Name: Parabiosis in topi: un protocollo dettagliato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-06T21:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Impara la tecnica di parabiosi nei topi per studiare il sistema circolatorio condiviso. Questo metodo chirurgico consente di analizzare il chimerismo ematico senza immunosoppressione.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare Adriane Mosley e Libuse Jerabek (Stanford) per l&#39;assistenza con la tecnica chirurgica.

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida di cura degli animali e l&#39;uso del comitato di UCLA e il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. La durata della procedura descritta di seguito è di circa 45-60 minuti dall&#39;inizio alla fine. 1. Preparazione del campo operatorio <ol><li> Eseguire la procedura in una sala operatoria degli animali pulita. </li><li> Equipaggiamento: isoflurano vaporizzatore, Gaymer Pompa T con il rilievo di riscaldamento. </li><li> Strumenti sterili: due pinze, forbici curve sottili, porta aghi. </li><li> Guanti sterili devono essere utilizzati durante l&#39;intera procedura. </li></ol> 2. Preparazione degli animali <ol><li> Inserire due topi maschi o femmine, di stesso background genetico, di peso e di dimensioni simili nella stessa gabbia e monitorare per almeno due settimane per garantire la convivenza armoniosa. Topi femmina sono preferiti a causa del loro comportamento meno aggressivo. </li><li> Anestetizzare gli animali dautilizzando un vaporizzatore isoflurano. Topi posto in una camera di induzione Posi-Seal collegati al vaporizzatore isoflurano (4-5% v / v). Una volta anestesia viene indotta, trasferire l&#39;animale alla zona rasatura pelo e mantenere l&#39;anestesia durante tutta la procedura attraverso un&#39;ogiva collegato a isoflurano (1,5-2% v / v). Applicare una pomata oftalmica con un Q-tip per prevenire gli occhi asciutti. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina. Radere accuratamente il lato sinistro del mouse posizionata a sinistra e destra del mouse posizionata a destra a partire da circa 1 cm sopra il gomito a 1 cm al di sotto del ginocchio. </li><li> Asetticamente preparare le zone rasate dal fondo strofinando (2-3x) con salviettine Betadine intriso seguito da cotone imbevuto di alcol. Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato coperto da un tampone sterile. </li><li> Per analgesia, amministrare Carprofene e buprenorfina per via intraperitoneale o sottocutanea alla dose di 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, rispettivamente. </li><li> Posizionare gli animali dalla loro parte, schiena contro schiena, con undjacent aree rasate rivolti verso l&#39;alto. Per evitare qualsiasi contaminazione dell&#39;area chirurgica, coprire i topi con un telino sterile esponendo solo la zona di operazione. Creare una piccola apertura telo di rimanere sterile quando si esegue l&#39;intervento chirurgico. Abbiamo fatto la finestra drappo grande per avere una visione migliore durante la videoregistrazione. </li></ol> 3. Parabiosis <ol><li> Utilizzando una forbice tagliente, effettuare incisioni cutanee longitudinali ai lati rasato di ogni avviamento animale a 0.5 cm sopra il gomito fino a 0,5 cm al di sotto del ginocchio (Figura 1). Seguendo l&#39;incisione, staccare delicatamente la pelle dalla fascia sottocutanea tenendo la pelle con un paio di pinze curve e separare la fascia con una seconda coppia di creare 0,5 cm pelle libera. Eseguire questa separazione lungo tutta l&#39;incisione. </li><li> Iniziare la giunzione collegando all&#39;olecrano fianco di un animale a destra olecranon dell&#39;altro. Entrambi olecranons e le articolazioni del ginocchio sono chiaramente distinguibili seguente the incisione cutanea. Per facilitare l&#39;unione, piegare il gomito del primo mouse e passare l&#39;ago della non assorbibile 3-0 sutura sotto all&#39;olecrano. Analogamente, piegare il gomito del secondo mouse e passare la stessa sutura sotto di essa. Fissare i giunti saldamente da un doppio nodo chirurgico. </li><li> Collegare le articolazioni del ginocchio seguendo la stessa procedura. </li><li> Seguendo il fissaggio delle articolazioni, collegare la pelle dei due animali con un continuo 5-0 assorbibile Vicryl sutura ventrale partendo dal gomito verso il ginocchio. Per evitare la rottura della pelle e la separazione eseguire una sutura stretta della pelle