Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi In vivo
9 luglio 2013
La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in un In vivo Contesto. Immunofluorescenza per visualizzare con precisione il plesso vascolare è fondamentale per il successo di questo tipo di studi.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare l'angiogenesi nella retina neonatale del topo. Ciò si ottiene nucleando prima gli occhi postnatali e quindi applicando un fissativo del terzo passaggio consiste nel sezionare attentamente la retina murn postnatale a forma di petalo e il passaggio finale consiste nel colorare il sistema vascolare retinico. In definitiva, la visualizzazione della vascolarizzazione della retina di topo si ottiene attraverso la colorazione fluorescente e la microscopia confocale.
A dimostrare questa procedura saranno il Dr.Simon Tlo, un post-doc nel mio laboratorio, e Kathleen Allenson, un precedente membro del mio laboratorio. Durante questa procedura, la temperatura predefinita è la temperatura ambiente. Inizia posizionando un cucciolo di topo ucciso umanamente su un lato con le forbici.
Rimuovere la pelle che copre l'occhio. Successivamente, con le forbici posizionate sotto l'occhio, tagliare il nervo ottico e i tessuti circostanti e sollevare l'occhio. Trasferire l'occhio enucleato in una piastra a 24 pozzetti contenente fissativo, che è il 4% di PFA in due volte.
La PBS procede con la dissezione dell'occhio successivo mentre si è nel fissativo. Lo sfalsamento tra le due dissezioni oculari sarà di mezzo minuto. Con la pratica.
Lasciare che ogni occhio si fissi per 10-15 minuti. Quindi trasferirli a freddo due volte PBS su ghiaccio per almeno cinque-10 minuti. Prima di isolare le retine, raccogli nel PBS tutti gli occhi che desideri, usando una pipetta di plastica da pascolo che è stata tagliata per allargare il cinghiale.
Trasferire gli occhi in una capsula di Petri contenente due volte PBS al microscopio da dissezione. Rimuovere il grasso intorno all'occhio usando pinze e forbici. Forare il bordo della cornea con forbici affilate e tagliare intorno alla cornea e all'iride, scartare questi tessuti.
Quindi, inserisci la pinza tra la retina e la sclera. Rimuovere la sclera facendo attenzione a non strappare la retina. Anche lo strato di coroidi può essere rimosso purché non vi sia il rischio di danneggiare la retina.
Lasciare lo strato di coroidi in posa non dovrebbe influire in modo significativo sulla qualità dell'immunocolorazione. Ora usando il forcipe, rimuovi il cristallino e l'umor vitreo. Proseguire con la rimozione dei vasi aloidi.
Usa una pinza sottile per raccoglierli insieme al centro dell'occhio. Quindi allontanali rapidamente dal centro della retina. Fai molta attenzione a rimuovere tutto il cardo giallo perché se ne lasci un po', possono oscurare i tuoi risultati in piedi.
La retina a forma di coppa dovrebbe ora essere trasferita in una capsula di Petri pulita e risciacquata con PBS. Ora nella retina. Fai da quattro a cinque incisioni radiali che raggiungono circa due terzi del percorso verso il centro.
Usa le forbici a molla per creare questa retina a forma di pedale. Questo passaggio richiede pazienza e pratica per essere perfezionato. Ora prelevare la maggior parte del PBS usando una pipetta da pascolo.
Questo appiattirà la retina. Quindi rimuovere l'eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente. Quindi, applicare meno 20 gradi di metanolo goccia a goccia sulla superficie della retina fino a quando non è quasi sommersa, quindi aggiungere generosamente metanolo.
Le retine diventeranno bianche. Questo passaggio aiuta a fissare le retine e faciliterà la permeazione. Trasferisci le retine nel metanolo freddo in un piccolo tubo.
Utilizzando una pipetta di plastica a foro largo. Lasciali incubare nel metanolo freddo per almeno 20 minuti, se necessario, le retine possono rimanere nel metanolo a meno 20 gradi per diversi mesi. L'uso degli anticorpi è solo qui.
Il cine non può essere utilizzato con successo sulla retina fissa materna. In questo caso, la retina deve procedere direttamente all'immunocolorazione dopo averla appiattita a forma di petalo. Inizia pipettando con cura il metanolo dalle retine.
Quindi risciacquare le retine in modo rapido e delicato in una sola volta PBS. Rimuovere il PBS e coprire le retine con 100 microlitri di soluzione di blocco permanente con il 5% del siero appropriato. Imposta le retine in modo che si scuotano delicatamente per un'ora dopo.
Rimuovere la soluzione di blocco permanente con una pipetta e sostituirla con 100 microlitri di soluzione di blocco permanente contenente l'anticorpo primario o è selezionata prima. Quindi impostare le retine per incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con dondolo la mattina successiva. Lavare le retine quattro volte in PBS TX per 10 minuti per lavaggio.
Applicare un leggero dondolio durante tutte le fasi di lavaggio. Se l'anticorpo primario non è coniugato, aggiungere 100 microlitri dell'anticorpo secondario fluorescente appropriato, diluito da uno a 200 in PBS tx. Incubare le retine durante la notte a quattro gradi Celsius o per quattro ore a temperatura ambiente con una leggera agitazione per rimuovere l'anticorpo secondario.
Lavare le retine quattro volte in PBS TX con un leggero dondolio per 15 minuti per lavaggio. Ora procedi con il montaggio. Trasferire le retine sui vetrini utilizzando una pipetta di plastica a foro largo e rimuovere l'eccesso di P-B-S-T-X con un fazzoletto.
