24 pozzetti</td><td>Forniture per laboratorio scientifico</td><td>353226</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri selezionate TV Forniture per laboratorio scientifico da 90 mm</td><td></td><td>SLS2002</td><td></td></tr><tr><td>vetrini Histobond</td><td>VWR</td><td>631-0624</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzette #5</td><td>World precision instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla lunghe 10,5 cm, con lame diritte da 8 mm</td> World <td>precision</td><td>instruments 501235</td><td>Utilizzate per l'enucleazione</td></tr><tr><td>Forbici Vannas lunghe 8,5 cm, con lame diritte da 7 mm e punte superfini da 0,025 x 0,015 mm</td><td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>500086</td><td>Utilizzato per la dissezione della retina</td></tr><tr><td>Forbici vannas superfini lunghe 8 cm con lame diritte da 3 mm e punte superfini da 0,015 x 0,015 mm Strumenti di</td><td>precisione mondiali</td><td>501778</td><td>Utilizzato per la dissezione</td></tr> di <tr><td>provette cristalline per retina 2 ml</td><td>Starlab</td><td>E1420-2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasico</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>Reagente PBS</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Reagente PBS</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>Reagente PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Truccare in 2x PBS e conservare a -20 &#176; C</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7638</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Reagente anti-sbiadimento Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Reagente di montaggio</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td><td>Invitrogen</td><td>I21413</td><td>Utilizzare a Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Isolectina GS-IB4-alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td>Utilizzare a diluizione 1:200</td></tr><td colspan="4">Anticorpi primariAnti-NG2 (policlonale di coniglio)Millipore AB5320 Rileva i periciti Anti-GFAP (clone GA5, monoclonale di topo)Millipore MAB360 Rileva gli astrociti Anti-Desmin (clone Y66,<tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> coniglio monoclonale)</td><td>Millipore</td><td>04-585</td><td>Rileva i periciti</td></tr><tr><td>Anti-Collagene IV (coniglio policlonale)</td><td>Chemicon</td><td>AB756P</td><td>Rileva la membrana basale vascolare</td></tr><tr><td>Anti-alfa muscolo liscio actin-Cy3 (clone 1A4, topo monoclonale)</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Rileva le cellule muscolari lisce vascolari.</td></tr><tr><td>Anti-Endoglin (clone MJ7/18, ratto monoclonale)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550546</td><td>Rileva le cellule endoteliali</td></tr><tr><td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, ratto monoclonale)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553370</td><td>Rileva le cellule endoteliali</td></tr><tr><td>Anti-VE-Caderrina (clone 11D4.1, ratto monoclonale)</td><td>BD Pharmingen</td><td>550548</td><td>Rileva le giunzioni delle cellule endoteliali</td></tr><tr><td>Anti-Alk1 (capra policlonale)</td><td>R& D Systems</td><td>AF770</td><td>Rileva le cellule</td></tr><tr> endoteliali<td colspan="4">Anticorpi secondari</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Capra anti-ratto-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td>Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Capra anti-topo-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Asino anti-capra-Alexa594</td><td>Invitrogen</td><td>A11058</td><td>Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Microscopi</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam HRc</td><td>Fotocamera per microscopio da dissezione</td></tr><tr><td>Microscopio epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Axioimager con fotocamera Apotome</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fotocamera Zeiss</td><td>Axiocam HRm</td> per microscopio confocale <td>Axioimager</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td></td></tr></tbody></table>

tutta monte immunofluorescenza del mouse retina neonatale per indagare angiogenesi<em&gt; in vivo</em