nella zona intorno ai gomiti e le ginocchia. Una volta che l&#39;allegato pelle ventrale è stata completata, eseguire un doppio nodo chirurgico. Posizionare il mouse in posizione prona e proseguire la dorsale sutura termina con un doppio nodo chirurgico. Verificare la continuità della sutura e confermare la mancanza di aperture. </li><li> Somministrare 0,5 ml di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea per ogni mouse per evitare deidrodration. </li></ol> 4. Recupero post-operatorio <ol><li> Tenere animali sul pad riscaldato fino al recupero. </li><li> Dopo il recupero, fornire analgesici carprofene e buprenorfina. Ripetere intraperitoneale o sottocutanea ogni hr 24 e 12, rispettivamente, per 48 ore alle stesse dosi descritte sopra (punto 2.5). Monitor animali per i segni di dolore e di angoscia, quali agitazione, letargia, masticazione di coda, inarcò la schiena, la mancanza di toelettatura, ecc giorno per due settimane. </li><li> Profilassi, trattare i topi con sulfametossazolo / trimetoprim sospensione orale nella loro bottiglia d&#39;acqua 2 mg sulfamidici / ml 0,4 mg / ml assetto per 10 giorni per prevenire le infezioni batteriche. </li><li> Casa ciascuna coppia parabiotic in una gabbia pulita con lettiera monolitico (ad es tovagliolo di carta o tampone sterile assorbente) per evitare l&#39;aspirazione di materiale di biancheria da letto. Ritorno agli animali di una gabbia piena di biancheria da letto quando sono in grado di mantenere decubito sternale con la loro testa. Per ridurre al minimo lo sforzodi raggiungere per il cibo durante la regolazione all&#39;esistenza parabiotic, posizionare le palline di cibo inumiditi sul pavimento della gabbia. Fornire materiale di nidificazione. In 1-2 settimane i topi parabiotic hanno la capacità di deambulare normalmente chirurgicamente coppie anteriori e posteriori degli arti. </li><li> Chimerismo sangue si verifica 10-14 giorni dopo l&#39;intervento. </li></ol> 5. Conferma e procedura inversa <ol><li> Dopo due settimane il sangue fluisce dalle vene coda di ciascun topo per analisi citofluorimetrica per confermare chimerismo sangue (Figura 3). </li><li> Trattamento del sangue per l&#39;analisi di citometria di flusso: diluire 2-3 gocce di sangue in 500 ml di EDTA 10 mM. Aggiungere 500 ml di 2% destrano (diluito in PBS), mescolare bene e incubare a 37 ° C per 30 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta, centrifugare a 1200 rpm per 5 min e risospendere le cellule pellet in PBS (tampone o altro) per analisi citofluorimetrica. </li><li> A seconda del disegno sperimentale, la coppia parabiotic può essere separato unt momenti successivi. Nella nostra esperienza, abbiamo mantenuto le coppie parabiosed fino a 9 mesi senza complicazioni. </li><li> Eseguire la procedura inversa su una superficie sterile chirurgica. Anestetizzare topi mettendoli in una camera di induzione collegato ad un vaporizzatore isoflurano (4-5%) e mantenere l&#39;anestesia con isoflurano 1,5-2%, come descritto sopra (passo 2.2). </li><li> Eliminare i peli dalla zona circostante la sutura iniziale e asettico preparare le zone rasate come descritto sopra (punti 2.3, 2.4). </li><li> Per analgesia, amministrare Carprofene e buprenorfina per via intraperitoneale o sottocutanea alla dose di 10 mg / kg e 0,1 mg / kg, rispettivamente. </li><li> Coprire area chirurgica con un telino sterile come sopra descritto (punto 2.6). </li><li> Usando forbici affilate, separare i topi attraverso un&#39;incisione longitudinale lungo la sutura laterale e staccare leggermente la fascia di nuova formazione tra i due topi con un paio di pinze curve. Per separare le articolazioni, tagliare i nodi di suturache li collega. Tagliare la pelle lungo l&#39;incisione per ottenere bordi lisci e riattaccare la pelle con una riassorbibile continuo 5-0 rivestita Vicryl sutura. </li><li> Per prevenire la disidratazione, somministrare 0,5 ml di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea per ogni mouse. Tenere animali sul pad riscaldato fino al recupero. </li><li> Dopo il recupero, ripetere la somministrazione di analgesici, carprofene (10 mg / kg) ogni 24 ore e buprenorfina (0,1 mg / kg) ogni 12 ore per 48 ore. </li><li> Per prevenire le infezioni batteriche trattano topi con sospensione orale sulfametossazolo / trimetoprim (2 mg sulfamidici / ml 0,4 mg assetto / ml) nel loro bottiglia d&#39;acqua per 10 giorni. </li></ol>