Quindi montare le retine in 50 microlitri di oro prolungato e coprire delicatamente la soluzione con un vetrino coprioggetti. Per consentire il prolungato derapamento dell'oro, refrigerare i vetrini durante la notte a quattro gradi Celsius, al riparo dalla luce il giorno successivo. Procedere con l'imaging delle retine dopo la dissezione.
La retina dovrebbe assomigliare a un fiore piatto utilizzando la selezione ISO B quattro Alexa 4 88. Le cellule endoteliali sono state colorate e appaiono di colore verde. Le cellule muscolari vascolari di supporto sono state visualizzate utilizzando il muscolo liscio Antifa, l'actina la vista a bassa potenza utilizzando un obiettivo cinque volte, ha permesso una panoramica dell'organizzazione vascolare della retina utilizzando una diversa combinazione di anticorpi.
Le cellule endoteliali possono essere osservate utilizzando l'immunocolorazione anti CD 31, supportando i parassiti quando visualizzate utilizzando un anticorpo contro NG due. In alternativa, i parassiti di supporto sono stati colorati con anti desmina. La colorazione anti desmina visualizza i processi simili a dita dei parassiti e aiuta a determinare se sono strettamente associati alle cellule endoteliali.
Al contrario, la colorazione anti NG two delinea i nuclei di ciascun parassita, il che è utile quando si quantifica il numero di cellule del parassita nel sistema vascolare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di evitare di toccare e danneggiare la superficie della retina con gli strumenti di dissezione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione BD per studiare la proliferazione di cellule specifiche.
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Panoramica
Questa procedura studia l'angiogenesi nella retina del topo neonatale, un modello ben caratterizzato per lo studio dello sviluppo vascolare. Implica una dissezione e colorazione attenta della vascolarizzazione retinica per visualizzare l'angiogenesi in vivo.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Angiogenesi
- Sviluppo Retinale
Sfondo
- La retina murina neonatale è un modello consolidato per gli studi sull'angiogenesi.
- Comprendere i ruoli dei geni e dei farmaci nell'angiogenesi è cruciale per lo sviluppo terapeutico.
- La colorazione immunofluorescente è essenziale per visualizzare il plesso vascolare.
- Questo modello consente indagini in vivo della modulazione vascolare.
Scopo dello Studio
- Indagare i meccanismi dell'angiogenesi nella retina del topo neonatale.
- Visualizzare la vascolarizzazione retinica utilizzando tecniche di colorazione fluorescente.
- Dimostrare la procedura per future applicazioni di ricerca.
Metodi Utilizzati
- Enucleazione degli occhi postnatali dai cuccioli di topo.
- Applicazione di un fissativo per preservare la struttura del tessuto.
- Dissezione della retina in forma di petalo per una colorazione ottimale.
- Utilizzo della microscopia confocale per la visualizzazione della vascolarizzazione colorata.
Risultati Principali
- Viabilizzazione con successo del plesso vascolare retinico.
- Dimostrazione del processo angiogeno in un ambiente controllato.
- Approfondimenti sulla modulazione dell'angiogenesi da vari fattori.
- Stabilire un metodo affidabile per futuri studi.
Conclusioni
- La retina del topo neonatale serve come modello efficace per la ricerca sull'angiogenesi.
- La colorazione fluorescente e la microscopia confocale sono vitali per visualizzare le strutture vascolari.
- Questa procedura può aiutare a comprendere le influenze genetiche e farmacologiche sull'angiogenesi.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
The neonatal mouse retina model enables mechanistic interrogation of angiogenic pathways critical for target validation in vascular disease research. Fluorescent staining of vascular structures provides quantitative, reproducible readouts that support preclinical de-risking of anti-angiogenic candidates. This approach bridges discovery biology with translational decision-making by visualizing vascular plexus formation in a disease-relevant, 2D-confined system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of angiogenic targets through direct visualization of endothelial and perivascular cell dynamics.
- Operational Value: Standardized whole-mount preparation supports consistent vascular plexus quantification across experimental conditions.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic or pharmacological modulation to vascular sprouting phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Fluorescent isolectin and antibody staining generates standardized, multiplexable readouts for vascular density and branching analysis.
- Quantitative Output: Confocal imaging enables morphometric quantification of vascular plexus parameters essential for hit validation.
- Scalability: Whole-mount format allows parallel processing of multiple retinas for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models pathological angiogenesis relevant to ischemic retinopathy and tumor vascularization.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit validation to preclinical efficacy testing in vascular modulation studies.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of vascular readouts with downstream functional outcomes such as perfusion or leakage.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing angiogenic phenotype data that informs target selection and lead optimization prior to in vivo efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic regulators through direct visualization of vascular network formation.
- Screening: Generates standardized, imaging-based vascular metrics for compound effect assessment in angiogenesis-focused assays.
- Analytics: Delivers quantitative vascular parameters (density, branch points, vessel area) that enable inter-group comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Connects mechanistic angiogenesis data to preclinical models of vascular disease through conserved molecular pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis-inducing or -suppressing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, visual evidence of vascular modulation.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissection, staining, and imaging protocols applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular phenotype data that predicts later-stage efficacy in angiogenesis-dependent models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of angiogenic targets based on functional vascular outcomes in a physiologically relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal tissue dissection and whole-mount preparation to preserve retinal integrity.
- Dependent on confocal microscopy and fluorescent imaging infrastructure for high-resolution vascular visualization.
- Necessitates standardization of staining protocols and antibody validation across users and sites.
- Adaptation to alternative models may require optimization of dissociation and staining conditions due to retinal-specific architecture.
- Practical limitations include tissue fragility during dissection and potential antibody penetration challenges in thicker preparations.