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

L&#39;angiogenesi è il complesso processo di formazione di nuovi vasi definito dalla germinazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi pre-esistente. Angiogenesi gioca un ruolo chiave non solo nel normale sviluppo di organi e tessuti, ma anche in molte malattie in cui la formazione del vaso sanguigno è disregolato, come il cancro, cecità e malattie ischemiche. Nella vita adulta, i vasi sanguigni sono generalmente quiescente così angiogenesi è un obiettivo importante per il romanzo lo sviluppo di farmaci per cercare di regolare la formazione di nuovi vasi specificamente nella malattia. Per capire meglio l&#39;angiogenesi e di sviluppare strategie appropriate per regolarlo, i modelli sono richieste che rispecchiano fedelmente le varie fasi biologiche che sono coinvolti. Il mouse retina neonatale fornisce un eccellente modello di angiogenesi perché arterie, vene e capillari sviluppano a formare un plesso vascolare durante la prima settimana dopo la nascita. Questo modello ha anche il vantaggio di avere un due dibidimensionale (2D) Struttura rendendo semplice analisi rispetto alla complessa anatomia 3D di altre reti vascolari. Analizzando la retina plesso vascolare in tempi diversi dopo la nascita, è possibile osservare le varie fasi della angiogenesi al microscopio. Questo articolo illustra una procedura semplice per analizzare il sistema vascolare di una retina di topo mediante colorazione fluorescente con anticorpi specifici isolectin e vascolari.

Dopo la dissezione della retina dovrebbe apparire come un fiore piatto (Figura 1). Utilizzando il protocollo, di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando isolectin colorazione B4-Alexa488 e sostenendo cellule muscolari vascolari sono visualizzati tramite actina muscolo liscio anti-alfa (Figura 2). La vista a bassa potenza usando un obiettivo 5X in figura 2 consente una visione d&#39;insieme dell&#39;organizzazione vascolare della retina. Inoltr...

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell&#39;angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l&#39;angiogenesi in un<em&gt; In vivo</em&gt; Contesto. Immunofluorescenza per visualizzare con precisione il plesso vascolare è fondamentale per il successo di questo tipo di studi.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'angiogenesi nella retina del topo neonato. Questo viene ottenuto innanzitutto nucleando gli occhi postnatali, quindi applicando un fissativo; il terzo passaggio consiste nell'isolare con attenzione la retina postnatale a forma di petalo, e l'ultimo passaggio prevede la colorazione della vascolarizzazione retinica. In definitiva, la visualizzazione della vascolarizzazione retinica del topo viene ottenuta mediante colorazione fluorescente e microscopia confocale.La dimostrazione di questa procedura sarà effettuata dal dottor Simon Tlo, ricercatore post-dottorato nel mio laboratorio, e da Kathleen Allenson, ex membro del mio laboratorio. Durante tutta la procedura, la temperatura di default è quella ambiente. Iniziare posizionando un topo cucciolo ucciso in modo umano su un fianco con le forbici.Rimuovere la pelle che ricopre l'occhio. Successivamente, posizionare le forbici al di sotto dell'occhio, tagliare il nervo ottico e i tessuti circostanti ed estrarre l'occhio. Trasferire l'occhio enucleato in una piastra a 24 pozzetti contenente fissativo, costituito da PFA al 4% in due volte.Procedere con la dissezione dell'occhio success

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Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la preparazione e la colorazione con immunofluorescenza dei supporti piatti retinici dei topi e l'analisi. Anche l'uso della fluorangiografia del fondo oculare (FFA) per i cuccioli di topo e l'elaborazione delle immagini sono descritti in dettaglio.

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Questo articolo descrive un saggio di colorazione lectina ben consolidato e riproducibile per l'intero monte di preparati retinici e i protocolli necessari per la misurazione quantitativa di parametri vascolari frequentemente alterati nelle retinopatie proliferative e non proliferative.

Quantificazione dei parametri vascolari nelle retine a montaggio intero di topi con retinopatie non proliferative e proliferative

La vascolarizzazione retinica del topo è particolarmente interessante per comprendere i meccanismi di formazione del pattern vascolare. Questo protocollo misura automaticamente il diametro dei vasi retinici di topo da immagini del fondo oculare dell'angiografia fluorescente a una distanza fissa dal disco ottico.

Misurazione del diametro dei vasi retinici da immagini di angiografia fluorescente di topo

I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

Impara l'immunofluorescenza della retina neonatale del topo per studiare l'angiogenesi in vivo. Questo metodo consente di visualizzare il plesso vascolare retinico con microscopia confocale.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi

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