<ol><li>Bert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exp%C3%A9riences+et+consid%C3%A9rations+sur+la+greffe+animale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+l%27Anatomie+et+de+la+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Expériences et considérations sur la greffe animale.</a> Journal de l'Anatomie et de la Physiologie. 1, 69-87 Forthcoming.</li>
<li>Bunster, E., Meyer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methods+of+parabiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Improved methods of parabiosis.</a> Anat. Rec. 57, 339-380 (1933).</li>
<li>Waskow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+parabiotic+mice+for+the+study+of+DC+and+DC+precursor+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of parabiotic mice for the study of DC and DC precursor circulation.</a> Methods Mol. Biol. 595, 413-428 (2010).</li>
<li>Finerty, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parabiosis+in+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Parabiosis in physiological studies.</a> Physiol. Rev. 32, 277-302 (1952).</li>
<li>Aicher, A., Heeschen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonbone+marrow-derived+endothelial+progenitor+cells%3A+what+is+their+exact+location%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Nonbone marrow-derived endothelial progenitor cells: what is their exact location.</a> Circ. Res. 101, e102(2007).</li>
<li>Abe, S., Boyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+derived+from+the+circulation+contribute+to+the+repair+of+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Cells derived from the circulation contribute to the repair of lung injury.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170, 1158-1163 (2004).</li>
<li>Donskoy, E., Goldschneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytopoiesis+is+maintained+by+blood-borne+precursors+throughout+postnatal+life.+A+study+in+parabiotic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytopoiesis is maintained by blood-borne precursors throughout postnatal life. A study in parabiotic mice.</a> J. Immunol. 148, 1604-1612 (1992).</li>
<li>Powell, A. E., Anderson, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+between+Intestinal+epithelial+cells+and+macrophages+in+a+cancer+context+results+in+nuclear+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fusion between Intestinal epithelial cells and macrophages in a cancer context results in nuclear reprogramming.</a> Cancer Res. 71, 1497-1505 (2011).</li>
<li>Duyverman, A. M., Kohno, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+parabiosis+skin+transplantation+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A transient parabiosis skin transplantation model in mice.</a> Nat. Protoc. 7, 763-770 (2012).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+self-renewal+can+sustain+CNS+microglia+maintenance+and+function+throughout+adult+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life.</a> Nat. Neurosci. 10, 1538-1543 (2007).</li>
<li>Weissman, I. L., Jerabek, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+the+H-Y+antigen%3A+Requirement+for+male+T+cells%2C+but+not+B+cells%2C+to+induce+tolerance+in+neonatal+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tolerance and the H-Y antigen: Requirement for male T cells, but not B cells, to induce tolerance in neonatal female mice.</a> Transplantation. 37, 3-6 (1984).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Il metodo parabiosis discusso qui presenta difficoltà tecniche minime e si traduce in tassi di mortalità bassi. Il fissaggio delle articolazioni del ginocchio e del gomito è un miglioramento significativo della Bunster e tecnica Meyer. Tuttavia, la procedura rimane così invasiva mantenimento di condizioni di sterilità durante l&#39;intervento chirurgico è imperativo. Per prevenire ulteriori infezioni del sito chirurgico, è importante che gli animali parabiosed ricevono una combinazione di antibiotici e monitorare regola...

Parabiosis, la chirurgica unione di due organismi, è stato descritto nel 1864 da Paul Bert come un modo per sviluppare un modello per studiare sistemi circolatorio condivisi e consisteva l&#39;unione della pelle e pareti muscolari dei due topi 1. Parabiosis promuove la formazione del microcircolo nel sito di infiammazione 3 e ha avuto diverse applicazioni in studi fisiologici, come la comunicazione ormonale tra l&#39;ipofisi e gonadi nonché il ruolo del rene nell&#39;ipertensione 4. È stato inoltre impiegato per investigare l&#39;assunzione e integrazione di cellule progenitrici in neovascolarizzazione 5, migrazione di cellule staminali ematopoietiche 6, e linfociti tratta 7, così come il ruolo e cinetica di cellule infiammatorie circolanti o staminali nel tumore metastasi 8,9, e le malattie neurodegenerative 10. Un vantaggio significativo di bugie parabiosisdal fatto che gli animali collaborato condividono antigeni circolanti comuni, consentendo la migrazione cellulare e la neovascolarizzazione senza innescare una reazione immunologica. Importante, Weissman et al. Hanno dimostrato che parabiosis tra topi maschio e femmina non porta alla formazione di anticorpi contro HY 11. Nel protocollo originale descritto da Paul Bert due animali sono stati uniti insieme mediante collegamento della pelle e pareti muscolari 1. Questo metodo però, causato sforzo significativo per gli animali e provocato elevata mortalità a causa di infezione della ferita. Da allora la tecnica parabiosis è stato rivisto da diversi gruppi con il più predominante è il protocollo proposto da Bunster e Meyer nel 1933 2. Il loro metodo incluso giunzione delle articolazioni scapola, cavità del corpo, e la pelle, consentendo un migliore supporto e meno dolore per gli animali. Allo stesso tempo, il nuovo metodo ha comportato minima cura post-operatoria e significativamente ridotto la mortalità. Il protocollo qui descritto è una modifica della tecnica Bunster e Meyer che è meno invasiva e permette più salda adesione. Vale a dire, i topi sono collegati attraverso le articolazioni del gomito e ginocchio, come pure la pelle. Questo impedisce l&#39;allungamento adesione della pelle e quindi provoca meno dolore e complicazioni. Qui si descrive l&#39;unione di una wild type (WT) topo adulto per un GFP costitutiva esprime mouse. Abbiamo dimostrato che due settimane dopo l&#39;intervento si possono raggiungere il 50% di chimerismo sangue dimostrare l&#39;efficacia di questa procedura chirurgica per creare un sistema circolatorio condiviso.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano-Phoenix</td><td>Clipper</td><td>NDC 57319-559-06</td><td></td></tr> Camera <tr><td>di induzione Posi-Seal</td><td>Prodotti per imaging molecolare</td><td>AS-01-0530-SM</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia portatile</td><td>Prodotti per imaging molecolare</td><td>AS-01-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Gaymer T</td><td>Gaymar Industries, Inc</td><td>TP650</td><td></td></tr><tr><td>Coperta riscaldante (termoforo)</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Pinze curve</td><td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>FST 14063-09</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>FST</td><td>FST 12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio elettrico</td><td>Oster</td><td>Golden A5</td><td></td></tr></tbody></table>

parabiosis in topi: un protocollo dettagliato

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis è l&#39;unione chirurgica di due organismi che permettono la condivisione della circolazione sanguigna. Allegando la pelle di due animali promuove la formazione di microcircolo nel sito di infiammazione. Partner Parabiotic condividere i loro antigeni circolanti e quindi sono privi di reazione immunitaria avversa. In primo luogo descritto da Paul Bert nel 1864 1, l&#39;intervento parabiosis è stata affinata per Bunster e Meyer nel 1933 per migliorare la sopravvivenza degli animali 2. Nel protocollo corrente, due topi sono chirurgicamente uniti dopo una modifica della Bunster e tecnica Meyer. Gli animali sono collegati attraverso il gomito e del ginocchio seguita da attacco della pelle permettendo il supporto costante che impedisce sforzo sulla pelle suturata. Qui, descriviamo in dettaglio la parabiotic unione di un GFP onnipresente che esprime il mouse per una wild type (WT) del mouse. Due settimane dopo la procedura, la coppia viene separata e cellule positive GFP può essere rilevata mediante analisi citofluorimetrica nel cir sangueione del mouse WT. Il chimerismo sangue permette di esaminare il contributo delle cellule circolanti da un animale nell&#39;altro.

Il risultato atteso di parabiosis di due organismi è il pari contributo di sistema circolatorio di ogni animale ad una circolazione sanguigna comune (Figura 2). Si può facilmente verificare l&#39;equilibratura con successo il sangue del parabiosed WT e topi GFP positive con l&#39;analisi di citometria di flusso. Qui, il sangue venoso è stato ottenuto dalle code di entrambi parabionts a 2 settimane dopo l&#39;intervento chirurgico e stato frazionato per le cellule del sangue periferico (per escludere eri...

Parabiotic unione di due organismi porta allo sviluppo di un sistema circolatorio condiviso. In questo protocollo, si descrivono i passaggi chirurgici per formare una connessione parabiotic tra un topo wild-type e una costitutiva GFP che esprimono mouse.

Parabiosis in topi: un protocollo dettagliato

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire una congiunzione parabiotica di due topi per studiare un sistema circolatorio condiviso. Questo viene realizzato effettuando innanzitutto un'incisione sui lati adiacenti degli animali. Dopo aver separato la fascia, i due topi vengono saldamente connessi alle articolazioni del gomito e del ginocchio.L'ultimo passaggio consiste nel connettere la pelle dei due animali mediante una sutura continua. Alla fine, l'analisi citometrica del flusso può mostrare la chimera ematica entro 10-14 giorni dopo la procedura. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il trapianto di midollo osseo o l'iniezione di cellule, è che non richiede immunosoppressione e consente inoltre il mantenimento della circolazione CX per un lungo periodo di tempo.La procedura sarà dimostrata da punctu jaw. Il chirurgo animale del mio laboratorio, con almeno due settimane di anticipo, prepari diverse gabbie contenenti coppie di topi dello stesso sesso, preferibilmente femmine, con lo stesso patrimonio genetico e dimensioni e peso simili. Una volta selezionata una coppia armoniosa, esegua la parabiosi in una stanza chirurgica per animali pulita.Assicurarsi che tutti gli strumenti, i guanti e le superfici di contatto siano sterili. Anestetizzare i topi in una camera di induzione sigillata PAI collegata a un vaporizzatore di isoflurano. Una volta indotta l'anestesia, mantenerla per tutta la durata della procedura.Utilizzando un cono nasale, somministrare una concentrazione più bassa di isoflurano, quindi rasare il pelo addominale su lati opposti e applicare un unguento oftalmico. Successivamente, in modo asettico, preparare le aree rasate pulendole accuratamente con salviette imbevute di betadina seguite da salviette alcoliche.Successivamente, trasferire i topi su un tappetino riscaldato coperto da un tappetino sterile. Per l'analgesia, utilizzare carprofene e buprenorfina. Posizionare i topi su un fianco, schiena contro schiena, con le aree rasate rivolte verso l'alto.Quindi coprire i topi con un telo sterile, esponendo solo la zona operatoria. Utilizzando una forbice affilata, praticare incisioni longitudinali della cute ai lati di ciascun animale, iniziando mezzo centimetro al di sotto dell'articolazione del ginocchio e terminando mezzo centimetro sopra il gomito. Dopo l'incisione, staccare delicatamente la cute dalla fascia sottocutanea sollevando la pelle con una pinza curva e separando la fascia con una seconda pinza.Per creare mezzo centimetro di cute libera, le LEC e le articolazioni del ginocchio sono chiaramente distinguibili. Dopo l'incisione cutanea, iniziare a unire le LEC sinistra e destra. Prima piegare il gomito del primo topo e passare l'ago del filo 3.0 sotto Theon.In secondo luogo, flettere il gomito del secondo topo e passare lo stesso punto sotto di esso. Fissare le articolazioni saldamente con un nodo chirurgico doppio. Successivamente, collegare le articolazioni del ginocchio seguendo la stessa procedura.Dopo il collegamento delle articolazioni, unire la cute dei due animali con una sutura continua riassorbibile in Vicryl 5-0. Iniziare in posizione ventrale a partire dal gomito per prevenire la rottura e il distacco della cute.Eseguire chiusure con sutura stretta della cute nell'area intorno a gomiti e ginocchia. La connessione della cute tra i topi è una fase critica di questa procedura. È fondamentale assicurarsi che i topi siano saldamente uniti per evitare rotture e separazioni dopo l'intervento chirurgico.Pertanto, ogni quattro o cinque mesi, verifichiamo che la pelle sia saldamente unita. Una volta completato l'attaccamento della pelle ventrale, posizionare i topi in posizione prona e proseguire il punto in senso dorsale, terminando con un nodo chirurgico doppio. Verificare la continuità del punto e accertarsi che non presenti aperture.Terminare l'intervento chirurgico somministrando sottocute a ciascun animale mezzo millilitro di cloruro di sodio 0,9% per prevenire la disidratazione. Mantenere gli animali sulla piastra riscaldata fino al loro recupero. Allevare ogni coppia parabiotica in una gabbia pulita con pellet di cibo inumidito per ridurre al minimo lo sforzo di raggiungere il cibo durante l'adattamento all'esistenza parabiotica.Posizionare i pellet di cibo sul fondo della gabbia. Inoltre, assicurarsi di fornire materiale per il nido durante le prime 48 ore postoperatorie. Somministrare carprofene ogni 24 ore e buprenorfina ogni 12 ore per due settimane.Monitorare gli animali per segni di dolore e stress, come tremori, letargia, mordicchiamento della coda, schiena arcuata, mancanza di toelettatura e così via. Per prevenire infezioni batteriche nei primi 10 giorni dopo l'intervento, trattare i topi con una sospensione orale di sulfametossazolo e trimetoprim nel loro abbeveratoio. Il sangue cism si verificherà da 10 a 14 giorni dopo l'intervento chirurgico.Dopo due settimane, prelevare il sangue dalle vene della coda per confermare che ciò sia avvenuto. Analizzare il sangue mediante citometria a flusso. Diluire due o tre gocce in 500 microlitri di EDTA 10 millimolare.Quindi mescolare accuratamente il campione diluito con 500 microlitri di Dextrina al 2% in PBS. Incubare il campione ematico a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi centrifugare per raccogliere il soprannatante. Per uso pratico.Le coppie di probiotici possono essere mantenute insieme per nove mesi e separate senza alcuna complicazione. Eseguire la procedura inversa su una superficie chirurgica sterile. Utilizzare lo stesso protocollo anestetico precedentemente descritto e rimuovere i peli dalla zona circostante la sutura iniziale.Dopo aver preparato asetticamente la pelle rasata, somministrare gli analgesici e coprire l'area chirurgica con un campo sterile utilizzando forbici a punta. Separare i topi mediante un'incisione longitudinale lungo la sutura laterale per separare le articolazioni, recidere i nodi della sutura che li collegano in ciascun topo. Rimuovere la pelle lungo l'incisione per uniformarne i margini.Riattaccare quindi la pelle con un punto continuo assorbibile in Vicryl rivestito 5-0 per prevenire la disidratazione, somministrare mezzo millilitro di cloruro di sodio 0,9% per via sottocutanea, quindi mantenere gli animali su un tappetino riscaldato fino al risveglio dall'anestesia. Utilizzare gli stessi trattamenti postoperatori analgesici e antibatterici precedentemente descritti; l'esito previsto della parabiosi di due organismi è il contributo equo di ciascun sistema circolatorio animale a una circolazione sanguigna comune. L'equilibrazione del sangue proveniente da topi parabiotici di tipo selvaggio e positivi per GFP è stata analizzata mediante citometria a flusso, in accordo con studi precedenti.Il sangue del topo di tipo selvatico ha rivelato la presenza di chimero, indicata da circa metà delle cellule ematiche positive per GFP e metà di tipo selvatico. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 45-60 minuti se effettuata correttamente.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi per l'estrazione degli spermatozoi dai testicoli dei maschi e poi inseminazione topi femmina. Questa procedura è utile quando il tempo preciso è necessaria in studi sullo sviluppo e il lavoro transgenici.

Lo sperma raccolto e l&#39;inseminazione artificiale di topi

Questo protocollo fornisce istruzioni passo dopo passo su come generare embrioni di pesce zebra parabiotico di diversi background genetici. Se combinato con le impareggiabili capacità di imaging dell'embrione di zebrafish, questo metodo fornisce un mezzo straordinariamente potente per studiare le funzioni autonome delle cellule rispetto a quelle non autonome delle cellule per i geni candidati di interesse.

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

Questo protocollo descrive un modello murino di chirurgia ortopedica che è stato usato per lo studio dei meccanismi di neuroinflammation postoperatoria e cambiamenti comportamentali e quando combinato con Parabiosi, per studiare la rigenerazione dei tessuti durante l'invecchiamento.

Un modello murino di chirurgia ortopedica per studiare la disfunzione cognitiva postoperatoria e rigenerazione tissutale

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

Qui descriviamo un nuovo metodo per rilevare la creazione di successo della circolazione condivisa del sangue di due parabionts attraverso un'iniezione di vena caudale di glucosio, che provoca danni minimi e non è fatale per i parabionts.

Rilevare l'istituzione dell'afflusso di sangue condiviso nei topi parabiotici da Caudal Vein Glucose Injection

Questo articolo mira a dimostrare l'uso di cellule staminali embrionali aploidi aploidi partenogenetiche come sostituto dello sperma per la costruzione di embrioni semi-clonati.

Applicazione delle cellule staminali embrionali aploidi partinogenetiche del topo come sostituto dello sperma

Il metodo di manipolazione cervicale presentato può indurre pseudogravidanza nei topi senza la necessità di riproduttori di femmine con maschi vasectomizzati. L'induzione della pseudogravidanza è necessaria per il successo del trasferimento di embrioni non chirurgico e dell'inseminazione artificiale non chirurgica, entrambi presentati.

Indurre una pseudogravidanza in topi femmina senza la necessità di maschi vasectomizzati prima del trasferimento di embrioni non chirurgici o dell'inseminazione artificiale

Qui presentiamo un protocollo per far crescere specifici sottotipi di cellule ipotalamiche in coltura. Le cellule possono essere selezionate in base a marcatori di membrana opportuni/unici e utilizzate in molte applicazioni, tra cui immunofluorescenza, saggi elettrofisiologici e biochimici.

Isolamento di neuroni ipotalamici mirati per studi di regolazione ormonale, metabolica ed elettrica

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Impara la tecnica di parabiosi nei topi per studiare il sistema circolatorio condiviso. Questo metodo chirurgico consente di analizzare il chimerismo ematico senza immunosoppressione.

Parabiosis in topi: un protocollo dettagliato

Esplora altri video